赤红球菌产品在治疗复发性阿弗他溃疡中的用途
本公开要求2019年01月15日提交的中国专利申请《赤红球菌细胞壁骨架及其用途》(申请号201910036001.4)以及2019年10月25日提交的中国专利申请《一种分离的赤红球菌》(申请号201911022193.X)的优先权,它们的全部内容通过引用并入此处。
技术领域
本公开涉及医学领域、微生物领域、生物制药领域。具体而言,涉及赤红球菌及其细胞壁成分、制剂、药物组合物、制备方法、以及赤红球菌的细胞壁成分在制备药物/器械中的用途。
背景技术
赤红球菌(Rhodococcus ruber)(也称为红色红球菌),革兰氏阳性菌。通常而言,菌落呈桔黄色或呈桔红色,圆形;菌落大小约1mm至2mm;细胞形态为球状或短杆状;可形成初级分枝菌丝体;无鞭毛。赤红球菌好氧,化能异养。
目前,已有研究人员对赤红球菌进行了全基因侧学。例如,樊欣等人对赤红球菌SD3株的全基因组进行测序,并进行生物信息学分析。SD3株的全基因组长度大约为5.37Mb,GC含量约为70.63%,GenBank登录号为CP029146(樊欣,赤红球菌SD3全基因组测序及其热休克蛋白DnaK的表达分析,基因组学与应用生物学,2019年1月)。
红球菌属Rhodococcus,因其自身具有非常强的有机物耐受性,以及较宽的降解谱,能够适应多种生存环境。因此,红球菌属被广泛应用于污染修复、有机化合物降解、污水处理等领域。目前,赤红球菌的主要应用领域在于环境治理,参见CN108862590A、CN107151635A、CN102250796A、CN1519312A、CN103627653A、CN101033454A、CN108130288A、CN104830738A、CN101619299A、CN103509833A、CN106434466A、CN101580808A、CN102604875A、CN103160491A、CN106591168A、CN106591172A、CN105820982A。
CN109576180A中公开了一种从广州市番禺区附近郊野红土中筛选到的菌RDC-01,经16S rRNA基因序列分析和培养特性鉴定,该菌株鉴定为赤红球菌。将该菌灭活后,作为免疫佐剂添加入动物用的灭活疫苗中,发现可以促进动物生产抗体。
然而,赤红球菌在人类医学领域中的应用,尚未有报道。
复发性阿弗他溃疡(Recurrent aphthous ulcers)是口腔黏膜发生小而疼痛的溃疡,具有具有周期性、复发性及自限性等特点。复发性阿弗他溃疡大多发病于唇、颊、舌缘。
现代医学认为,在7至10天内溃疡会自行痊愈。问题在于,许多患者的病情往往会反复。复发性阿弗他溃疡的病因及致病机制仍不明确。诱因可能是局部创伤、精神紧张、食物、药物、激素水平的改变、及维生素或微量元素的缺乏。在复发性阿弗他溃疡的发生和发展中,系统性疾病、遗传、免疫及微生物可能起重要作用(Natah S等人Recurrent aphthousulcers today:a review of the growing knowledge.Int J Oral Max Surg,2004,33(3):221.;李源媛,中国实验方剂学杂志,Vol.17,No.11,2011)。
复发性阿弗他溃疡的诊断可以参照中华口腔医学会口腔粘膜病专业委员会制定的《复发性阿弗他溃疡诊疗指南》,复发性阿弗他溃疡主要包括:
1.轻型复发性阿弗他溃疡
病灶处敏感或出现针尖样大小或稍大的充血区;短期内形成直径在2至4mm左右的圆形或椭圆形,边界清晰的浅小溃疡。中心微凹陷,表面覆有一层淡黄色假膜;溃疡周围黏膜充血呈红晕状。溃疡数目一般为2至3个左右。溃疡形成后,有较剧烈的烧灼痛。7至10天左右溃疡可逐渐自愈,不留瘢痕。但经过长短不一的间歇期后,又可复发。
2.疱疹型复发性阿弗他溃疡
亦称口炎型口疮。除了溃疡面积小且数目多(可达20至30个)外,其余表型与轻型复发性阿弗他溃疡的表型相似。溃疡散在分布,分布广泛,黏膜充血明显。有剧烈疼痛,及伴有头痛、发热、或局部淋巴结肿大。
3.重型复发性阿弗他溃疡
亦称复发性坏死性黏膜腺周围炎或腺周口疮,为最严重的类型。溃疡常单个发生,罕见2个或2个以上者。多发于唇内侧、及口角区黏膜。初起时,溃疡与轻型复发性阿弗他溃疡相似,但其直径逐渐扩大至1至2cm,并向深层发展至黏膜腺。溃疡为紫红色或暗红色,边缘不规则,呈瓣状隆起,中央凹陷。底部不平、微硬、呈小结节状,溃疡周围红晕,局部有剧烈疼痛及可伴局部淋巴结肿大、发热等。病程常在数月以上。愈后遗留瘢痕,严重者可形成组织缺损。
目前常规的治疗方法有:
-局部治疗:
使用具有杀菌消炎作用的漱口剂或含片、在溃疡创面贴覆辅料或涂抹止痛剂等;另有局部烧灼法、局部封闭法或激光治疗法,主要目的是消炎、止痛,促进溃疡愈合。
-全身治疗:
根据中医药理论,全身治疗有一定疗效,但见效慢、复发治疗无效;或采用免疫抑制剂(如沙利度胺)(Muriel Hello等人Use of Thalidomide for Severe RecurrentAphthous Stomatitis:A Multicenter Cohort Analysis Medicine.Volume 89,2010,176-182)、泼尼松、地塞米松等,但副作用较大,起效较慢;或采用免疫调节剂进行治疗。由于病因和致病机制尚不清楚,全身治疗效果不够理想,愈后易复发。
鉴于此,本领域仍需要提供有效治疗复发性阿弗他溃疡的药物。
发明内容
根据本公开的一些实施方案,一方面,提供了一种分离的赤红球菌(Rhodococcusruber)。
根据本公开的一些具体的实施方案,提供了一种赤红球菌,其于2019年03月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所;邮政编码:100101),保藏编号为CGMCC No.17431。该保藏满足《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedure)》的规定。
根据本公开的一些实施方案,提供了赤红球菌及其衍生产品。所述衍生产品源自赤红球菌,包含赤红球菌的组成成分(如蛋白、核酸、脂质、细胞壁及其组成成分、碳水化合物、代谢物)。
在具体的实施方案中,提供了一种分离的赤红球菌细胞壁。
在具体的实施方案中,提供了一种分离的赤红球菌细胞壁,所述赤红球菌是指保藏号为CGMCC No.17431的株。
在具体的实施方案中,提供了一种分离的赤红球菌细胞壁骨架。
在具体的实施方案中,提供了一种分离的赤红球菌细胞壁骨架,所述赤红球菌是指保藏号为CGMCC No.17431的株。
根据本公开的一些实施方案,提供了药物组合物,其包含根据本公开的赤红球菌的细胞壁或赤红球菌的细胞壁骨架。
根据本公开的一些实施方案,提供了一种赤红球菌产品,其包含赤红球菌经粉碎后所得的产物。
根据本公开的另一些实施方案,提供了一种赤红球菌产品,其包含赤红球菌经粉碎并经过纯化(除脂、除核酸、除蛋白)所得的产物。
根据本公开的另一些实施方案,提供了一种赤红球菌产品,其包含赤红球菌的细胞壁。
根据本公开的另一些实施方案,提供了一种赤红球菌产品,其包含赤红球菌的细胞壁骨架。
根据本公开的一些实施方案,提供了一种药物组合物或医疗装置,其包含赤红球菌经粉碎后所得的产物。
根据本公开的另一些实施方案,提供了一种药物组合物或医疗装置,其包含赤红球菌经粉碎和经过纯化(除脂、和/或除核酸、和/或除蛋白质)后所得的产物。
根据本公开的另一些实施方案,提供了一种药物组合物或医疗装置,其包含赤红球菌的细胞壁。
根据本公开的另一些实施方案,提供了一种药物组合物或医疗装置,其包含赤红球菌的细胞壁骨架。
根据本公开的另一些实施方案,提供了一种药物组合物或医疗装置,其包含上述赤红球菌产品。
在具体的实施方案中,药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中,药物组合物中所述赤红球菌产品为1个重量份,药学上可接受的赋形剂为200至300个重量份(例如,200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300以及任意两个数值范围内的任意点值)。
在另一些实施方案中,药物组合物中赤红球菌细胞壁为1个重量份,所述药学上可接受的赋形剂为200至300个重量份(例如,200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300以及任意两个数值范围内的任意点值)。
在又一些实施方案中,药物组合物中赤红球菌细胞壁骨架为1个重量份,所述药学上可接受的赋形剂为200至300个重量份(例如,200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300以及任意两个数值范围内的任意点值)。
在一些实施方案中,药物组合物可以制备成液态的(液体制剂)。
在另一些实施方案中,药物组合物可以制备成固体的(干粉制剂或冻干粉制剂)。
技术人员理解,对于本公开的药物组合物而言,液体制剂和干粉制剂(或冻干粉制剂),二者可以相互转化,差别仅在于含水量。除去液体制剂中的绝大部分或全部水,得到干粉制剂(或冻干粉制剂)。干粉制剂(或冻干粉制剂)溶解(或复溶)后得到液体制剂。
在一些实施方案中,药物或药物组合物被制备成选自以下的剂型:膏剂、霜剂、乳液、混悬剂、糊剂、凝胶剂、洗剂、酊剂、油剂、片剂、气雾剂、喷雾剂、搽剂、粉剂;其中,所述膏剂选自:软膏剂、硬膏剂、乳膏剂。
在一些实施方案中,剂型是口含片。例如,采用冻干粉经过压片而制得。
在一些实施方案中,所述药学上可接受的赋形剂涉及但不限于:填充剂、稳定剂、矫味剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂。
在一些实施方案中,所述药学上可接受的赋形剂,例如但不限于:右旋糖酐、乳糖、微晶纤维素、海藻糖、甘氨酸、木糖醇、羧甲基纤维素钠、赤藓糖醇、明胶、硬脂酸镁、抛射剂、保湿剂、溶剂、增溶剂、乳化剂、抗氧化剂、pH调节剂、防腐剂。具体而言,非限制实例还包括:白凡士林、卡波姆、羟丙甲纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、壳聚糖、硫糖铝壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、玻璃酸钠、二甲醚、四氟乙烷、氢氟烷烃、甘油、丙二醇、去离子水、注射用水、蒸馏水、乙醇、十六醇、十八醇、对氨基苯甲酸、乙酰胺、异丙醇、吐温、聚氧乙基氢化蓖麻油、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三聚甘油单硬脂酸酯、脂肪酸蔗糖酯、蔗糖酯、乙酸异丁酸蔗糖糖酯、山梨醇酐三硬脂酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、胆固醇、角鲨烯、角鲨烷、正丁醇、乙二醇、乙醇、丙二醇、聚甘油酯、亚硫酸盐、半胱氨酸、二叔丁基羟基甲苯、山梨酸钾、磷酸缓冲溶液、三乙醇胺、氢氧化钠、乙二胺、月桂胺、碳酸氢钠、盐酸、尼泊金类、硫柳汞、氯甲酚、三氯叔丁醇、苯甲酸及其钠盐。
根据本公开的一些实施方案,提供一种赤红球菌产品的制备方法,其包括以下步骤或由以下步骤组成:
1)提供赤红球菌;
2)任选,培养所述赤红球菌;
3)任选,收集经培养的赤红球菌;
4)粉碎所述经培养的赤红球菌,得到粉碎产物;
5.1)任选,对所述的粉碎产物进行去除脂质的操作;
5.2)任选,对所述的粉碎产物进行去除核酸的操作;
5.3)任选,对所述的粉碎产物进行去除蛋白质的操作;
5.4)得到纯化产物;
6)任选地,除去所述纯化产物中的水,优选通过冷冻干燥除去所述纯化产物中的水;
7)任选地,进行分装;
8)收获所述的赤红球菌产品;
其中,步骤5.1)、5.2)、5.3)可互换顺序或可并行;步骤6)和步骤7)可互换顺序。
任选地,步骤5)中还可以包含(例如用非离子型表面活性剂)去除细胞膜的步骤。
赤红球菌的培养不限于具体的培养基和培养参数,技术人员可以采用公知的适当方式进行培养,可以根据制备规模采用培养皿、培养瓶、发酵罐。
对于赤红球菌的粉碎,其目的在于去除细胞内的物质,因此可以采用超声破碎、溶菌酶等技术。技术人员理解,任何适用于破碎革兰氏阳性菌的已知或未来方法,均适用于本公开技术方案。
技术人员有能力根据活性成分(细胞壁及其组成成分)的后续应用(例如口服、注射、外敷等),来调整培养、破碎、分离、收集、除杂质、分装的具体参数和设备,以免制备步骤中引入影响后续应用的因素。
在一些实施方案中,利用有机溶剂去除破碎产物中的脂质。在一些实施方案中,利用核酸酶去除破碎产物中的DNA和RNA。在一些实施方案中,利用水解酶降解破碎产物中的蛋白质。在一些实施方案中,利用表面活性剂去除破碎产物中的细胞膜。
在一些实施方案中,粉碎的平均粒度为10nm至1000nm;可以提及10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190nm±10nm,以及上述任意两个数值之间的范围。粒度的测试方法有很多(胡松青等人,现代颗粒粒度测量技术,现代化工,2002年22:1)。
在一些具体的实施方案中,粉碎的平均粒度为10nm至800nm。
在另一些具体的实施方案中,粉碎的平均粒度为10nm至500nm。
在一些实施方案中,所述分装是指分装至容器或置于固体支持物上。所述容器选自:瓶、管、包、袋、板、安瓿、注射装置、铝膜包装、敷料、胶囊。
例如,在具体的实施方案中,所述分装是指分装至瓶/安瓿中。临用前,向瓶/安瓿中添加溶剂。
根据本公开的一些实施方案,提供了一种赤红球菌产品,其是通过根据本公开的方法制备所得。
根据本公开的一些实施方案,提供了一种药物组合物或医疗装置,其包含根据本公开的方法制备所得的赤红球菌产品。
根据本公开的一些实施方案,提供了一种分离的赤红球菌细胞壁,其用于预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发。
根据本公开的一些实施方案,提供了一种赤红球菌产品,其用于预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发。
根据本公开的一些实施方案,提供了一种药物组合物或医疗装置,其用于预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发。
根据本公开的一些实施方案,提供根据本公开的赤红球菌细胞壁在预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发中的用途。
还提供了本公开的赤红球菌细胞壁在制备用于预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发的药物/医疗装置中的用途。
根据本公开的一些实施方案,提供根据本公开的赤红球菌产品在预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发中的用途;还提供了本公开的赤红球菌产品在制备用于预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发的药物/医疗装置中的用途。
根据本公开的一些实施方案,提供根据本公开的药物组合物在预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发中的用途;还提供了本公开的药物组合物在制备用于预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发的药物/医疗装置中的用途。
在一些实施方案中,复发性阿弗他溃疡选自以下的任一种或组合:轻型复发性阿弗他溃疡、疱疹型复发性阿弗他溃疡、重型复发性阿弗他溃疡。
根据本公开的一些实施方案,提供选自以下的任一项在制备药物(或医疗装置)中的用途:
-根据本公开的赤红球菌、
-根据本公开的分离的赤红球菌细胞壁、
-根据本公开的赤红球菌产品、
-根据本公开的药物组合物。
在一些具体的实施方案中,所述药物用于预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发。
在一些具体的实施方案中,所述医疗装置(如敷料、贴片、绷带、膜、贴片等)用于预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发。
根据本公开的一些实施方案,还提供了一种预防和/或治疗复发性阿弗他溃疡或其复发的方法,包括使受试者接触治疗有效量(或预防有效量)的选自以下的任一项:
-根据本公开的分离的赤红球菌细胞壁、
-根据本公开的的赤红球菌产品、
-根据本公开的药物组合物、
-根据本公开的医疗装置。
在一些具体的实施方案中,针对溃疡的面积和深度的不同,采用药物(或医疗装置)施用至病灶。例如,但不限于:
-用包含赤红球菌细胞壁骨架的药物涂抹;或者
-用浸有赤红球菌细胞壁骨架的贴片(或膜、纱布)覆盖在病灶处;或
-包含赤红球菌细胞壁骨架的冻干粉在溃疡面直接施用;或
-在溃疡面上施用包含赤红球菌细胞壁骨架的膏体/霜。
在一些具体的实施方案中,接触的周期为:持续2天至2个月或更长。具体而言,例如2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60天;再比如,可以提及1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周或更长。在具体的实施方案中,向受试者施用3-4周活性成分。
在一些实施方案中,按照以下频率进行施用:一天施用1至3次、两天施用1至6次、三天施用1至9次、一周施用1至14次、一月施用1至60次。在一些实施方案中,一天施用两次,或一天施用一次,或二天施用一次。
每次施用量视受试者具体情况的不同采用不同的剂量,通常为1μg至1000μg/单位剂量/每次施用;具体而言,例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200μg/单位剂量/每次、以及前述任意两个数值之间的范围。
在一些具体的实施方案中,接触是通过以下方式实现的,例如但不限于:口服、粘膜、经皮、透皮、腹腔、穿刺、喷鼻、滴眼、栓剂、舌下。
在一些具体的实施方案中,受试者是人以外的动物,例如用于农场动物、宠物、工作动物、观赏动物、生产动物。
在具体的实施方案中,受试者是人。
在一些具体的实施方案中,受试者疑似患有、确诊患有、已经患有、或易感于目标疾病或其症状。
在本申请的上下文中,药物或医疗装置中的唯一治疗性(或预防性)活性成分是源自赤红球菌的产品,尤其是包含赤红球菌组成成分(如蛋白、核酸、脂质、细胞壁及其组成成分、碳水化合物、代谢物)的产品,具体而言包含赤红球菌细胞壁(更优选赤红球菌细胞壁骨架或其组成)的产品。
附图说明
图1:赤红球菌的菌落形态。
图2:16S rRNA鉴定结果。
具体实施方式
“分离”是指本公开的赤红球菌脱离其原始生长环境。
技术人员知晓,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构不同。具体而言,革兰氏阳性菌的细胞壁较厚(通常20nm至80nm),含有约90%的肽聚糖和约10%的磷壁酸(一种由醇和磷酸分子形成的聚合物,通常以糖酯或氨基酸酯的形式存在)。肽聚糖层致密,甚至多达20层。然而,革兰氏阴性菌的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁要薄很多,结构较复杂,分为外膜(outer membrane)和肽聚糖层(通常2nm至3nm)。
肽聚糖层是细菌细胞壁中特有成分,是一种杂多糖的衍生物。每一个肽聚糖的单体包括3部分:糖单元(例如,至少两种糖分子通过糖苷键连接起来,构成肽聚糖的框架性结构)、肽尾(由若干氨基酸连接成的短肽链,其连接在N-乙酰胞壁酸分子上)、和肽桥(将相邻“肽尾”交联形成高强度的网状结构)。不同细菌的肽桥、肽尾、交联方式是不同的。
分离的赤红球菌细胞壁
在本公开中,“分离的赤红球菌细胞壁”既可以理解为完整的细胞壁,也可以理解为不完整的细胞壁(例如,破碎的、或部分降解的)。在本公开的教导下,技术人员将理解,显示出所需活性的成分来自赤红球菌的细胞壁(例如,是细胞壁本身或其组成)。因此,在临床应用中允许采用完整的细胞壁、经破碎的细胞壁、细胞壁的不完全降解产物、细胞壁的组成成分、细胞壁的提取物等各种形式,这些都包含在本公开范畴之内。
细胞壁骨架
构成细胞壁主体结构的组成成分;但不能理解为仅仅表示细胞壁当中的交联网状实体,技术人员理解不排除交联网状实体上所吸附、结合、携带的其他细胞壁成分。
赤红球菌
本公开实施方案中所用的赤红球菌是指红球菌属(Rhodococcus)的赤红球菌种(Rhodococcus ruber),不限于特定的细胞株。
非限制性示例包括TOY7株(南京农业大学农业环境微生物菌种保藏中心)、CGMCCNo.4795、DSM43338、CCTCC No.2012035、CGMCC No.16640、CGMCC No.17431。
赤红球菌的鉴定
根据已知的或未来的微生物鉴定技术,技术人员可以对一株细菌进行分类学鉴定,例如可用的鉴定技术包括形态学、生理生化特征、16S rRNA等。技术人员理解,随着科技的发展,鉴定技术涉及不同的手段,在较早的时期主要采用形态学和生化鉴定方式,但是这种方法的可靠程度不高。测序技术出现后,技术人员可以利用更为可信的方式鉴定菌株。例如,当16S rRNA的DNA序列被鉴定为具有97%(含)以上相似性时,判定两个菌属于相同的种(华苟根等人,红球菌属的分类及应用研究进展,微生物学通报,2003:30(4))。就赤红球菌而言,将保藏在国际(或国家级)菌种保藏单位中的已知菌株作为模式菌株,并与其进行比对。
剂型
本公开的药物或药物组合物或活性成分或产品,可以体现为但不限于以下形式:软膏剂、乳膏剂、硬膏剂、凝胶剂、洗剂、酊剂、搽剂、油剂、糊剂、冻干粉、气雾剂、栓剂、贴片、悬液、口服液、口含片、护肤品(洁面乳、化妆水、精华、乳液、面霜、面膜)。
制剂单元
本公开的药物或药物组合物或活性成分或产品,可以制备成单位制剂(单元制剂)的形式。
在一些实施方案中,所述药物(或制剂、或治疗剂、或医疗装置)中的单位剂量含有:
-1μg至1000μg所述的赤红球菌产品;或
-1μg至1000μg所述的赤红球菌细胞壁;或
-1μg至1000μg所述的赤红球菌细胞壁骨架。
单位剂量的具体示例是1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、65、66、67、68、69、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500mg±10%、以及上述任意两个数值之间的范围。
“施用”、“给予”、“提供给”、“处理”当应用于动物、人、细胞、组织、器官或生物样品时,是指药物或医疗装置与动物、人、细胞、组织、器官或生物样品接触。
“治疗”意指给予受试者内用或外用药物(治疗剂、活性成分或组合物)(如,根据本公开的赤红球菌细胞壁或其药物组合物)或医疗装置,在被治疗的受试者(或群体)中缓解(减轻、延迟、改善、治愈)一种或多种疾病症状,以至于达到临床可测量的程度,其中所述的受试者已经患有、疑似患有或易感于一种或多种疾病或其症状。
有效缓解任何疾病症状的药物(治疗剂、活性成分或组合物)的量称为治疗有效量。可根据多种因素变化,例如受试者的疾病状态、年龄和体重。应当理解,在缓解单个受试者的目标疾病或其症状时,药物(治疗剂、活性成分或组合物)可能无效,但是根据本领域已知的任何统计学检验方法(如Student T检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验)确定,药物(治疗剂、活性成分或组合物)在统计学意义上对目标疾病或其症状是有效的。
“任选”意味着其随后所描述的事项可以发生,但不必须发生;需要视情况而定。例如,“任选地,进行分装”意味着允许对产品进行分装,但是不是必须进行分装;分装与否不影响技术效果的实现。
“一个”、“一”、“单个”、“该”,如果没有明确说明,也包括复数形式。
以下结合实施例、制备例和测试例,进一步描述本公开。但这些实施例、制备例和测试例并非限制着本公开的范围。当未注明具体条件时,按照常规条件、按照原料供应商所建议的条件操作。未注明具体来源的试剂,为市场购买的常规试剂。
技术人员尤其理解,虽然以下具体示例采用了特定的细胞株,但是技术效果的实现不限于该特定的细胞株,任何属于红球菌属赤红球菌种的(Rhodococcus ruber)物种均适用。
实施例
实施例1.菌株保藏
发明人将实验室保存的主代菌株于2019年03月22日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.17431。经检测表明,所寄存的菌株存活。
实施例2.菌株鉴定
1.菌落形态特征的裸眼观测
在甘油琼脂培养基上,30-37℃(具体为32-35℃)培养12至72(具体为36至60,例如40-50)小时,可见(图1):
-菌落隆起;
-呈桔红色(受光线、培养基颜色等影响,则略有差别);
-表面干燥皱起、稍显光泽(随培养条件差别,则略有差别);
-轻触易碎;
-菌落大小约1mm至2mm(随培养条件差别,则略有差别)。
2.显微镜观察
-菌体呈分枝状,有横隔膜,形成菌丝体(随培养条件差别,则略有差别);
-菌丝分裂形成规则的短粗细胞(随培养条件差别,则略有差别);
-培养4至5天时,菌体成短杆状或球形(随培养条件差别,则略有差别)。
3.染色性
革兰氏染色阳性。
4.生化反应
取甘油琼脂斜面培养基上,30-37℃(具体为32-35℃)培养12至72(具体为36至60,例如40-50)小时培养。然后,对培养物进行以下各项测试。
4.1碳水化合物产酸:
呈阳性:甘油、甘露醇、山梨醇、D-阿拉伯糖醇、D-果糖、D-葡萄糖;
呈阴性:肌醇、菊糖、乳糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖、糖原、木糖醇、葡萄糖酸盐、海藻糖、赤藓醇、松三糖、蜜二糖、棉子糖、纤维二糖、苦杏仁甙、龙胆二糖、阿东醇、熊果甙、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、α-甲基-D-葡萄糖甙、α-甲基-D-甘露糖甙、D-核糖、D-木糖、L-木糖、N-乙酰-葡糖胺、D-松二糖、D-来苏糖、β-甲基-D-木糖甙、D-半乳糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-山梨糖、L-阿拉伯糖醇、L-鼠李糖、2-酮基-葡萄糖酸盐。
4.2酶活性测定(API ZYM):
呈阳性:碱性磷酸酶、类脂酯酶(C8)、类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-B1-磷酸水解酶、α-葡萄糖苷酶;
呈阴性:N-乙酰-葡萄糖胺酶、酯酶(C4)、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-岩藻糖苷酶。
4.3硝酸盐还原反应阳性、接触酶阳性、酪氨基酸酶阳性、淀粉酶阴性、氧化酶阴性、明胶液化阴性。
4.4唯一碳源:
Biolog Gen II 葡糖醛酰胺、β-羟基-DL丁酸、D-果糖-6-磷酸、
生长实验:α-D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、D-阿糖醇、D-山梨醇、奎宁酸、γ-氨基丁酸、柠檬酸、L-苹果酸、溴代丁二酸、吐温40、丙酸、乙酸呈阳性;
对二甲胺四环素、十四烷硫酸钠、利福霉素SV、pH5.0、8%氯化钠、林可霉素、夫西地酸、D-
Biolog Gen III 丝氨酸、万古霉素、四唑紫、四唑蓝敏感;
化学敏感实验 对溴酸钠、1%乳酸钠、pH6.0、1%-4%氯化钠、萘啶酸、氯化锂、亚碲酸钾、氨曲南、丁酸钠不敏感。
4.5. 16S rRNA鉴定
对工作种子管中分离的15株菌和原始种子管中分离的10株不同菌株,进行基因组提取、16Sr RNA扩增、并测序。总计25个菌株的16Sr RNA基因同一性为100%。这表示25个菌株为相同种属(图2)。
同时,基于Kimura2-参数算法构建的neighbor-joining菌株进化树,结果显示菌株归属为Rhodococcus ruber。
制备例
制备例1.培养方法
1.可以通过常规的微生物生产方法,培养赤红球菌。
2.培养方式既可为固体培养,也可为液体培养。
3.对培养基中的营养源并无特殊的规定,可使培养基中含有通常用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源。
-碳源可以是赤红球菌可以利用的任何碳源。例如,果糖、葡萄糖等。
-氮源可为:肉膏、蛋白胨、铵盐、硝酸盐以及其它有机或无机含氮化合物。
-其它营养源则可适当添加一些无机盐类。例如NaCl、磷酸盐类。
4.对培养条件(温度、时间等)并无严格的限制,技术人员可以根据初步的小规模的中试数据,自行选择使其产量最高的条件。
5.作为一个示例,采用以下培养条件发酵赤红球菌:
(1)培养基组成包含:
蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、磷酸盐、甘油(以及,任选琼脂,当固体培养时)。
(2)培养的方法参数:
工作菌种复苏后,转移至固体培养介质上维持3-5天,再转移至液体培养(30-37℃,维持3-5天),可以采用补料分批的半连续模式,也可以采用分批模式。培养期间监控pH、细菌密度、溶解氧、碳源消耗。
制备例2.菌体破碎
收集制备例1所得到的菌,对细胞进行粉碎(例如但不限于通过超声波破碎)。也允许采用本领域任何适当的公知方法对菌体进行破碎,例如CN101250490A或CN101323865A。
显微镜下检查粉碎的情况,每个视野有形菌不得超过5个,检查若干(10至30个)视野均达到此标准为合格。
制备例3.除去核酸、除去脂质、除去杂蛋白、除去细胞膜
1.除核酸:
将破碎上清液进行离心,获得的沉淀物中加入DNA酶和RNA酶,按照酶的供应商建议的操作去除核酸。
2.除蛋白质:
沉淀物加入常见的蛋白酶(例如胰蛋白酶),按照酶的供应商建议的操作去除蛋白质。
3.除脂质:
沉淀物中加入有机试剂(如但不限于丙酮、乙醚、乙醇中的一种或组合),按照本领域常规操作去除脂质。
4.除细胞膜:
沉淀物中加入TritonX-100,按照本领域常规操作,离心收集沉淀物,用PBS漂洗。
应当理解,上述除去杂质的步骤之间,技术人员可以调整先后顺序,使得步骤之间兼容。去除非细胞壁成分后,将沉淀物复溶于注射用水,待用。任选地,可以在115℃下灭菌20-30分钟,作为细胞壁骨架的原液(主要包含细胞壁骨架及其组成成分)。
5.产量
从159个克氏瓶中共收集菌液653ml(破碎后);湿重产量为138g;细胞壁骨架产量为约0.87g/克氏瓶。
制备例4.药物组合物(医疗装置)的制备方法
1.液体组合物
向制备例3所得产物中加入赋形剂(如右旋糖酐40、甘露醇或海藻糖)。灌装后,即为药物组合物。
表1.药物组合物可以配制成多种形式
2.干粉组合物
将第1项的药物组合物冻干,制得冻干粉(分别编号为组合物1至7)。
3.医疗装置
(1)将第1项的药物组合物(活性成分60μg至120μg,例如60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg)涂覆在敷料(例如无菌纱布)上,制备成外用医疗器械。
(2)采用本领域公知的方法,制备口腔贴膜(例如申请号CN201610605617.5、CN201510614414.8、CN200610200450.0、CN201610511974.5、CN201610471977.0等公开的方法),例如:将成膜材料聚乙烯醇、卡波姆、羟丙基纤维素加如水中,溶胀,形成均质粘稠液;向其中加入第1项的药物组合物,并混匀;静置消泡;将形成的无气泡的混合黏稠液;浇铸在涂抹少量石蜡的模具上,干燥5-20min,取出起膜,切割成所需面积。
4.质量检验(以冻干粉组合物1为例)
表2.质量检验项目
测试例
测试例1.药理试验
1.用相当于人类临床剂量的20、40、80倍静脉注射后,对麻醉猫的血压、呼吸、心率和心电进行监测,未产生明显影响;
2.用相当于人类临床剂量的1000倍静脉注射后,小鼠的协调运动和学习记忆功能未产生明显的影响。
可见本发明的药物组合物(组合物1至组合物7)对动物精神、神经系统、心血管系统、呼吸系统均无明显影响。
测试例2.安全试验
1.无菌试验:
结果阴性,证明无菌。
2.小鼠急性毒性试验:
实验组分别以皮下注射及腹腔注射方式给药,其剂量是人用量的5倍,对照组以无菌生理盐水0.5ml/支,连续观察7-8天。小鼠状态良好,体重无异常;小鼠各脏器无异常。
3.长期毒性试验:
应用临床剂量的30倍,每日一次,连续阴道给药三个月,未发现狗有毒性作用;心电图、血液生化指标在正常范围内。停药两周后,未见到延迟毒性(组合物1至组合物7)。
测试例3.稳定性试验
在常温(18-25℃)放置0、1、2、3、8、14、21个月,该药物组合物的丙氨酸含量、胞壁酸含量、吞噬率、吞噬指数与试验起始时相比,无统计学显著差异(测试三个批次)。
综上,冻干粉制剂的药物组合物可以稳定保存24个月(组合物1至组合物7)。
测试例4.吞噬试验
巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要细胞,吞噬细胞受抗原刺激后活化,可使吞噬功能明显增强。在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后,给小鼠腹腔注射鸡血红细胞,30min后处死小鼠取出腹腔液,染色,显微镜下计数吞噬红细胞的百分数,以判断吞噬细胞的杀伤能力,间接地测定机体的非特异性免疫水平。
利用本申请的组合物1进行测试,其吞噬率为75%,吞噬指数1.05。而阴性对照(赋形剂)和空白对照(生理盐水)的吞噬率和吞噬指数都较低。说明本申请的细胞壁骨架的促免疫吞噬能力强。
效果例.复发性阿弗他溃疡的治疗效果
表3.患者人口学统计信息
表4.第一次复诊
表5.第二次复诊
表6.第三次复诊
继续按相同频率施用1-2周,然后停药。停药后,随访2-3周,各受试者未见复发。
在对照患者组中(人口学统计信息与实验组无显著差异),按照同样的施用方案施用可药用载体,经随访未显示溃疡面的治疗益处(此处数据未显示)。