CN101323865B - 微生物油脂分离提取方法 - Google Patents

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Abstract

一种微生物油脂分离提取方法，包括如下步骤：(1)将微生物菌种接种发酵；(2)将所得发酵液经浓缩过程去除发酵液中45％-55％的水分得到浓缩发酵液；(3)将浓缩发酵液通入压力为70～130MPa的高压均质机中破碎细胞；(4)加入萃取溶剂，二次浸提，萃取分离收集上层有机溶剂相得混合油；(5)最后蒸发回收混合油中的溶剂得到微生物油脂。它是将发酵液浓缩结合高压均质技术进行细胞破碎，然后采用两次萃取收集所含油脂，并相应获得菌体蛋白。该过程改进了原有的需经过菌体分离、干燥、粉碎、造粒等步骤，大大简化了工艺，提高了效率，降低了生产成本。本发明将发酵液进行浓缩后再进行高压均质，提高了设备的利用效率，降低了能耗。

Description

微生物油脂分离提取方法
技术领域
本发明涉及一种生物工程下游过程中目标产物的分离工艺，特别是涉及到一种微生物油脂的提取方法。
背景技术
微生物油脂，是由某些微生物，如酵母菌，霉菌，藻类等在一定的条件下将过量的碳水化合物转化为甘油酯并贮存在菌体细胞内，有的干菌体含油量能高达60％以上。大部分微生物油脂的脂肪酸组成和常见的植物油脂如菜籽油、大豆油、棕榈油等相似，主要含有棕榈酸，硬脂酸，油酸和多不饱和脂肪酸等，可以在一定程度上弥补动植物油脂的不足，缓解油脂市场呈现出的供不应求的趋势，为油脂的来源开辟一条新道路。
微生物油脂存在于细胞内，属于胞内产物，只有采用适当的方法对微生物细胞进行初步破碎，才有利于油脂的提取，如专利02121302.X中采用球磨机破碎细胞，然后双水相萃取分离胞内目标产物。目前微生物油脂的制取工业上采用的方法主要是将湿菌体从发酵液中分离出来后进行干燥、研磨破碎，然后对菌体粉末造粒并选用合适的溶剂对油脂进行浸提，该法步骤复杂，能耗较大，从而使得油脂的生产成本加大。
如果对发酵液中菌体直接进行细胞破碎将有助于简化工艺流程，降低成本。用于微生物油脂细胞破碎的方法主要有酸热法，超声波破碎和冻融法。酸热法处理菌体主要是利用盐酸对细胞中的糖及蛋白质等成分的作用，疏松细胞的结构，再经过沸水、冷冻处理，使细胞达到破碎的效果，破碎细胞油脂得率较高，但会相应生成大量的酸性废水，污染较为严重；超声波法破碎细胞是利用超声波产生独特的机械振动作用，使细胞结构发生变化，促使细胞破碎。其油脂得率略低于酸热法，且在较长时间超声波作用下产生热量，使部分油脂进行了分解反应，不利于油脂的提取，目前普遍适用于实验室。冻融法是通过温度的突然变化，细胞在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎，以达到使细胞破碎的目的。在反复冻融过程中，由于耗时较长，部分酵母细胞产生了自溶使油脂含量减少，油脂得率较差。除上述方法之外，专利00116051.6还公开了一种从发酵液体中分离出菌体，进行干燥、蒸炒、压榨制取微生物油脂的方法，专利03139630.5中采用超临界二氧化碳技术直接从海藻细胞中萃取分离出微生物油脂，其周期短，产品品质较好。
鉴于上述问题，选择一种处理量大，效率高，且油脂得率理想的细胞破碎技术以便于油脂的提取是当前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于解决已有技术中生产过程复杂，能耗高，污染较大以及油脂得率低等问题，利用将发酵液浓缩结合高压均质技术进行细胞破碎，然后采用两次萃取收集所含油脂，并相应获得菌体蛋白。
本发明所提供一种微生物油脂分离提取方法，包括如下操作步骤：
(1)将微生物菌种接种发酵；
(2)将所得发酵液经浓缩过程去除发酵液中45％-55％的水份得到浓缩发酵液；
(3)然后将浓缩发酵液通入压力为70-130MPa的高压均质机中破碎细胞；
(4)加入萃取溶剂，二次浸提，萃取分离收集上层有机溶剂相得混合油；
(5)最后蒸发回收混合油中的溶剂得到微生物油脂。
本发明上述微生物油脂分离提取过程中，首先选择微生物菌种，经过一、二级种子培养过程后，接种于发酵罐的培养基中进行发酵；发酵结束后添加吸水剂5A型分子筛在搅拌下吸收去除发酵液中45％-55％的水分，提高了菌体的浓度，从而将设备的利用效率提高了一倍，通过静置可以将吸水后的分子筛与菌种分离，得到浓缩发酵液，同时避免了干燥等过程所需能耗；再将浓缩发酵液通入高压均质机中进行细胞破碎释放出胞内所含油脂，高压均质机工作压力为70-130MPa，浓缩发酵液流量为0.01m3/h，根据破碎情况确定处理次数，至少处理2次，保证80％以上的细胞破碎效率；高压均质技术是以高压往复泵为动力传递及物料输送机构，将物料输送至工作阀部分，待处理物料在通过工作阀的过程中，在高压下产生强烈的剪切、撞击和空穴作用，从而使物料得到超微细化。细胞破碎后，选择正己烷(也可选择其它溶剂，如轻汽油或石油醚等，其萃取温度选择低于溶剂沸点5-10℃)作为萃取溶剂，在单口烧瓶中按照1ml/g发酵液的比例加入正己烷溶剂，在55℃下磁力加热搅拌装置上浸出1h，结束后对萃取液进行离心分离，收集上层的有机溶剂相，并回收菌体在相同的条件下进行二次浸提，将两次所得上层溶液合并得混合油，相应获得菌体残渣，可作为蛋白饲料；最后将混合油通过蒸发回收其中的溶剂，最终得到目的产物——微生物油脂，同时回收的溶剂可重复利用。
本发明的有益效果体现在以下几个方面：
1、与现有的微生物油脂提取工艺相比，该方法无需对发酵液中菌体进行分离、干燥、粉碎及造粒，直接将发酵所得产物破碎后再进行溶剂浸提，油脂得率较高，操作简便，简化了工艺步骤，有助于工业生产中降低加工成本。
2、本发明将发酵液进行浓缩去水后再进行高压均质，使设备的利用效率提高了一倍，静置可将分子筛分离出来，避免了干燥等过程所需能耗，分子筛经晾晒可重复使用。
3、本发明除了适用于微生物油脂的提取外，其它非极性胞内产物也可以用该法破碎并进行分离，应用范围较广。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
以土生假丝酵母菌作为出发菌种，依次按照下列步骤进行操作：
A、首先在摇瓶中进行二级种子液的制备，然后将制备好的种子液接种于装有培养基的30L发酵罐中，发酵培养基成分为酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡萄糖70g/L，在pH5.6，30℃，通氧状况下以250r/min的搅拌速度培养7天，最终获得所需发酵液，其中生物量为100g/Kg发酵液，含0.475g油脂/g干菌体；
B、在发酵液中添加2.5Kg/Kg发酵液的5A型分子筛(天津市大茂化学试剂厂)，搅拌状态下去除发酵液中50％的水分以提高菌体的浓度，静置分离出分子筛，经晾晒后可重复使用；
C、起动高压均质机(NS3015H，意大利Niro Soavi公司)主电机，缓慢旋动二级调压手柄，使其最终均质压力为130Mpa，将1L混合均匀的浓缩发酵液以0.01m3/h的流量连续加入高压均质机中进行细胞破碎，并且循环处理3次；
D、选择正己烷作为萃取溶剂，将20g均质发酵液加入单口烧瓶中，按照1ml/g发酵液的比例加入溶剂，在55℃下磁力加热搅拌装置上浸出1h，结束后对其进行离心分离，收集上层的有机溶剂相，并回收菌体在相同的条件下进行二次浸提，将两次所得上层溶液合并得混合油；
E、在旋转蒸发仪(RE52CS-2，上海亚荣生化仪器厂)中回收混合油中的溶剂，得到油脂1.8g，油脂得率为94.7％。
实施例2
以土生假丝酵母菌作为出发菌种，依次按照下列步骤进行操作：
A、首先在摇瓶中进行二级种子液的制备，然后将制备好的种子液接种于装有培养基的30L发酵罐中，发酵培养基成分为酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡萄糖70g/L，在pH5.6，30℃，通氧状况下以250r/min的搅拌速度培养7天，最终获得所需发酵液，其中生物量为100g/Kg发酵液，含0.475g油脂/g干菌体；
B、在发酵液中添加2.5Kg/Kg发酵液的5A型分子筛，搅拌状态下吸收浓缩去除发酵液中50％的水分以提高菌体的浓度，静置分离出分子筛，经晾晒后可重复使用；
C、起动均质机主电机，缓慢旋动二级调压手柄，使其最终均质压力为130MPa，将1L混合均匀的浓缩发酵液以0.01m3/h的流量连续加入高压均质机中进行细胞破碎，并且循环处理2次；
D、选择正己烷作为萃取溶剂，将20g均质发酵液加入单口烧瓶中，按照1ml/g发酵液的比例加入溶剂，在55℃下磁力加热搅拌装置上浸出1h，结束后对其进行离心分离，收集上层的有机溶剂相，并回收菌体在相同的条件下进行二次浸提，将两次所得上层溶液合并得混合油；
E、在旋转蒸发仪中回收混合油中的溶剂，得到油脂1.7g，油脂得率为89.5％，比实施例1中130MPa、处理3次的效果相比，得率偏低。
实施例3
以土生假丝酵母菌作为出发菌种，依次按照下列步骤进行操作：
A、首先在摇瓶中进行二级种子液的制备，然后将制备好的种子液接种于装有培养基的30L发酵罐中，发酵培养基成分为酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡萄糖70g/L，在pH5.6，30℃，通氧状况下以250r/min的搅拌速度培养7天，最终获得所需发酵液，其中生物量为100g/Kg发酵液，含0.475g油脂/g干菌体；
B、在发酵液中添加2.5Kg/Kg发酵液的5A型分子筛，搅拌状态下吸收浓缩去除发酵液中50％的水分以提高菌体的浓度，静置分离出分子筛，经晾晒后可重复使用；
C、起动均质机主电机，缓慢旋动二级调压手柄，使其最终均质压力为80MPa，将1L混合均匀的浓缩发酵液以0.01m3/h的流量连续加入高压均质机中进行细胞破碎，并且循环处理3次；
D、选择正己烷作为萃取溶剂，将20g均质发酵液加入单口烧瓶中，按照1ml/g发酵液的比例加入溶剂，在55℃下磁力加热搅拌装置上浸出1h，结束后对其进行离心分离，收集上层的有机溶剂相，并回收菌体在相同的条件下进行二次浸提，将两次所得上层溶液合并得混合油；
E、在旋转蒸发仪中回收混合油中的溶剂，得到油脂1.52g，油脂得率为80.0％，与实施例1中130MPa的工作压力相比，效果相对较差。
实施例4
以土生假丝酵母菌作为出发菌种，依次按照下列步骤进行操作：
A、首先在摇瓶中进行二级种子液的制备，然后将制备好的种子液接种于装有培养基的30L发酵罐中，发酵培养基成分为酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡萄糖70g/L，在pH5.6，30℃，通氧状况下以250r/min的搅拌速度培养7天，最终获得所需发酵液，其中生物量为100g/Kg发酵液，含0.475g油脂/g干菌体；
B、在发酵液中添加2.5Kg/Kg发酵液的5A型分子筛，搅拌状态下吸收浓缩去除发酵液中50％的水分以提高菌体的浓度，静置分离出分子筛，经晾晒后可重复使用；
C、起动均质机主电机，缓慢旋动二级调压手柄，使其最终均质压力为80MPa，将1L混合均匀的浓缩发酵液以0.01m3/h的流量连续加入高压均质机中进行细胞破碎，并且循环处理2次；
D、选择正己烷作为萃取溶剂，将20g均质发酵液加入单口烧瓶中，按照1ml/g发酵液的比例加入溶剂，在55℃下磁力加热搅拌装置上浸出1h，结束后对其进行离心分离，收集上层的有机溶剂相，并回收菌体在相同的条件下进行二次浸提，将两次所得上层溶液合并得混合油；
E、在旋转蒸发仪中回收混合油中的溶剂，得到油脂1.4g，油脂得率为73.7％，与实施例3中处理3次相比，得率较低。
实施例5
以土生假丝酵母菌作为出发菌种，依次按照下列步骤进行操作：
A、首先在摇瓶中进行二级种子液的制备，然后将制备好的种子液接种于装有培养基的30L发酵罐中，发酵培养基成分为酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡萄糖70g/L，在pH5.6，30℃，通氧状况下以250r/min的搅拌速度培养7天，最终获得所需发酵液，其中生物量为100g/Kg发酵液，含0.475g油脂/g干菌体；
B、在发酵液中添加2.5Kg/Kg发酵液的5A型分子筛，搅拌状态下吸收浓缩去除发酵液中50％的水分以提高菌体的浓度，静置分离出分子筛，经晾晒后可重复使用；
C、起动均质机主电机，缓慢旋动二级调压手柄，使其最终均质压力为70Mpa，将1L混合均匀的浓缩发酵液以0.01m3/h的流量连续加入高压均质机中进行细胞破碎，并且循环处理3次；
D、选择正己烷作为萃取溶剂，将20g均质发酵液加入单口烧瓶中，按照1ml/g发酵液的比例加入溶剂，在55℃下磁力加热搅拌装置上浸出1h，结束后对其进行离心分离，收集上层的有机溶剂相，并回收菌体在相同的条件下进行二次浸提，将两次所得上层溶液合并得混合油；
E、在旋转蒸发仪中回收混合油中的溶剂，得到油脂1.33g，油脂得率为70.0％，与实施例3中80MPa工作压力相比，结果较差。
实施例6：
以黏红酵母作为出发菌种，依次按照下列步骤进行操作：
A、首先在摇瓶中进行二级种子液的制备，然后将制备好的种子液接种于装有培养基的30L发酵罐中，发酵培养基成分为酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡萄糖70g/L，在pH5.6，30℃，通氧状况下以250r/min的搅拌速度培养7天，最终获得所需发酵液，其中生物量为105g/Kg发酵液，含0.58g油脂/g干菌体；
B、在发酵液中添加2.5Kg/Kg发酵液的5A型分子筛，搅拌状态下吸收浓缩去除发酵液中50％的水分以提高菌体的浓度，静置分离出分子筛，经晾晒后可重复使用；
C、起动均质机主电机，缓慢旋动二级调压手柄，使其最终均质压力为130MPa，将1L混合均匀的浓缩发酵液以0.01m3/h的流量连续加入高压均质机中进行细胞破碎，并且循环处理3次；
D、选择正己烷作为萃取溶剂，将20g均质发酵液加入单口烧瓶中，按照1ml/g发酵液的比例加入溶剂，在55℃下磁力加热搅拌装置上浸出1h，结束后对其进行离心分离，收集上层的有机溶剂相，并回收菌体在相同的条件下进行二次浸提，将两次所得上层溶液合并得混合油；
E、在旋转蒸发仪中回收混合油中的溶剂，得到油脂2.3g，油脂得率为94.8％，与土生假丝酵母菌在同样条件下所得结果相比，效果几乎一样。

Claims (8)

1.一种微生物油脂分离提取方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将微生物菌种接种发酵；所述微生物菌种为土生假丝酵母或者黏红酵母；
(2)将所得发酵液经浓缩过程去除发酵液中45％-55％的水分得到浓缩发酵液；
(3)将浓缩发酵液通入压力为70-130MPa的高压均质机中破碎细胞；
(4)加入萃取溶剂，二次浸提，萃取分离收集上层有机溶剂相得混合油；所述萃取溶剂为正己烷按照1ml/g发酵液的比例加入，在55℃下磁力加热搅拌装置上浸出1h；
(5)最后蒸发回收混合油中的溶剂得到微生物油脂。
2.根据权利要求1所述的微生物油脂分离提取方法，其特征是所述去水浓缩过程是将吸水剂5A型分子筛置于发酵液中，浓缩去除发酵液中的水分，然后将吸水后的分子筛与菌体分离。
3.根据权利要求2所述的微生物油脂分离提取方法，其特征是所述发酵液添加吸水剂5A分子筛在搅拌状态下浓缩去除发酵液50％的水分。
4.根据权利要求1所述的微生物油脂分离提取方法，其特征是所述高压均质机工作压力为80MPa。
5.根据权利要求1所述的微生物油脂分离提取方法，其特征是所述高压均质机工作压力为130MPa。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的微生物油脂分离提取方法，其特征是所述浓缩发酵液以流量0.01m3/h通入高压均质机，至少处理2次。
7.根据权利要求1所述的微生物油脂分离提取方法，其特征是所述萃取溶剂的萃取温度选择低于溶剂沸点5-10℃。
8.根据权利要求1所述的微生物油脂分离提取方法，其特征是所述将微生物菌种接种发酵是指在摇瓶中进行二级种子液的制备，然后将制备好的种子液接种于装有培养基的30L发酵罐中，发酵培养基成分为酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡萄糖70g/L，在pH5.6，30℃，通氧状况下以250r/min的搅拌速度培养7天，最终获得所需发酵液。
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