CN101481711B - 微生物油脂及其短链醇脂肪酸酯提取方法 - Google Patents

Abstract

一种微生物油脂及其短链醇脂肪酸酯的提取方法，包括：调节水分：以得到包括含油脂微生物的含水量为20～90％的湿培养物；微波处理：对湿培养物进行微波辐射，使含水量降至5％～40％；短链醇处理：在碱性催化剂的作用下部分醇解微生物体内油脂，同时萃取油脂；回收溶剂：作固液分离，并经蒸发回收短链醇后得到微生物油脂与短链醇脂肪酸酯的混合物。本方法提取效率高，并能同时得到微生物油脂和短链醇脂肪酸酯。

Description

微生物油脂及其短链醇脂肪酸酯提取方法

技术领域

本发明涉及微生物油脂提取方法，具体的说是一种以微生物油脂为提取目标，同时可制备短链醇脂肪酸酯的方法。

背景技术

微生物油脂是指由真菌(包括酵母)、细菌或微藻等微生物在特定培养环境下在细胞内部合成并储存的脂质，其化学成分主要包括甘油三酯和磷脂。某些微生物能够在细胞内积累大量油脂，可达到细胞干重的20％以上，被称为产油微生物，是尚待深入开发的天然油脂资源。由于微生物油脂的生产不受地域，气候和季节影响，而且可采用廉价的工农业废弃物作为原料用于微生物发酵以生产天然油脂，因此有望成为动植物油脂的补充和替代来源。天然油脂是一种环境友好的可再生资源，在能源、精细化学品和新材料方面有着广泛的应用，然而目前绝大部分提供食用，剩余部分尚难以满足其它工业日益增长的需求。因此，开发微生物油脂意义重大。

微生物在特定培养环境下可在细胞内部积累微生物油脂，而能否对胞内油脂实施高效提取将对整个微生物油脂的生产成本和环境友好性产生重要影响。

目前，对于微生物油脂的提取主要存在两类方法：其一是干法提取，即将微生物菌体经脱水和干燥处理使之含水量低于10％，然后再利用有机溶剂进行淋洗和浸泡，以固-液萃取胞内油脂，再将萃取液蒸发脱去溶剂从而获得微生物油脂。如CN1304986公开了“一种微生物油脂的制备方法”，利用蒸炒和压榨处理菌体后以正己烷萃取微生物油脂；此外工业上利用6号溶剂(主成分为己烷)或4号溶剂(主成分为丁烷)对微生物菌体实施浸出操作；以及在实验中广泛采用的索氏抽提操作均属于干法提取。其二是湿法提取，即当菌体含水量在50％以上时就进行破胞处理，然后对破胞液以有机溶剂进行液-液萃取，待萃取相和萃余相分离后收集萃取相，蒸发脱去溶剂从而获得微生物油脂。如CN101323865公开“微生物油脂分离提取方法”中以高压均质破碎细胞，然后用有机溶剂萃取油脂；此外工业上以酶处理或超声波处理破胞，然后以己烷-乙醇混合溶剂萃取破胞液以提取油脂；以及实验中以酸热法处理破胞，然后以氯仿-甲醇混合溶剂萃取提油均属湿法提取。上述方法虽然各有长处，甚至部分已成功投入工业生产，但是存在诸多不足：(1)提取不彻底，如干法提取在工业上往往难以将菌渣残油率降低至1％以下，而湿法提取损失更大；(2)运行效率低，如工业上的湿法提取需要实施长时间的酶处理及多级平衡萃取，操作周期很长；(3)操作过程复杂，如湿法提取往往发生萃取乳化现象，难以分离萃取相和萃余相；采用混合溶剂又将导致溶剂回收困难；(4)过程安全性差，如干法提取往往采用易燃易爆的烃类溶剂，有时还需在高压下操作。据此可知，综合考虑设备投资和操作费用，现有的微生物油脂提取方法总体运行成本较高，对于大规模的微生物油脂提取而言不够经济。

发明内容

本发明的目的是针对现有微生物油脂提取方法的不足之处，提供一种高效、经济、安全的微生物油脂提取方法。

本发明的微生物油脂的提取方法，包括如下步骤：

(1)调节水分：产油微生物的发酵培养物经水分调节，制得湿培养物，所述湿培养物包括含油脂微生物，且所述湿培养物的含水量为20～90％；

(2)微波处理：对步骤(1)得到的湿培养物进行微波辐射，使处理后培养物的含水量降至5％～40％；

(3)短链醇处理：将所述微波处理后培养物与短链醇混合，并加热、搅拌，在碱性催化剂的作用下部分地醇解所述含油脂微生物体内的油脂，并同时萃取所述微生物体内的油脂，其中，所述短链醇为碳原子数为1～6的低级醇；

(4)回收溶剂，对步骤(3)得到的处理液作固液分离，所得液相经蒸发回收短链醇后得到微生物油脂与短链醇脂肪酸酯的混合物。

在本发明微生物油脂的提取方法的具体实施方式中，在(4)回收溶剂步骤之后还包括对所述微生物油脂与短链醇脂肪酸酯的混合物进行分离，以得到微生物油脂，同时得到短链醇脂肪酸酯。

本发明的另一方面，还提供一种制备短链醇脂肪酸酯的方法，其包括，按照本发明的微生物油脂的提取方法得到微生物油脂与短链醇脂肪酸酯的混合物，并对其进行分离，以制取短链醇脂肪酸酯。

本发明方法的优点是，(1)利用微波处理在短时间内加热菌体内部水分，并使之迅速气化，导致细胞膨胀破裂，从而迅速破坏细胞壁结构，为溶剂的渗透创造了有利条件。比酶处理破胞方法处理速度大幅提高，且没有酶的消耗费用；比超声波处理破胞方法能量利用效率更高，也不会导致乳化现象。(2)利用醇解反应将磷脂和甘油三酯部分转化为易溶于短链醇的短链醇脂肪酸酯，瓦解了细胞膜对溶剂的阻隔作用，并大大提高了短链醇溶剂的溶解能力。比已报道的烃类溶剂或混合溶剂萃取方法传质阻力小，溶剂溶解能力强，而且操作安全性高。(3)可获得由微生物油脂转化而来的短链醇脂肪酸酯，该产物作为原料在生产生物燃料、精细化学品以及新材料等方面比油脂更为经济便利。综上所述，本发明方法具有工艺简单、效率高、安全性好的特点。

具体实施方式

本发明所提方法的基本原理是，利用微波作用对极性分子(如水分子)的选择性，迅速加热细胞内的水分，使之在短时间内迅速气化膨胀并从胞内释放出来，从而破坏细胞壁结构；利用短链醇类溶剂对细胞膜磷脂层的溶解作用，破坏细胞膜和脂质内含体膜结构；利用短链醇与甘油三酯及磷脂的醇解反应，将难溶于短链醇的油脂转化为易溶于短链醇的短链醇脂肪酸酯，从而提高溶剂的溶解能力；利用短链醇溶剂的高渗透性和高溶解性，将微生物油脂及其衍生的短链醇脂肪酸酯从细胞中萃取出来。

本发明提供一种用于微生物油脂及其短链醇脂肪酸酯的提取方法，包括如下步骤：

(1)调节水分。

对经发酵得到的含油脂微生物培养物含水量的目的在于，保证供后续微波处理的微生物培养物中有适宜的水分含量，从而在微波处理时可获得足够的能量将菌体爆破。

对于产油酵母、细菌宜采用离心法收集菌体，而对于产油丝状真菌、微藻则宜采用过滤法收集菌体。通常，经水分调节制得的微生物培养物，即湿培养物的含水量为20～90％。

当所述产油微生物为丝状真菌且所述发酵为液态发酵时，所述水分调节优选采用过滤除水，以得到含水量50～70％的湿培养物。当所述产油微生物为酵母或细菌且所述发酵为液态发酵时，所述水分调节优选离心除水，以得到含水量为60～90％的所述湿培养物。上述液态发酵液经脱水得到的湿培养物基本上为湿的菌体。

当所述发酵为固态发酵，培养物中除菌体外还会含有大量的固体培养基，如麸皮等，因此含水量往往较低。其发酵培养物含水低于20％时，可用水浸泡发酵培养物，以得到含水量为30～70％的所述湿培养物，浸泡条件为，固液比1∶5到1∶20，温度4-30℃，时间：0.5-6h。优选的，浸泡固液比为1∶5，温度40℃，时间0.5h。

(2)微波处理。

对含油微生物作微波处理的目的在于迅速加热菌体内部的水分，并使之过热气化导致细胞破坏，因此采用大功率短时间处理比较有效；此外水分经气化脱除将有利于后续醇解过程的进行。然而处理功率过大或时间过长可导致微生物油脂氧化或聚合，将不利于微生物油脂的提取，因此微波处理的强度也不宜过大。

本步骤包括，将(1)中得到的湿培养物置于微波辐射装置中进行微波辐射，使处理后培养物的含水量降至5％～40％。

优选地，微波处理所采用的微波频率为2.45GHz、0.915GHz和0.896GHz中的一种，微波处理的功率在10W/g-2000W/g湿菌体之间，处理时间在15s到600s之间。

通常，对于丝状真菌发酵液的过滤除水，可得到含水量为55-65％的丝状真菌菌体。对此，较佳地，微波处理的微波频率可以是2.45GHz，且微波功率为500W/g湿菌体，辐射时间为120s。

(3)短链醇处理。

在微波处理后的湿培养物中加入短链醇，在加热搅拌的条件下，以碱性催化剂催化微生物油脂的醇解反应，可将微生物内的油脂部分地生成短链醇脂肪酸酯。

在醇处理中所用的短链醇可以是碳数为1～6的低级醇，优选地，可以是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇中的一种。所采用的碱性催化剂指氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠等均相催化剂(溶于短链醇)以及单独或复合碱金属氧化物等非均相催化剂(不溶于短链醇)中的一种。优选的，甲醇可用于该反应，而氢氧化钠可用作催化剂。

醇处理的实施条件可以是，微生物培养物与短链醇固液比为1∶1到1∶20(w/v)，催化剂用量为短链醇重量的0.01-5％(w/v)，反应温度20-100℃，反应时间20min到300min。优选的，固液比约1∶5(w/v)，催化剂用量为短链醇的1％(w/v)，反应温度约64℃，反应时间约120min。

除非有特别说明，本文所用的单位中，单独的％指重量百分比，％(w/v)指g/100ml，固液比中提及的w/v指固体重量(g)与液体(ml)之比。

在短链醇处理中，部分短链醇起到反应剂的作用，经醇解反应将微生物油脂部分转化为短链醇脂肪酸酯，而未反应的短链醇起到萃取剂的作用，将油脂和反应生成的短链醇脂肪酸酯萃取出来。在醇解反应过程中所生成的短链醇脂肪酸酯对于尚未转化的微生物油脂也具有良好的溶解力，因此在萃取过程中充当了助溶剂的作用，可以强化萃取效果。因此该过程并非只是一个化学反应过程，也不只是一个物理萃取过程，而是一个反应-萃取耦合过程。

(4)回收溶剂。

对上述处理液经离心或过滤与微生物培养物中的固体渣分离，得到短链醇、短链醇脂肪酸酯及油脂的混合物。经蒸发回收短链醇，蒸发残留物经水洗脱除蒸发残留物中的水溶性杂质，并干燥脱除残留水分，可得微生物油脂提取产物。此步骤得到的微生物油脂产物中还含有醇解反应中生成的短链醇脂肪酸酯。本发明提取方法得到的微生物油脂产品可以是微生物油脂与短链醇脂肪酸酯的混合物，但也可以通过下述的进一步纯化分离得到较纯的微生物油脂。

(5)分离油脂。

对上述微生物油脂与短链醇脂肪酸酯的混合物进行分离，在得到微生物油脂的同时得到短链醇脂肪酸酯。

关于分离方法，本领域技术人员可以根据油脂与短链醇酯之间沸点的不同，以蒸发的方法实施物理分离；或者通过醇解反应将上述微生物油脂与短链醇脂肪酸酯的混合物中的油脂全部转化为短链醇脂肪酸酯，从而以反应分离的方式获得短链醇脂肪酸酯产物。

前述短链醇处理条件对提取物即所得油脂与短链醇脂肪酸酯的含量比例有影响。当催化剂用量较大、反应温度较高且反应时间较长时，提取物中短链醇脂肪酸酯含量将增大，反之则油脂含量增大。可以根据实际产品要求，通过控制催化剂用量、反应时间以及反应温度调节油脂及短链醇脂肪酸酯的生成量。

以下通过实施例和对比例，对本发明作进一步说明。

分析方法

总脂质(包括油脂、磷脂和短链醇脂肪酸酯)含量可采用乙醚溶解法测定。具体可如下：准确称取5g提取物，以20mL乙醚萃取3轮，将不溶物加热至60℃脱除残留溶剂后称重，即获得乙醚不溶物含量，溶解部分为总脂质含量。

可采用气相色谱法测定提取产物中短链醇脂肪酸酯的含量。具体的分析方法为：准确称取0.1g提取产物，溶解于正己烷中，加入十三酸甲酯内标，并定溶至10mL。采用GC9800气相色谱仪分析，装备FFAP 25m×0.25mm×0.25μm石英毛细管色谱柱，FID检测，高纯氮气为载气。气化室温度200℃，柱温180℃，检测器温度220℃，进样量0.5μL，根据短链醇脂肪酸酯峰面积定量。

根据总脂质含量与短链醇脂肪酸酯含量之差可求出甘油三酯含量。

油脂分离方法例

可用如下方法分离油脂和短链醇脂肪酸酯：将所制得的混合物5mmHg残压下，加热至220-240℃，以蒸发短链醇脂肪酸酯，经冷凝后可获得短链醇脂肪酸酯产物；未蒸发成分为甘油三酯产物。

也可采用如下反应分离方法分离油脂和短链醇脂肪酸酯：在所制得的混合物中增补等体积的相应短链醇，加入0.1％的NaOH催化剂，在60℃下搅拌反应2h，可将混合物中的油脂转化为短链醇脂肪酸酯，再经回收溶剂和水洗干燥后制得脂肪酸短链醇产物。

实施例1：

真空抽滤收集液体培养基中的深黄被孢霉Mortierella isabellina CGMCC3.3410菌丝体，经分析该菌丝体含水量63％(质量百分比)，干菌含油量56％(质量百分比)。将该菌丝体置于微波炉中以频率为2.45GHz，强度为200W/g湿菌体的微波处理130s。然后，投入短链醇处理反应器中，加入含0.5mol/L KOH的甲醇溶液，使固液比达1∶5(w/v)，在64℃下搅拌反应180min，将反应液真空抽滤得到滤液。将抽滤所得菌渣加热至80℃以蒸发回收短链醇溶剂，并分析其残油量为0.3％(质量百分比)。将抽滤所获滤液置于50℃，60mmHg的残压下蒸发溶剂，所得未蒸发液相以15％(体积百分比)的清水洗涤3次至洗涤液pH＜7，剩余油相在95℃，60mmHg残压下真空干燥1h得微生物油脂及其甲酯衍生物的混合物，计算产物得率为99％。按上述分析方法测得该混合物中油脂与脂肪酸甲酯的重量比为1∶20。

对比例1：

真空抽滤收集液体培养基中的深黄被孢霉Mortierella isabellina CGMCC3.3410菌丝体，经分析该菌丝体含水量63％(质量百分比)，干菌含油量56％(质量百分比)。将该菌丝体置于真空干燥器中在70℃，10mmHg残压下真空干燥5h，使菌体含水量达8.6％(质量百分比)。置于萃取罐中以新鲜正己烷在45℃下浸泡萃取3h，固液比1∶5(w/v)，采用该条件萃取3轮，加压过滤分离溶剂相和固相(菌渣)，合并溶剂相并在120℃下蒸发回收正己烷溶剂，从而获得微生物油脂。所得菌渣于80℃下蒸发回收溶剂，并分析其残油量为2％(质量百分比)。该过程微生物油脂得率为91％。

对比例2：

真空抽滤收集液体培养基中的深黄被孢霉Mortierella isabellina CGMCC3.3410菌丝体，经分析该菌丝体含水量63％(质量百分比)，干菌含油量56％(质量百分比)。将该菌丝体置于微波炉中以频率为2.45GHz，强度为200W/g湿菌体的微波处理130s。置于萃取罐中以新鲜正己烷在45℃下浸泡萃取1h，固液比1∶5(w/v)，采用该条件萃取3轮，加压过滤分离溶剂相和固相(菌渣)，合并溶剂相并在120℃下蒸发回收正己烷溶剂，从而获得微生物油脂。所得菌渣于80℃下蒸发回收溶剂，并分析其残油量为1％(质量百分比)。该过程微生物油脂得率为95％。

以上实例说明，采用本发明所提供的微波破胞方法可有效降低溶剂萃取过程的传质阻力，从而提高萃取效率；此外采用醇解反应和固液萃取相结合的处理方式，可大幅提高微生物油脂的提取效率，减少微生物油脂的提取时间，并降低菌渣含油量，提高产物得率。

实施例2

8000g离心收集液体培养基中的油脂酵母Lipomyces starkeyi CGMCC 2.1608菌体，经分析该菌体含水量76％(质量百分比)，干菌含油量46％(质量百分比)。将该菌体置于微波炉中以频率为2.45GHz，强度为400W/g湿菌体的微波处理100s。然后，投入短链醇处理反应器中，加入含0.08％CH₃ONa的甲醇溶液，使固液比达1∶2(w/v)，在50℃下搅拌反应60min，将反应物离心分别得到上清液和残渣。将残渣加热至80℃以蒸发回收溶剂，并分析其残油量为0.1％(质量百分比)。将离心所得上清液液置于50℃，60mmHg的残压下蒸发溶剂，所得未蒸发液相以15％(体积百分比)的清水洗涤3次至洗涤液pH＜7，剩余油相在95℃，60mmHg残压下真空干燥1h得微生物油脂及其甲酯衍生物，计算产物得率达98％。按上述分析方法测得该混合物中油脂与脂肪酸甲酯的重量比为1∶2。

实施例3

10000g下离心收集液体培养基中的Mycobacterium sp.QJ3011(产油细菌)菌体，经分析该菌体含水量89％(质量百分比)，干菌含油量31％(质量百分比)。将该菌体置于微波炉中以频率为2.45GHz，强度为100W/g湿菌体的微波处理300s。然后，投入短链醇处理反应器中，加入含0.1mol/L NaOH的异丙醇溶液，使固液比达1∶2(w/v)，在80℃下搅拌反应90min，将反应物离心分别得到上清液和残渣。将残渣加热至120℃以蒸发回收溶剂，并分析其残油量为0.12％(质量百分比)。将离心所得上清液液置于80℃，60mmHg的残压下蒸发溶剂，所得未蒸发液相以15％(体积百分比)的清水洗涤3次至洗涤液pH＜7，剩余油相在95℃，60mmHg残压下真空干燥1h得微生物油脂及其异丙醇酯衍生物，计算产物得率达98％。按上述分析方法测得该混合物中油脂与脂肪酸甲酯的重量比为1∶6。

以上实施例1～3得到的混合物用油脂分离方法实施例中的方法分离，可以分别得到较纯的微生物油脂和相应的短链醇脂肪酸酯。

以上实施例表明，本发明所提供的方法可通用于多种产油微生物，采用不同的短链醇作为溶剂即可获得各类短链醇酯。为了达到良好的破胞效果，微波处理的时间和强度应根据菌体含水量及菌体种类实施调整。为了调整提取产物中微生物油脂和相应短链醇脂肪酸酯的比例，可通过调整反应温度，反应时间和催化剂浓度来实现。

Claims (8)

1.一种微生物油脂及其短链醇脂肪酸酯的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)调节水分：产油微生物的发酵培养物经水分调节，制得湿培养物，所述湿培养物包括含油脂微生物，且所述湿培养物的含水量为20～90％；

(2)微波处理：对步骤(1)得到的湿培养物进行微波辐射，所用微波的频率为2.45GHz、0.915GHz和0.896GHz中的一种，且微波辐射强度为100W/g～500W/g湿培养物，辐射时间为100s～300s，使处理后培养物的含水量降至5％～40％；

(3)短链醇处理：将所述微波处理后培养物与短链醇混合，并加热、搅拌，在碱性催化剂的作用下部分地醇解所述含油脂微生物体内的油脂，并同时萃取所述微生物体内的油脂，其中，所述短链醇为碳原子数为1～6的低级醇，所述碱性催化剂为选自氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠的溶于短链醇的均相催化剂，或选自碱金属氧化物的不溶于短链醇的非均相催化剂；

(4)回收溶剂：对步骤(3)得到的处理液作固液分离，所得液相经蒸发回收短链醇后得到微生物油脂与短链醇脂肪酸酯的混合物。

2.如权利要求1所述的提取方法，步骤(1)中所述湿培养物的含水量为30～90％。

3.如权利要求1所述的提取方法，步骤(1)中，当所述产油微生物为丝状真菌或微藻且所述发酵为液态发酵时，所述水分调节包括过滤除水，以得到含水量50～70％的所述湿培养物；当所述产油微生物为酵母或细菌且所述发酵为液态发酵时，所述水分调节包括离心除水，以得到含水量为60～90％的所述湿培养物；当所述发酵为固态发酵，且其发酵培养物含水低于20％时，所述水分调节包括用水浸泡发酵培养物，以得到含水量为30～70％的所述湿培养物。

4.如权利要求1所述的提取方法，步骤(1)得到的所述湿培养物为含水量为55-75％的丝状真菌菌体，步骤(2)所用微波的频率为2.45GHz，且微波辐射强度为500W/g湿培养物，辐射时间为120s。

5.如权利要求1所述的提取方法，步骤(3)中，所述微波处理后培养物与短链醇混合比为1∶1至1∶20(w/v)，碱性催化剂用量为短链醇的的0.01～5％(w/v)，反应温度20～100℃，反应时间20min～300min。

6.如权利要求1所述的提取方法，步骤(3)中所述的短链醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。 

7.如权利要求5所述的提取方法，其中所述微波处理后培养物与短链醇的混合比为1∶5(w/v)，碱性催化剂用量为短链醇的1％(w/v)，反应温度64℃，反应时间120min。

8.如权利要求1所述的提取方法，在步骤(4)之后还包括对所述微生物油脂与短链醇脂肪酸酯的混合物进行分离，以得到微生物油脂，同时得到短链醇脂肪酸酯。

9 .一种通过权利要求1～7中任一项所述的提取方法来制备短链醇脂肪酸酯的方法，其特征在于，对步骤(4)得到的所述微生物油脂与短链醇脂肪酸酯的混合物进行分离，以制取短链醇脂肪酸酯。