CN103589503B - 一种高效提取微生物油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效提取微生物油脂的方法。具体而言，本发明在混合油脂提取溶剂与微生物、破壁后添加水或低碳链醇水溶液，由此可简单、高效地提取油脂。

Description

一种高效提取微生物油脂的方法

技术领域

本发明属于微生物油脂提取领域，具体涉及提取微生物油脂的方法。

背景技术

通过培养收获的微生物细胞一般存在于水相体系中，颗粒细小，含油量高，具有坚韧的细胞壁。因此传统的植物油提油工艺不适用于微生物油脂的制备。一般微生物油脂的制备包括4个步骤：1.在发酵罐中利用适当培养基对微生物进行培养；2.收获微生物的生物质并加以处理（如洗涤/脱水或干燥）；3.细胞破壁，包括物理处理（蒸煮、蒸汽爆破）、化学（热碱、螯合剂）、机械（压榨、均质、研磨）等手段；4.从细胞碎片中提取微生物油脂（如溶剂萃取、直接离心分离）。

US 006166231A提出在水相环境下对微生物细胞进行破壁，然后进行液液萃取操作。该方法的缺点是：1.水相中的微生物油脂含量较低，萃取过程溶剂耗量大；2.含有细胞碎片的水相体系粘度很高，在与溶剂混合的过程中极易乳化，后续分离较为困难；3.水相和溶剂相传质效率较低，往往需要多次重复萃取以提高回收率。

CN 01806424.8提出了无溶剂提取微生物油脂的方法。在水相环境下对微生物细胞进行破壁，然采用多次水洗、离心的方法，提取微生物油脂。该方法的缺点是：1.水相体系的破碎细胞混合物粘度较高，极易乳化，直接进行离心分离较为困难；2.通过水洗可以降低混合物粘度，但是也容易夹带微生物油脂，油脂提取率偏低；3.多次水洗还会产生大量的工业污水。

US 20090156694A1提出了一种较为新颖的微生物油脂提取方法。将载体油与微生物干物质混合，一同经过机械破壁处理，再固液分离、过滤，得到含有微生物油脂的混合油脂。该方法的缺点较为明显，所获得的油脂为混合油脂，目标产物（如ARA、DHA）含量低。

Antonio Ramírez Fajardo等（Lipid extraction from the microalgaPhaeodactylum tricornutum，Eur.J.Lipid Sci.Technol.109(2007)120–126）公开了分别使用到高纯度乙醇（96%）、和水/正己烷两种溶剂体系进行两步提取的方法，经过连续四次正己烷/水醇溶液体系萃取，油脂回收率才能达到80%。另外，96％乙醇对油脂溶解性不强，需要长时间萃取；乙醇提取，单次提取率很低，所以粕还需要重复萃取。因此，该文献公开的方法油脂回收率低，需反复萃取，耗时长。

因此，本领域仍需一种能简单、高效地其它微生物油脂的方法。

发明内容

本发明人发现，在混合油脂提取溶剂（例如6#溶剂油、正己烷、石油醚、乙醚、丙酮等常规油脂提取溶剂）与微生物、破壁后添加水或低碳链醇水溶液可简单、高效地提取油脂，由此完成本发明。

因此，本发明的目的在于提供一种提取微生物油脂的方法，所述方法包括预分散、破壁、添加低碳链醇溶液、固液分离和混合油脱溶等步骤。

更具体而言，本发明提取微生物油脂的方法包括：

（1）将油脂提取溶剂与微生物细胞混合，获得混合物；

（2）对步骤（1）所获得的混合物实施破壁处理，获得破壁后的混合物料；和

（3）将水、低碳链醇水溶液、或水与无水低碳链醇添加到步骤（2）所获得的混合物料中；

从而对微生物油脂进行提取。

在一些优选的具体实施例中，该方法还可包括：

（4）对步骤（3）所得的混合物实施固液分离，获得含有微生物油脂和溶剂的混合油；优选的，所述固液分离通过离心分离或自然沉降分离；和

（5）脱除所述混合油中的溶剂，获得微生物油脂。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，用于提取油脂的溶剂包括但不限于6#溶剂油、正己烷、石油醚、乙醚、丙酮等常规油脂提取溶剂，优选正己烷。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，油脂提取溶剂与微生物细胞的混合比例是10:1～1:2（w/w），优选5:1～1:1（w/w）。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，步骤（3）中加入水和无水低碳链醇，加入顺序不限。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，步骤（3）中加入的水或低碳链醇水溶液的量是微生物细胞重量的0.1～10倍，优选1-5倍。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的低碳链醇选自含有1－6个碳原子的一元醇或多元醇，优选含有1－6个碳原子的一元醇或二元醇，更优选使用的低碳链醇为甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇和丁醇中的一种或多种。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量1～5倍的浓度为30％～50％的乙醇水溶液。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量1～3倍的浓度为30％～50％的异丙醇水溶液。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量1～3倍的浓度为50％～70％的甲醇水溶液。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，采用常规粉、液分散设备，如IKA CMS2000固、液混合设备，混合溶剂和微生物细胞。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，采用机械设备破壁。适用于本发明的机械设备包括但不限于砂磨机、高压均质机、高速剪切机、胶体磨等。可采用其中的一种或几种串联，处理上述混合物，破坏微生物细胞的细胞壁。优选采用砂磨机。根据物料情况，可选择循环操作，以提高破壁率和提油率。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，在步骤（1）之前还包括提供干燥的微生物细胞的步骤。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的微生物为产油脂的微藻，优选的，油脂为含有胆固醇，植物甾醇，链甾醇，生育三烯酚，生育酚，泛醌，类胡萝卜素，叶黄素，黄体素，番茄红素，虾青素，玉米黄质，角黄素和/或脂肪酸的油脂，优选的脂肪酸为亚油酸，ω-3和ω-6高不饱和脂肪酸，双高γ-亚麻酸和γ-亚麻酸或它们的混合物，优选含多不饱和脂肪酸的油脂，更优选为含二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，花生四烯酸，和十八碳四烯酸或它们的混合物的油脂。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的微生物选自：绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），普通小球藻（Chlorellavulgaris），椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea），Chlorella emersonii，Chlorellasorokiniana，Chlorella saccharophila，Chlorella regularis，微小小球藻（Chlorellaminutissima），Chlorella protothecoides，小球藻（Chlorella zofingiensis），绿藻门中的Brachiomonas submarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonasacidophila，雨生红球藻（Haematococcus pluvialis），湖泊红球藻（Haematococcuslacustris），斜生栅藻（Scenedesmus obliquus），Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，扁藻（Tetraselmis chuii），四肩突四鞭藻（Tetraselmistetrathele），Tetraselmis verrucosa，微芒藻（Micractinium pusillum）；硅藻门的筒柱藻（Cylindrotheca fusiformis），Nitzschia laevis，Nitzschia alba，Nitzschiafonticola，Navicula incerta，羽纹硅藻（Navicula pelliculosa）；蓝藻门的多变鱼腥藻（Anabaena variabilis）；金藻门的Poterioochromonas malhamensis；甲藻门的前环藻（Amphidinium carterae），寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）；裸藻门的Euglena gricilis；红藻门的单细胞红藻（Galdieria sulphuraria），以及它们的混合物。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的微生物为选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微生物、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微生物、被孢霉属（Mortierella）的微生物、Althornia属的微生物、Aplanochytrium属的微生物、Japonochytrium属的微生物、Labyrinthula属的微生物、Labyrinthuloides属的微生物、Crypthecodinium属的微生物，褐指藻属（Phaeodactylum）的微生物，微绿球藻属（Nanochloropsis）的微生物，裸藻属（Euglena）的微生物，四膜虫属（Tetrahymena）的微生物，螺旋藻属（Spirulina）的微生物，和吾肯氏壶藻属（Ulkenia）的微生物，隐甲藻属（甲藻）（Crypthecodinium(Dinofagellates））的微生物，以及它们的混合物，优选使用的微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属（甲藻）的微生物，以及它们的混合物。

在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的微生物为Schizochytrium sp.。

在采用采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的微生物为ATCC20888和/或SR21。

本发明通过添加水或低碳链醇水溶液，可显著提高微生物油脂的单次提取率。如表1所示，通过加入少量的乙醇水溶液，即可达到并超过普通萃取方法3次萃取后的总回收率。这将极大简化提取步骤，减少重复提取的能耗和设备投入。

表1：添加乙醇水溶液对单次萃取回收率的影响。

与US006166231A相比，本发明有以下几个优点：

萃取次数少。在固液分离前加入水或低碳链醇水溶液，使得本发明仅需一次萃取即可获得较高的油脂回收率。而US006166231A所述方法为液-液萃取，为了提高藻油回收率，萃取和固液分离步骤需要重复多次进行，能耗和设备投入都相应增加。

溶剂用量少。本发明的萃取方法为液-固萃取，破壁和萃取过程一起完成，传质（油脂向溶剂相转移）效率高，后续低碳链醇溶液的引入，又使得混合油和藻粕分离彻底，单次提取率高，溶剂用量少。US006166231A所述的萃取方法为液-液萃取，由于破碎细胞的存在使得混合体系粘度高、易乳化，传质效率低下，往往需要多次萃取，溶剂耗量大。见下表2。

表2：本发明方法和US006166231A的方法在溶剂耗量方面的比较。

*数值为固形物含量为35％，溶剂:发酵液=3:1，重复萃取3次时计算的结果。

与CN01806424.8相比，本发明的油脂回收率更高，具体见表3和4。

表3：CN01806424.8的实施例中给出的油脂回收率

表4：本发明的油脂回收率情况

由表3、4可以看出，CN01806424.8的油脂回收率在80％左右，而本发明的油脂回收率都在90％以上，本发明的油脂回收率明显高于CN01806424.8的油脂回收率。

具体实施方式

本发明的方法可用于从各种微生物中提取各种脂质，所述脂质含有胆固醇，植物甾醇，链甾醇，生育三烯酚，生育酚，泛醌，类胡萝卜素例如β-胡萝卜素，叶黄素，黄体素，番茄红素，虾青素，玉米黄质，角黄素和/或脂肪酸例如结合亚油酸，ω-3和ω-6高不饱和脂肪酸，例如二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，和花生四烯酸，十八碳四烯酸，双高γ-亚麻酸和γ-亚麻酸或它们的混合物，更优选的是，ω-3高不饱和脂肪酸，例如二十二碳六烯酸(DHA)，二十碳五烯酸(EPA)，和/或二十二碳五烯酸(DPA)(即ω-3形式的DPA)，尤其是含相对大量DHA的脂质，包含ω-6高不饱和脂肪酸例如花生四烯酸和二十二碳五烯酸(DPA)(即ω-6形式的DPA)的脂质。

适用于本发明方法提取微生物油脂的微生物包括本领域周知的各种产油微生物，包括但不限于各种藻类、细菌、真菌和原生生物，例如包括微藻类，如绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），普通小球藻（Chlorella vulgaris），椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea），Chlorella emersonii，Chlorella sorokiniana，Chlorella saccharophila，Chlorella regularis，微小小球藻（Chlorella minutissima），Chlorella protothecoides，小球藻（Chlorellazofingiensis），以及绿藻门中的Brachiomonas submarina，Chlamydobonasreinhardtii，Chlamydomonas acidophila，雨生红球藻（Haematococcus pluvialis），湖泊红球藻（Haematococcus lacustris），斜生栅藻（Scenedesmus obliquus），Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，扁藻（Tetraselmis chuii），四肩突四鞭藻（Tetraselmis tetrathele），Tetraselmis verrucosa，微芒藻（Micractiniumpusillum）；硅藻门的筒柱藻（Cylindrotheca fusiformis），Nitzschia laevis，Nitzschiaalba，Nitzschia fonticola，Navicula incerta，羽纹硅藻（Navicula pelliculosa）；蓝藻门的多变鱼腥藻（Anabaena variabilis）；金藻门的Poterioochromonasmalhamensis；甲藻门的前环藻（Amphidinium carterae），寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）；裸藻门的Euglena gricilis；和红藻门的单细胞红藻（Galdieria sulphuraria），以及它们的混合物。

适用于本发明方法提取微生物油脂的微生物还可以包括选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微生物、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微生物、被孢霉属（Mortierella）的微生物、Althornia属的微生物、Aplanochytrium属的微生物、Japonochytrium属的微生物、Labyrinthula属的微生物、Labyrinthuloides属的微生物、Crypthecodinium属的微生物，褐指藻属（Phaeodactylum）的微生物，微绿球藻属（Nanochloropsis）的微生物，裸藻属（Euglena）的微生物，四膜虫属（Tetrahymena）的微生物，螺旋藻属（Spirulina）的微生物，和吾肯氏壶藻属（Ulkenia）的微生物，隐甲藻属（甲藻）（Crypthecodinium（Dinofagellates））的微生物，以及它们的混合物。优选的，所述微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属（甲藻）的微生物，以及它们的混合物。更优选的，所述微生物为Schizochytrium sp.。更优选的，所述微生物为ATCC20888和/或SR21。

“藻油”指的是由微藻细胞产生的脂质组分，如胆固醇，植物甾醇，链甾醇，生育三烯酚，生育酚，泛醌，类胡萝卜素和叶黄素例如β-胡萝卜素，黄体素，番茄红素，虾青素，玉米黄质，角黄素，和脂肪酸例如结合亚油酸，ω-3和ω-6高不饱和脂肪酸，例如，二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，花生四烯酸，十八碳四烯酸，双高γ-亚麻酸和γ-亚麻酸中的一种或多种。

优选的是，微生物包含的脂质至少约为20％重量，更优选的是至少约30％，最优选的是至少约40％。更优选的是至少约20％的脂质是胆固醇，植物甾醇，链甾醇，生育三烯酚，生育酚，泛醌，类胡萝卜素和叶黄素例如β-胡萝卜素，黄体素，番茄红素，虾青素，玉米黄质，角黄素，和脂肪酸例如结合亚油酸，ω-3和ω-6高不饱和脂肪酸，例如，二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，花生四烯酸，十八碳四烯酸，双高γ-亚麻酸和γ-亚麻酸中的一种或多种，优选的是至少约30％，更优选的是至少约40％。

产油微生物细胞可以是干燥的细胞。例如，可通过喷雾干燥、流化床干燥、滚筒干燥等干燥方式干燥所述细胞。

在预分散步骤中，可将产油微生物细胞与合适的油脂提取溶剂混合，得到均匀的混合物。适用于本发明的油脂提取溶剂包括本领域各种已知的常规油脂提取溶剂，包括但不限于如6#溶剂油、正己烷、石油醚、乙醚、丙酮等。

通常，以1:10～2:1（w/w）的比例混合微生物细胞和溶剂。本领域技术人员可根据实际情况以适当比例混合微生物细胞和溶剂，例如1:8~1:1、1:5~1:1不等。

通过预分散，使得混合物分散均匀和具有一定的流动性。可采用常规粉、液分散设备，如IKA CMS2000固、液混合设备混合产油微生物细胞和溶剂。对混合时间并无特殊限制，只要混合得到分散均匀且具有一定流动性的混合物即可。混合物分散均匀和具有一定的流动性，有利于后续的破壁处理。混合可以在常温下进行。

可对所得的微生物细胞与溶剂的均匀混合物实施破壁处理。破壁可以是机械破壁，可采用以下机械设备进行破壁：砂磨机、高压均质机、高速剪切机、胶体磨等。可通过将其中的一种或几种串联，破坏微生物细胞的细胞壁。优选采用砂磨机。根据物料情况，可选择循环操作，以提高破壁率和提油率。

根据所选设备型号和物料性状不同，破壁处理的速度和时间不同。如破壁处理的速度在1千克混合物/小时到10吨混合物/小时的范围内，通常为10-100kg混合物/h，例如，为10-80kg混合物/h、20-60kg混合物/h不等。经破壁处理的混合物可再进行破壁处理，通常可如此循环2-10次。本领域技术人员可根据实际生产情况选择适当的速度和循环次数（或循环时间）。

破壁也可以采取其他方式，比如化学的、生物的处理方式等。具体参考CN01814301.6中的内容，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。为了不带入其他物质成分，优选机械破壁。

可向破壁后的混合物中，加入适量水、低碳链醇的水溶液或者加入水和无水低碳链醇。水或低碳链醇的水溶液的加入量通常为混合物中微生物细胞重量的0.1～10倍（例如1～8倍、1～5倍、1～3倍不等，本领域技术人员可根据实际情况加以选择）。

当加入水与无水低碳链醇时，水与无水低碳链醇的总加入量通常为混合物中微生物细胞重量的0.1～10倍，例如1～8倍、1～5倍、1～3倍不等。此种情况下，对水与无水低碳链醇的加入顺序并无特殊限制。在一具体实施例中，先加入水，然后再加入无水低碳链醇。通常，加入的低碳链醇的量应使得其占所加入的水与无水低碳链醇总量的20％～70％，优选30％～50％，即应相当于加入浓度的20％～70％低碳链醇水溶液。

优选加入低碳链醇的水溶液。在某些实施例中，与加入水的情况相比，加入低碳链醇的水溶液时自然沉降时混合油更易澄清。

适用于本发明的低碳链醇可以是例如含有1－6个、优选1－4个碳原子的一元醇或多元醇（包括二元醇），例如可以是甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇、丁醇中的一种或多种。低碳链醇水溶液的浓度通常为20％～70％，例如可以为20～50％，优选30％～50％。在一优选实施例中，加入占混合物中微生物细胞重量1～5倍（更优选在1～3.5倍）的乙醇水溶液（乙醇含量30～60％，优选30～50％，例如40％）。在其它优选实施例中，加入占混合物中微生物细胞重量1～3倍的异丙醇水溶液（异丙醇含量30％～50％）。在其它优选实施例中，加入占混合物中微生物细胞重量1～3倍的甲醇水溶液（甲醇含量50％～70％）。

加入水、低碳链醇的水溶液或水与低碳链醇之后，可通过振荡、搅拌、剪切等方法混合，使水或低碳链醇溶液在体系中分散均匀。当然，也可在加入的同时进行振荡、搅拌、剪切等操作。

分散均匀后，对所得混合液进行固液分离。可通过自然沉降或通过离心机进行固液分离。通常，加入低碳链醇的情况中，离心后可得到三层物质，上层为混合油（微生物油脂和溶剂混合物），中层位低碳链醇水溶液，下层为微生物细胞湿粕。根据低碳链醇溶液的添加量不同，也有可能得到两层混合物，上层为混合油（微生物油脂和溶剂混合物），下层为微生物细胞湿粕。通常，对离心的转速和时间并无特殊限制，本领域技术人员可根据实际情况加以选择，以将混合油相与其它相分离。

分离得到混合油相后，可通过薄膜蒸发器、汽提塔等设备进行溶剂脱除。如混合油经第一蒸发器（升膜式蒸发器），将混合油浓度提升至65％～70％，然后进入第二蒸发器（升膜式蒸发器），将混合油浓度提升至85～95％，之后混合油进入汽提塔，脱除残留溶剂，最终得到溶剂残留＜100ppm的微生物油脂。

下面将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明的范围。实施例中所使用到的材料、试剂等，除非另有说明，否则为市场上可购得的各种材料和试剂。

对照实施例

将628g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）与约3L正己烷混合，经过砂磨机处理后得到2638g破壁混合物。接着：

1．取该混合物28.92g，6000g、5min离心。分离出上清液，为混合油M1；

2．下层粕中再次加入30ml正己烷，充分摇匀后，6000g、5min离心，分离出上清液，为混合油M2；

3．下层粕中再次加入30ml正己烷，充分摇匀后，6000g、5min离心，分离出上清液，为混合油M3；

4．将混合油M1，M2，M3分别脱溶后，60℃烘箱中烘至衡重，得到毛藻油。

藻油回收率如表5所示：

表5、藻油回收率

实施例1：加入水对油脂回收率的影响

将628g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）与约3L正己烷混合，经过砂磨机处理后得到2638g破壁混合物。

1．称取4份破壁混合物，每份约20g；

2．分别加入不同比例的水并充分摇匀；

3．6000g、5min离心，分离出上清液，为混合油；

4．将混合油分别脱溶，并于60℃烘箱中衡重，得到毛藻油。

计算藻油回收率，结果如表6所示。

表6、藻油回收率

实施例2：加入乙醇水溶液对油脂回收率的影响

将628g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）与约3L正己烷混合，经过砂磨机处理后得到2638g破壁混合物。

1．称取4份破壁混合物，每份约20g；

2．分别加入不同比例的乙醇水溶液（加入的水量和乙醇量如表7所示）并充分摇匀；

3．6000g、5min离心，分离出上清液，为混合油；

4．将混合油分别脱溶，并于60℃烘箱中衡重，得到毛藻油。

计算藻油回收率，结果如表7所示。

表7、藻油回收率

实施例3：乙醇溶液浓度对油脂回收率的影响

将628g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）与约3L正己烷混合，经过砂磨机处理后得到2638g破壁混合物。

1．分别称取10份破壁混合物，每份约20g；

2．分别加入不同溶度的乙醇水溶液，并充分摇匀，其中乙醇水溶液的添加量为破壁混合物中藻细胞重量的2倍；

3．2000g，1min离心，分离出上清液，为混合油；

4．将混合油分别脱溶，并于60℃烘箱中衡重，得到毛藻油。

计算藻油回收率，结果如表8所示：

表8、不同浓度的乙醇对藻油回收的影响的比较

对上述结果进行进一步分析，发明人发现，乙醇溶液的浓度对藻油回收率影响显著，其中乙醇浓度在20％～60％时，油脂回收率较高；随着乙醇浓度的进一步增大，乙醇溶液和正己烷互溶性增加，混合油（上层液）回收量降低，油脂回收率降低，但其油脂回收率依然明显高于不加入乙醇溶液的油脂回收率。

实施例4：乙醇溶液添加量对油脂回收率的影响

将628g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）与3L正己烷混合，经过砂磨机处理后得到2638g破壁混合物，其中混合物中藻粉浓度为25.35％。

1．分别称取10份破壁混合物，每份约20g；

2．分别加入40％（质量浓度）的乙醇水溶液，并充分摇匀，其中乙醇水溶液的添加量依次增加，分别为混合物中的藻粉质量的0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2倍；

3．2000g，1min离心，分离出上清液，为混合油；

4．将混合油分别脱溶，并于60℃烘箱中衡重，得到毛藻油。

计算藻油回收率，结果如表9所示：

表9、不同乙醇加入量对藻油回收的影响的比较

对上述结果进行进一步分析，发明人发现，当加入的乙醇溶液添加量超过6.06g，离心后会形成3相，且随着乙醇溶液添加量的进一步增加，油脂回收率呈下降趋势，但油脂回收率依然明显高于不加入乙醇溶液的油脂回收率。

实施例5：异丙醇浓度对油脂回收率的影响

将628g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）与约3L正己烷混合，经过砂磨机处理后得到2638g破壁混合物。

1．分别称取10份破壁混合物，每份约20g；

2．分别加入不同溶度的异丙醇水溶液，并充分摇匀，其中异丙醇水溶液的添加量为破壁混合物中藻细胞重量的2倍；

3．2000g，1min离心，分离出上清液，为混合油；

4．将混合油分别脱溶，并于60℃烘箱中衡重，得到毛藻油。

计算藻油回收率，结果如表10所示：

表10、不同浓度异丙醇对藻油回收的影响的比较

对上述结果进行进一步分析，发明人发现，当加入的异丙醇溶液浓度超过40%，离心后会形成3相，且随着异丙醇浓度的进一步增加，上层液（混合油）体积逐渐减少，但其油脂回收率依然明显高于不加入异丙醇溶液的油脂回收率。

实施例6：异丙醇溶液添加量对油脂回收率的影响

将628g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）与约3L正己烷混合，经过砂磨机处理后得到2638g破壁混合物。

1．分别称取6份破壁混合物，每份约20g；

2．分别加入40％（质量浓度）的异丙醇水溶液，并充分摇匀，其中异丙醇水溶液的添加量依次增加，分别为混合物中的藻粉质量的0.5、1.0、1.5、2.0、2.5倍；

3．2000g，1min离心，分离出上清液，为混合油；

4．将混合油分别脱溶，并于60℃烘箱中衡重，得到毛藻油。

计算藻油回收率，结果如表11所示：

表11、不同加入量的异丙醇对藻油回收的影响的比较

实施例7：甲醇浓度对油脂回收率的影响

将628g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）与约3L正己烷混合，经过砂磨机处理后得到2638g破壁混合物。

1．分别称取10份破壁混合物，每份约20g；

2．分别加入不同溶度的甲醇水溶液，并充分摇匀，其中甲醇水溶液的添加量为破壁混合物中藻细胞重量的2倍；

3．2000g，1min离心，分离出上清液，为混合油；

4．将混合油分别脱溶，并于60℃烘箱中衡重，得到毛藻油。

计算藻油回收率，结果如表12所示。

表12、不同浓度的甲醇对藻油回收的影响的比较

实施例8：甲醇溶液添加量对油脂回收率的影响

将628g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）与约3L正己烷混合，经过砂磨机处理后得到2638g破壁混合物。

1．分别称取6份破壁混合物，每份约20g；

2．分别加入40％（质量浓度）的甲醇水溶液，并充分摇匀，其中异丙醇水溶液的添加量依次增加，分别为混合物中的藻粉质量的0.5、1.0、1.5、2.0、2.5倍；

3．2000g，1min离心，分离出上清液，为混合油；

4．将混合油分别脱溶，并于60℃烘箱中衡重，得到毛藻油。

计算藻油回收率，结果如表13所示。

表13、不同甲醇添加量对藻油回收的影响的比较

实施例9：乙醇溶液的添加方式对油脂回收率的影响

将848g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）与约3L正己烷混合，经过砂磨机处理后得到2800g破壁混合物。

1．分别称取3份破壁混合物，每份约17.3g；

2．按不同方式添加乙醇水溶液：

3．混合物中加入40％乙醇水溶液（质量比），混合均匀，其中乙醇水溶液的添加量为混合物中干物质质量的1.6倍；

4．混合物中加入无水乙醇混合均匀，再加入适量水分混合均匀，其中乙醇和水的添加总量为混合物中干物质质量的1.6倍，乙醇：水=2:3；

5．混合物中加入水混合均匀，再加入适量乙醇混合均匀，其中乙醇和水的添加总量为混合物中干物质质量的1.6倍，乙醇：水=2:3；

6．2000g，1min离心，分离出上清液，为混合油；

7．将混合油分别脱溶，并于60℃烘箱中衡重，得到毛藻油。

计算藻油回收率，结果如表14所示：

表14、乙醇-水的不同添加方式对结果的影响

根据表14的结果，先加水再加乙醇的方式藻油回收率略高，但不同添加方式对藻油的回收率差别不大。

实施例10：其它油脂提取溶剂对油脂回收率的影响

将628g藻粉（Schizochytrium sp.自行培养并喷雾干燥获得，含水量3.2％）分别与约3L 6#溶剂油、石油醚、乙醚和丙酮混合，经过砂磨机处理后得到破壁混合物。

1．各称取4份破壁混合物，每份约20g；

2．分别加入40％（质量浓度）的乙醇水溶液，并充分摇匀，其中乙醇水溶液的添加量为混合物中的藻粉质量的2倍；

3．6000g、5min离心，分离出上清液，为混合油；

4．将混合油分别脱溶，并于60℃烘箱中衡重，得到毛藻油。

计算藻油回收率，结果发现每种油脂提取溶剂提取的藻油回收率均在90％以上。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (27)

1.一种提取微生物油脂的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将油脂提取溶剂与微生物细胞混合，获得混合物，其中，所述油脂提取溶剂选自以下溶剂组成的组：6#溶剂油、正己烷、石油醚、乙醚和丙酮；

(2)对步骤(1)所获得的混合物实施破壁处理，获得破壁后的混合物料；和

(3)将水、低碳链醇水溶液、或水与无水低碳链醇添加到步骤(2)所获得的混合物料中；

从而对微生物油脂进行提取。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

(4)对步骤(3)所得的混合物实施固液分离，获得含有微生物油脂和溶剂的混合油；-和

(5)脱除所述混合油中的溶剂，获得微生物油脂。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固液分离通过离心分离或自然沉降分离。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂为正己烷。

5.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂与所述微生物细胞的混合重量比是10:1～1:2。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂与所述微生物细胞的混合重量比是5:1～1:1。

7.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入的水或低碳链醇水溶液的量是微生物细胞重量的0.1～10倍。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入的水或低碳链醇水溶液的量是微生物细胞重量的1-5倍。

9.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述低碳链醇选自含有1－6个碳原子的一元醇或多元醇。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述低碳链醇选自含有1－6 个碳原子的一元醇或二元醇。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述低碳链醇选自：甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇和丁醇中的一种或多种。

12.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量1～5倍的浓度为30％～50％的乙醇水溶液。

13.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量1～3倍的浓度为30％～50％的异丙醇水溶液。

14.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量1～3倍的浓度为50％～70％的甲醇水溶液。

15.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，采用砂磨机、高压均质机、高速剪切机、胶体磨中的一种或多种实施机械破壁处理。

16.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(1)之前还包括提供干燥的微生物细胞的步骤。

17.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物为产油脂的微藻。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述油脂为含有胆固醇，植物甾醇，链甾醇，生育三烯酚，生育酚，泛醌，类胡萝卜素，叶黄素，黄体素，番茄红素，虾青素，玉米黄质，角黄素和/或脂肪酸的油脂。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸为亚油酸，ω-3和ω-6高不饱和脂肪酸，双高γ-亚麻酸和γ-亚麻酸或它们的混合物。

20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述油脂为含多不饱和脂肪酸的油脂。

21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述油脂为含二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，花生四烯酸，和十八碳四烯酸或它们的混合物的油脂。

22.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述微生物选自：绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorella emersonii，Chlorella sorokiniana，Chlorella saccharophila，Chlorella regularis，微小小球藻(Chlorella minutissima)，Chlorella protothecoides，小球藻(Chlorella zofingiensis)，绿藻门中的Brachiomonas submarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonas acidophila，雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)，湖泊红球藻(Haematococcus lacustris)，斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)，Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，扁藻(Tetraselmis chuii)，四肩突四鞭藻(Tetraselmis tetrathele)，Tetraselmis verrucosa，微芒藻(Micractinium pusillum)；硅藻门的筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)，Nitzschia laevis，Nitzschia alba，Nitzschia fonticola，Navicula incerta，羽纹硅藻(Navicula pelliculosa)；蓝藻门的多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)；金藻门的Poterioochromonas malhamensis；甲藻门的前环藻(Amphidinium carterae)，寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)；裸藻门的Euglena gricilis；和红藻门的单细胞红藻(Galdieria sulphuraria)，以及它们的混合物。

23.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述微生物为选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微生物、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微生物、被孢霉属(Mortierella)的微生物、Althornia属的微生物、Aplanochytrium属的微生物、Japonochytrium属的微生物、Labyrinthula属的微生物、Labyrinthuloides属的微生物、Crypthecodinium属的微生物，褐指藻属(Phaeodactylum)的微生物，微绿球藻属(Nanochloropsis)的微生物，裸藻属(Euglena)的微生物，四膜虫属(Tetrahymena)的微生物，螺旋藻属(Spirulina)的微生物，和吾肯氏壶藻属(Ulkenia)的微生物，隐甲藻属(Crypthecodinium(Dinofagellates))的微生物，以及它们的混合物。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属的微生物，以及它们的混合物。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述微生物为Schizochytrium  sp.。

26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述微生物为ATCC20888和/或SR21。

27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述微生物是甲藻。