CN116396988B - 一种微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明的目的是为了挖掘高COD亚麻脱胶废液的利用场景，拓展产多不饱和脂肪酸的微生物来源。具体方法：亚麻脱胶液上清加入尿素后调整pH并灭菌；接种微芒藻Micractinium sp.HDA05培养得到发酵液；发酵液离心留沉淀，经冻干、研磨与有机溶剂抽提即获得含有多不饱和脂肪酸的粗油。本发明方法获得的多不饱和脂肪酸产量可达403~588 mg/L，与常规培养基相比节约培养成本，且产量提升显著。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人类及动物饮食的重要组成部分，在细胞信号传导、膜结构和功能以及许多其他生理反应中发挥重要作用。一些藻类在生长过程中可积累PUFA，具有开发为PUFA原料的潜力，可用来增加动物饲料和动物产品的营养水平。但藻类培养过程成本较高，限制了其生产PUFA的规模化应用。利用废水培养藻类，有助于解决藻类培养过程中的成本问题。但不同类型废水特征不同，需要针对性探索培养藻类的可行性。在《城镇污水处理厂污染物排放标准》、《地表水环境质量标准》和《污水综合排放标准》三个国家标准中，对于废水排放COD限值有严格规定。但麻类纤维脱胶等产生COD较高的工业，其废液中COD浓度远超排放限值100~1000 mg/L的要求。因此，有必要针对高COD含量的麻类脱胶废液，挖掘其利用场景，回收其中营养元素，促进废水资源化利用。本发明针对亚麻脱胶废液这一类废水的利用问题，提供一种微芒藻产多不饱和脂肪酸的方法。目前尚无微芒藻属微生物利用高COD亚麻脱胶废液高产多不饱和脂肪酸的报道。
本发明中，微芒藻HDA05的拉丁名为Micractiniumsp. HDA05，保藏于黑龙江大学微生物重点实验室，本发明中微芒藻HDA05的来源为：富油微藻的分离筛选及其脂质积累相关酶学分析[D]. 黑龙江大学, 2015。
发明内容
为了挖掘高COD废液的利用场景，拓展产多不饱和脂肪酸的微生物来源，本发明提供一种微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法。
本发明微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法，按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量5000~12000 mg/L的亚麻脱胶废液静置8~10h，取静置后上清液；每升上清液加入尿素0.5~0.8 g，调整上清液pH为6.8~8.8；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.1~0.2 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度22~27℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵6~8 d；以3500~4500rpm离心10~15min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本发明步骤一中尿素可替换为硝酸钠、氯化铵或硝酸铵。
有益效果：
1. 本发明中的微芒藻属（Micractiniumsp.）藻株HDA05可通过光能自养和化能异养两种方式生长。在利用光能、CO2的同时，还可以利用亚麻脱胶废液中的营养元素及有机物。利用本发明的方法，藻类在积累生物量、合成高附加值产物的同时实现亚麻脱胶废液利用。
2. 本发明提供的方法步骤简单，不需添加额外的碳源，能够节省藻类培养的水源、碳源成本。添加的尿素可为工业级，价格低廉。与常规培养基相比，藻类细胞在高COD亚麻脱胶废液中生长更快，多不饱和脂肪酸的产量更高。本发明中微芒藻属（Micractiniumsp.）藻株HDA05在高COD亚麻脱胶废液中培养时，多不饱和脂肪酸产量可达403~588 mg/L，与常规培养基相比节约培养成本，且产量提升显著。
3. 本发明所用的微芒藻为绿藻类，可直接作为健康食品及膳食补充来源，可直接以藻粉形式加入食品或饲料，也可以富集多不饱和脂肪酸后作为相关营养强化成分添加。本发明的方法对食品、膳食补充剂及饲料生产具有促进作用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方式进行说明。需要理解的是以下实施例只是起到说明的目的，并非对本发明的范围进行限制。
下述实施例中所使用的试剂、材料，若无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的实验方法，若无特殊说明，均为常规实验方法。
实施例1：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量9884 mg/L的亚麻脱胶废液静置8h，取静置后上清液；每升上清液加入尿素0.8 g，调整上清液pH为7.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.2 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度25℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵7 d；以3500 rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.80 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸286 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸515 mg。
实施例2：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量5633 mg/L的亚麻脱胶废液静置9h，取静置后上清液；每升上清液加入尿素0.6 g，调整上清液pH为7.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.2 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度25℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵7 d；以4200rpm离心12 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.45 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸278 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸403 mg。
实施例3：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量9072 mg/L的亚麻脱胶废液静置8h，取静置后上清液；每升上清液加入尿素0.8 g，调整上清液pH为8.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.2 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度25℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵8 d；以4500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.96 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸300 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸588 mg。
实施例4：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量9351 mg/L的亚麻脱胶废液静置9h，取静置后上清液；每升上清液加入尿素0.6 g，调整上清液pH为7.0；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.1 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度27℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵6 d；以3500rpm离心15 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.73 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸260 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸450 mg。
实施例5：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量5356 mg/L的亚麻脱胶废液静置10h，取静置后上清液；每升上清液加入尿素0.7 g，调整上清液pH为7.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.1 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度23℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵6 d；以4500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.53 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸277 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸424 mg。
由实施例1~实施例5可知，本发明采用微芒藻Micractiniumsp. HDA05，利用高COD的亚麻脱胶废液发酵，可产多不饱和脂肪酸，且多不饱和脂肪酸含量较高，每克藻粉含多不饱和脂肪酸260~300 mg，每升亚麻脱胶废液获得不饱和脂肪酸424~588 mg。
实施例6：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量7526 mg/L的亚麻脱胶废液静置10h，取静置后上清液；每升上清液加入硝酸钠0.7 g，调整上清液pH为8.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.2 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度24℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵7 d；以4500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.68 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸289 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸486 mg。
实施例7：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量5087 mg/L的亚麻脱胶废液静置10h，取静置后上清液；每升上清液加入硝酸钠0.7 g，调整上清液pH为8.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.1 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度25℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵7 d；以3500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.66 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸275 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸457 mg。
实施例8：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量6100 mg/L的亚麻脱胶废液静置10h，取静置后上清液；每升上清液加入硝酸钠0.5 g，调整上清液pH为6.9；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.1 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度25℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵7 d；以3500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.75 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸269 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸471 mg。
由实施例6~实施例8可知，本发明采用微芒藻Micractiniumsp. HDA05，利用高COD的亚麻脱胶废液发酵，可产多不饱和脂肪酸，且多不饱和脂肪酸含量较高，每克藻粉含多不饱和脂肪酸269~289 mg，每升亚麻脱胶废液获得不饱和脂肪酸457~486 mg。
实施例9：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量7506 mg/L的亚麻脱胶废液静置10h，取静置后上清液；每升上清液加入氯化铵0.6 g，调整上清液pH为7.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.2 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度25℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵7 d；以3500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.89 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸258 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸488 mg。
实施例10：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量9530 mg/L的亚麻脱胶废液静置8h，取静置后上清液；每升上清液加入氯化铵0.5 g，调整上清液pH为7.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.1 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度25℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵7 d；以3500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.77 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸236 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸418 mg。
实施例11：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量11320 mg/L的亚麻脱胶废液静置8h，取静置后上清液；每升上清液加入氯化铵0.5 g，调整上清液pH为7.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.2 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度25℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵8 d；以3500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.93 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸249 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸481 mg。
由实施例9~实施例11可知，本发明采用微芒藻Micractiniumsp. HDA05，利用高COD的亚麻脱胶废液发酵，可产多不饱和脂肪酸，且多不饱和脂肪酸含量较高，每克藻粉含多不饱和脂肪酸236~258 mg，每升亚麻脱胶废液获得不饱和脂肪酸418~488 mg。
实施例12：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量7056 mg/L的亚麻脱胶废液静置8h，取静置后上清液；每升上清液加入硝酸铵0.5 g，调整上清液pH为7.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.2 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度25℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵7 d；以3500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.80 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸251 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸452 mg。
实施例13：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量7056 mg/L的亚麻脱胶废液静置8h，取静置后上清液；每升上清液加入硝酸铵0.5 g，调整上清液pH为7.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.1 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度27℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵8 d；以3500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.70 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸260 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸442 mg。
实施例14：
本实施方式微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法按照以下步骤进行：
步骤一、将COD含量7056 mg/L的亚麻脱胶废液静置8h，取静置后上清液；每升上清液加入硝酸铵0.8 g，调整上清液pH为7.5；121℃灭菌15 min。
步骤二、按照接种量0.2 g/L将微芒藻Micractiniumsp. HDA05接种至上述灭菌后上清液中，在温度25℃、摇床转速150rpm、光照强度3000 lux的条件下发酵8 d；以3500rpm离心10 min，留沉淀获得微芒藻藻泥。藻泥经冷冻干燥后研磨，再以氯仿/甲醇（v:v=2:1）抽提三次，静置后取下层有机相，用氮吹仪干燥有机溶剂即获得多不饱和脂肪酸的粗油。
本实施例每升亚麻脱胶废液可收获的微芒藻1.75 g，每克藻粉含多不饱和脂肪酸279 mg，折合每升亚麻脱胶废液可获得多不饱和脂肪酸488 mg。
由实施例12~实施例14可知，本发明采用微芒藻Micractiniumsp. HDA05，利用高COD的亚麻脱胶废液发酵，可产多不饱和脂肪酸，且多不饱和脂肪酸含量较高，每克藻粉含多不饱和脂肪酸251~279 mg，每升亚麻脱胶废液获得不饱和脂肪酸442~488 mg。
比较例1：
本比较例与实施例1不同的是，步骤一中上清液pH为5.5，不经过灭菌环节。其他步骤和参数和实施例1相同。
比较例2：
本比较例与实施例1不同的是，步骤一中不加入尿素。其他步骤和参数和实施例1相同。
比较例3：
本比较例与实施例1不同的是，步骤一中不加入尿素，以微藻培养常用培养基BG-11替代亚麻脱胶废液。其他步骤和参数和实施例1相同。
比较例4：
本比较例与实施例1不同的是，步骤二中不设置光照和摇床转速。其他步骤和参数和实施例1相同。
比较例5：
本比较例与实施例1不同的是，步骤二中温度设置为30℃。其他步骤和参数和实施例1相同。
表1 实施例1与比较例的多不饱和脂肪酸产量对比
| 组别 | 微茫藻生物量(g/L) | 藻粉PUFA含量（mg/g） | 亚麻脱胶废液PUFA产量（mg/L） |
| 实施例1 | 1.80 | 286 | 515 |
| 比较例1 | 0.30 | 220 | 66 |
| 比较例2 | 0.55 | 185 | 102 |
| 比较例3 | 0.68 | 209 | 142 |
| 比较例4 | 0.95 | 195 | 185 |
| 比较例5 | 1.20 | 170 | 204 |
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于微芒藻属微生物利用亚麻脱胶废液产多不饱和脂肪酸的方法，包括以下步骤：
步骤一、将亚麻脱胶废液静置8~10 h，取静置后上清液；加入尿素，调整上清液pH为6.8~8.8；121℃灭菌15 min；
步骤二、接种微芒藻Micractinium sp. HDA05至上述灭菌后上清液发酵6~8 d；离心留沉淀获得微芒藻生物质，经冻干、研磨与有机溶剂抽提即得到多不饱和脂肪酸的粗油。
2. 根据权利要求1所述的微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于步骤一中亚麻脱胶废液化学需氧量（COD）浓度为5000~12000 mg/L。
3. 根据权利要求1所述的微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于步骤一中尿素添加量为0.5~0.8 g/L，尿素可替换为硝酸钠、氯化铵或硝酸铵。
4. 根据权利要求1所述的微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于步骤二中微芒藻的接种量为0.1~0.2 g/L。
5. 根据权利要求1所述的微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于步骤二中微芒藻的发酵条件为温度22~27℃，摇床转速150rpm，光照强度3000 lux。
6.根据权利要求1所述的微芒藻属微生物产多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于步骤二中微芒藻生物质收获条件为离心转速3500~4500rpm，离心时间为10~15min。
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