CN113249289B - 微生物发酵生产pufa的废水循环再利用的方法 - Google Patents

微生物发酵生产pufa的废水循环再利用的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了微生物发酵生产PUFA的废水循环再利用的方法，包括以下步骤：向发酵结束后得到的发酵液中加入复合酶系进行破壁，离心处理，得到的油相A与水相B，油相A为PUFA油脂产品，水相B为发酵废水。向发酵废水中按10%‑20%的比例接入废水驯化的小球藻，培养2‑3天，获得小球藻培养液。将小球藻培养液进行离心分离，获取水相C与固相D；水相C为处理后发酵水，固相D为小球藻微藻蛋白。向处理后发酵水中重新添加营养盐，进行产PUFA油脂的微生物发酵培养，实现发酵废水的回用。经小球藻处理后的发酵废水重新添加营养盐后，可以100%回用于PUFA油脂的再次生产，且不影响发酵得率，实现发酵废水的零排放和循环使用。

Description

微生物发酵生产PUFA的废水循环再利用的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及发酵废水的处理方法，具体涉及采用微生物发酵生产PUFA的废水获得PUFA油脂和微藻蛋白的方法。
背景技术
由于多不饱和脂肪酸(PUFA)对人体健康的有益作用，目前已经受到了全世界的广泛关注。其中，二十二碳六烯酸(DHA，C22：6，n-3)和花生四烯酸(ARA，C20：4，n-6)对改善婴儿视力和智力发育以及降低与高血压相关的风险至关重要。鱼油和动物内脏产品曾经是DHA和ARA的主要饮食来源。但是，由于渔业资源有限。且部分动物内脏存在不良风味，寻找DHA和ARA的替代来源已经成为近年来相关研究的方向之一。目前，利用微生物裂殖壶菌和高山被孢霉发酵生产DHA和ARA，已经成为新的可持续的替代来源。
研究人员对微生物PUFA生产的几乎所有方面进行了广泛研究，包括菌株筛选、培养基优化和发酵过程控制(Nie等，2013)等。但针对发酵废水再利用的研究则罕有报道。通常来说，工业发酵过程会消耗大量的水，同时伴随着很高的生物需氧量，并产生大量的发酵废水。目前，中国境内用产PUFA(如DHA和ARA)所产生的废水接近100,000吨/年(Chen等，2016)。发酵废水再利用的主要难题在于其中存在细胞生长抑制物，包括培养基中的某些成分，代谢过程以及细胞生长过程中的分泌物；这些抑制剂在发酵过程中不断积聚，当抑制物浓度达到一定浓度后将严重抑制微生物细胞的生长(Muller等人，2014)。发酵废水的处理不但成本高昂，而且需要大容量和高功率的处理设备(Ruiz-Rosa等，2016)。因此，减少发酵废水排放和发酵废水再利用的技术具有重要的实际应用价值。
目前，发酵废水的处理通常采用沉淀-厌氧细菌发酵处理-好氧发酵处理；这种处理方式周期长、能耗高，而且需要大量的附属专用设备。因此，利用微生物或微藻处理发酵废水也成为热门方案。专利CN103993062B开发了一种利用胶红酵母处理抗生素发酵废水生产类胡萝卜素的方法。经该方案处理后虽然实现类胡萝卜素的生产，但培养胶红酵母后产生的液体水仍属于发酵废水，需要后续处理，没有实现减少废水处理量和降低废水排放的目的。专利CN110894467A和CN107055946A通过培养微藻对发酵废水进行处理，实现了废水的达标排放，但这两种方案在进行微藻培养前都需要对前期发酵废水进行气爆或酸碱等前处理，微藻培养需要在专门的光生物反应器中进行，增加了设备投入，同时处理后的液体也没有实现循环使用。
综上可知，发酵废水的再利用仍然存在利用率低、工艺复杂、成本高的问题，而且没有从本质上解决发酵废水中存在的细胞生长抑制物的问题，因此，并没有实现发酵废水真正意义上的循环使用。
发明内容
针对现有技术中发酵废水再利用所存在的问题，本发明提供了微生物发酵生产PUFA的废水循环再利用的方法。所述方法处理得到的“发酵废水”可以100％用于PUFA油脂的再次生产，不但获得PUFA油脂和微藻蛋白，而且不影响发酵得率，从而实现发酵了废水的零排放和循环使用。
本发明的技术方案：微生物发酵生产PUFA油脂的废水循环再利用的方法，包括以下步骤：
(1)向发酵结束后得到的发酵液中加入复合酶系进行破壁，将破壁后的发酵液进行离心处理，得到的油相A与水相B，所述油相A为PUFA油脂产品，所述水相B为发酵废水。其中，所述复合酶系按重量份数计，由1份半乳糖苷酶、0.5-1份纤维素酶和3-4份中性蛋白酶组成。所述复合酶系的添加量为发酵液体积的0.05‰-0.1‰。所述发酵生产PUFA油脂的微生物为裂殖壶菌和高山被孢霉。所述复合酶系显著提高了细胞的酶解效率，并实现了耐高发酵废水浓度的无需预分离的原位酶解。
(2)向步骤(1)分离得到的发酵废水中，按10％-20％的比例接入废水驯化的小球藻，培养2-3天，获得小球藻培养液。所述小球藻的驯化方法具体为：(a)一级培养：将小球藻在含有10g/L葡萄糖的BG11培养基中培养2天；(b)一级驯化：将一级培养的小球藻转接到含有10％发酵废水的BG11培养基中驯化2天；(c)二级驯化：将一级驯化的小球藻转接到50％的发酵废水中驯化2天，即得废水驯化后的小球藻。所述一级培养过程、一级驯化过程及二级驯化过程均无需对小球藻进行光照。所述废水驯化的小球藻能够利用发酵废水中的细胞生长抑制物，从而消除了发酵废水中含有的生长抑制因子与残留营养成分。此外，本步骤中的小球藻培养可以使用原有的发酵设备，无需额外添加光生物反应器等其他设备，不但降低了设备投入带来的成本，而且增加了所述方法的便利性，具备广阔的应用前景。
(3)将步骤(2)得到的小球藻培养液进行离心分离，获取水相C与固相D；所述水相C为处理后发酵水，所述固相D为小球藻微藻蛋白。
(4)向步骤(3)得到的处理后发酵水中重新添加营养盐，进行产PUFA油脂的微生物发酵培养，实现发酵废水的回用。经小球藻处理后的发酵废水重新添加营养盐后，不仅可以100％回用于PUFA油脂的再次生产，而且不影响发酵得率，实现发酵废水的零排放和循环使用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明所述的方法首先对制备PUFA油脂所需的水解酶系进行了优化；所述复合酶系不但显著提高了细胞的酶解效率，而且酶解后的发酵废水在后续循环利用时无需预分离，工艺简单方便。
(2)本发明所述的方法利用废水驯化的小球藻进行异养发酵培养，消除发酵废水中的生长抑制因子与残留营养成分，解决了废水循环再利用的瓶颈问题，实现发酵废水的零排放和循环使用。
(3)本发明所述的方法中小球藻的培养无需光照，可以使用原有的发酵设备；此外，由此获得的小球藻浓缩干燥后制成小球藻粉，可以作为单细胞蛋白产品，进一步增加工艺的整体经济效益；因此，大大增加了所述方法在产业上应用的优势。
附图说明
附图1为本申请所述的废水循环再利用的流程示意图；
附图2为驯化/未驯化的小球藻在产PUFA油脂的发酵废水中生长情况对比。其中，图2A中小球藻的初始接种量为20％，培养时间为48小时；图2B中小球藻的初始接种量为10％，培养时间为72小时。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：水解酶系的选择与优化
为了提高细胞的酶解效率，实现耐高发酵废水浓度的无需预分离的原位酶解，发明人对水解酶系进行了长期的研究。最终发现，当半乳糖苷酶+纤维素酶+中性蛋白酶的质量比为1：(0.5-1)：(3-4)时，酶解效率最高，此时的细胞破壁率为95％-98％。表1给出了不同量的复合酶系在未稀释废水中的破壁效果。根据表1所示的破壁率，综合考虑成本，发明人将复合酶系的添加量确定为发酵液体积的0.05‰-0.1‰。
表1.不同添加量的复合酶系在100％浓度废水中的破壁效果
Figure BDA0003084913310000031
实施例2：产PUFA油脂的微生物发酵废水中有机营养成分的测定
用于产DHA的裂殖壶菌发酵：初始发酵培养基组成为葡萄糖120g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L，维生素混合液1ml/L。培养过程中通过流加浓葡萄糖溶液和酵母粉溶液维持细胞生长。培养条件为25℃，pH7.0，转速150rpm，通风比为1VVM，发酵时长100小时。然后添加0.05‰的复合酶系，所述复合酶系由1重量份的半乳糖苷酶，0.5重量份的纤维素酶和3重量份的中性蛋白组成。水解10小时后，获得的DHA油脂产量为30.7g/L，其中DHA含量为46％。发酵废水的有机营养成分如表2所示：
表2.裂殖壶菌和被孢霉发酵废水中有机营养成分的含量成分
Figure BDA0003084913310000041
用于产ARA的被孢霉发酵：初始发酵培养基组成为葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁13g/L，维生素混合液1ml/L。培养过程中通过流加浓葡萄糖溶液和酵母粉溶液维持细胞生长。培养条件为28℃，pH7.0，转速100rpm，通风比为1.5VVM，发酵时长192小时。然后添加0.1‰的复合酶系，所述复合酶系由1重量份的半乳糖苷酶、1重量份的纤维素酶和4重量份的中性蛋白酶组成。水解10小时后，获得的ARA油脂产量为13.3g/L，其中ARA含量为51％。发酵废水中有机营养成分如表4所示。
实施例3：未驯化与废水驯化的小球藻在产PUFA油脂的发酵废水中生长状态对比
未驯化的小球藻(光照培养方式)采用BG11培养基进行培养；培养条件为：培养温度25℃，摇床转速180rpm，光照5000-7000lux，培养3天。未驯化的小球藻(异养培养方式)采用含有10g/L葡萄糖的BG11培养基进行培养；培养条件为：培养温度25℃，摇床转速180rpm，培养3天。驯化小球藻的培养方法为：将小球藻在含有10g/L葡萄糖的BG11培养基中培养2天，然后转接到含有10％发酵废水的BG11培养基中驯化2天，再转接到50％的发酵废水中驯化2天，培养全程无光照，温度25℃，摇床转速180rpm。
将未驯化与驯化的小球藻以15％的比例接种到装有3L未稀释发酵废水的5L发酵罐中，在25℃，400rpm，通风比1.5VVM条件下，避光培养2-3天。检测小球藻的生长状态及培养结束后水中有机营养成分的剩余状况。
小球藻在产PUFA油脂的发酵废水中生长状态如图1所示。由图1可以发现，经过废水驯化的小球藻能在未稀释发酵废水中快速生长，生物量能达到8g/L以上。而未经驯化的小球藻在发酵废水中生长缓慢，同等条件下生物量分别只有1g/L(光照培养)左右和5g/L(异养培养)左右。培养结束后发酵废水中有机营养成分的含量如表5-7所示。根据表3可知：未经驯化的光照小球藻只能去除废水中微量的有机碳氮。根据表4可知，未经驯化的异养小球藻能有效去除发酵废水中的有机碳但仍有大量的有机氮残留。根据表5可知，经过废水驯化的小球藻通过异养发酵的方式可以基本完全去除发酵废水中的有机碳氮。
表3.废水驯化的小球藻处理后的发酵废水中有机营养成分的含量
Figure BDA0003084913310000051
表4.未驯化小球藻(光照培养)处理后的有机废水中有机营养成分的含量
Figure BDA0003084913310000061
表5.未驯化小球藻(异养培养)处理后的有机废水中有机营养成分的含量
Figure BDA0003084913310000062
实施例4：发酵废水循环使用的效果对比
向经驯化小球藻处理后的废水中加入相应营养盐，重新进行生产PUFA油脂的发酵生产。生产培养基与生产条件同实施例2所述。发酵结束后，检测PUFA油脂产量与相应PUFA的含量，结果如表6、表7所示。由表中结果可知，经废水驯化的小球藻处理后的废水，经五次循环使用后获得的DHA油脂与ARA油脂产品的产量及含量指标，均与使用纯水的初次发酵指标相当或略高。这说明，处理后废水的循环使用不会对PUFA油脂的发酵生产造成影响。
表6.处理后发酵废水的循环使用对DHA油脂生产的影响
Figure BDA0003084913310000071
表7.处理后发酵废水的循环使用对ARA油脂生产的影响
Figure BDA0003084913310000072
实施例5：裂殖壶菌发酵生产PUFA油脂的废水循环再利用
(1)向发酵结束后得到的发酵液中加入复合酶系进行破壁，将破壁后的发酵液进行离心处理，得到的油相A与水相B，所述油相A为PUFA油脂产品，所述水相B为发酵废水。其中，所述复合酶系按重量份数计，由1份半乳糖苷酶、0.6份纤维素酶和4份中性蛋白酶组成。所述复合酶系的添加量为发酵液体积的0.06‰。
(2)向步骤(1)分离得到的发酵废水中，按20％的比例接入废水驯化的小球藻，培养2-3天，获得小球藻培养液。所述小球藻的驯化方法同实施例3。
(3)将步骤(2)得到的小球藻培养液进行离心分离，获取水相C与固相D；所述水相C为处理后发酵水，所述固相D为小球藻微藻蛋白。所述小球藻微藻蛋白经浓缩干燥后制成小球藻粉。向处理后发酵水中重新添加营养盐，进行产PUFA油脂的微生物发酵培养。经五次循环使用后获得的DHA油脂的产量产品及含量指标如表8所示。
表8.处理后发酵废水的循环使用对DHA油脂生产的影响
Figure BDA0003084913310000073
实施例6：高山被孢霉发酵生产PUFA油脂的废水循环再利用
(1)向发酵结束后得到的发酵液中加入复合酶系进行破壁，将破壁后的发酵液进行离心处理，得到的油相A与水相B，所述油相A为PUFA油脂产品，所述水相B为发酵废水。其中，所述复合酶系按重量份数计，由1份半乳糖苷酶、0.8份纤维素酶和3.5份中性蛋白酶组成。所述复合酶系的添加量为发酵液体积的0.08‰。
(2)向步骤(1)分离得到的发酵废水中，按10％的比例接入废水驯化的小球藻，培养2-3天，获得小球藻培养液。所述小球藻的驯化方法同实施例3。
(3)将步骤(2)得到的小球藻培养液进行离心分离，获取水相C与固相D；所述水相C为处理后发酵水，所述固相D为小球藻微藻蛋白。所述小球藻微藻蛋白经浓缩干燥后制成小球藻粉。向处理后发酵水中重新添加营养盐，进行产PUFA油脂的微生物发酵培养。经五次循环使用后获得的ARA油脂产品的产量及含量指标如表9所示。
表9.处理后发酵废水的循环使用对ARA油脂生产的影响
Figure BDA0003084913310000081
综上可知，采用本申请所述的方法处理后的发酵废水，可以循环使用，而且不会对PUFA油脂的发酵生产造成影响。换言之，本申请所述的方法实现了生产PUFA油脂发酵废水的零排放和循环使用，具有重要的产业应用价值。这是因为，本申请所述的方法，通过优化的复合酶系显著提高了产PUFA微生物细胞的破壁率，不但提高了相应油脂的产量，而且避免了后续废水处理中的分离步骤。同时，采用了废水驯化的小球藻进行异养发酵培养，消除发酵废水中的生长抑制因子与残留营养成分，从而解决了废水循环再利用的瓶颈问题，实现发酵废水的零排放和循环使用。此外，获得的小球藻微藻蛋白可以制成小球藻粉，进一步增加了所述方法的经济效益。

Claims (3)

1.微生物发酵生产PUFA油脂的废水循环再利用的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）向发酵结束后得到的发酵液中加入复合酶系进行破壁，将破壁后的发酵液进行离心处理，得到的油相A与水相B，所述油相A为PUFA油脂产品，所述水相B为发酵废水；所述复合酶系按重量份数计，由1份半乳糖苷酶、0.5-1份纤维素酶和3-4份中性蛋白酶组成；所述复合酶系的添加量为发酵液体积的0.05‰-0.10‰；
（2）向步骤（1）分离得到的发酵废水中接入废水驯化的小球藻，培养2-3天，获得小球藻培养液；所述废水驯化的小球藻能够利用发酵废水中的细胞生长抑制物；所述小球藻的驯化方法为：（1）一级培养：将小球藻在含有10g/L葡萄糖的BG11培养基中培养2天；（2）一级驯化：将一级培养的小球藻转接到含有10%发酵废水的BG11培养基中驯化2天；（3）二级驯化：将一级驯化的小球藻转接到50%的发酵废水中驯化2天，即得废水驯化后的小球藻；
（3）将步骤（2）得到的小球藻培养液进行离心分离，获取水相C与固相D；所述水相C为处理后发酵水，所述固相D为微藻蛋白；
（4）向步骤（3）得到的处理后发酵水中重新添加营养盐，进行产PUFA油脂的微生物发酵培养，实现发酵废水的回用；所述产PUFA油脂的微生物为裂殖壶菌或高山被孢霉。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵生产PUFA的废水循环再利用的方法，其特征在于：步骤（2）所述接入废水驯化的小球藻具体为：按10%-20%的比例接入废水驯化后的小球藻。
3.根据权利要求1所述的微生物发酵生产PUFA的废水循环再利用的方法，其特征在于：所述的一级培养过程、一级驯化过程及二级驯化过程均无需对小球藻进行光照。
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