CN105001982A - 富含二十碳五烯酸拟微球藻油脂超声波辅助溶剂提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含二十碳五烯酸拟微球藻油脂超声波辅助溶剂提取方法。首先配制90%乙醇作为提取溶剂，然后在优化工艺条件下进行油脂提取：温度50？℃，超声30？min，料液比1？:？15（g/mL），提取3次，最后将提取出的藻油和原材料破壁藻粉运用气相色谱仪测定脂肪酸组成。本发明建立的拟微球藻油提取优化工艺，油脂提取率可达37%以上，所得藻油主要成分二十碳五烯酸（EPA）占总脂肪酸的39%。该工艺流程简单，设备成本低，便于工厂化生产，其中乙醇在可在生产过程中回收利用，为工业化制取微藻油提供了重要的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工中油脂加工领域，特别地，本发明涉及一种微生物功能性油脂提取方法。
背景技术
拟微球藻（Nannochloropsis sp.）是一种黄绿色单细胞超微型藻，其富含蛋白质、多种氨基酸、矿物质等，脂含量占自身干重的38%左右，营养价值高，已成功进行大规模培育。目前针对拟微球藻的研究集中在以下几个方面：拟微球藻中二十碳五烯酸的提取及富集；生长环境对拟微球藻生长和油脂积累的影响的研究等。拟微球藻的一个重要特点是其脂肪酸组成中EPA含量较高，是工业化提取EPA的理想原料。拟微球藻的市场应用多以动物饲料为主。而以拟微球藻为原料，生产富含EPA的食用型油脂鲜见报道。
二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）属于n-3多不饱和脂肪酸，是大脑、神经和视觉细胞中重要的脂肪酸成分，对人体生理功能的正常发挥及多种疾病的防治有着重要作有着重要作用，如预防心血管疾病，抗癌、抗炎、抑制过敏反应和增强免疫力等。长期以来，EPA和同属于n-3多不饱和脂肪酸的二十二碳五烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）主要来源于寒冷地区（南极和北极）深海鱼中提取的深海鱼油。但渔业资源可能减少，而人类对EPA和DHA需求量的增加，通过人工养殖微藻并提取n-3多不饱和脂肪酸已成为国际上新的n-3多不饱和脂肪酸来源。
微藻油油脂提取的工艺并不复杂，根据油脂的相似相容原理选择适当的溶剂进行提取。通常所选择的溶剂毒性较大，例如乙二醇二甲醚、甲醇、乙酸、丙三醇等有机溶剂。这对工业化生产食用型藻油或是EPA产品是不利的，如：一种从布朗葡萄藻湿藻体中提取藻油的方法（申请号201110029756.5），微藻油脂的提取方法（申请号201010607927.3），一种微藻油脂提取方法（申请号201210511744.0）。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种富含二十碳五烯酸拟微球藻油脂超声波辅助溶剂提取方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一种富含二十碳五烯酸拟微球藻油脂超声波辅助溶剂提取方法，包括以下步骤：
（1）将破壁拟微球藻粉和提取溶剂混合；
（2）在水浴条件下超声浸提；
（3）超声结束后将料液分离；
（4）分离后的固体部分进行重新浸提或不进行重新浸提；
（5）分离后的液体部分进行溶剂回收即可得到藻油。
所述步骤（1）中的提取溶剂为体积比90%乙醇，料液比为1:15（g/mL）。
所述步骤（2）中水浴的温度为50℃，超声时间为30min。
所述步骤（3）所述的料液分离采用离心或者抽滤。
所述步骤（3）离心转速为3000r/min。
所述步骤（4）中所述重新浸提的次数为两次，总提取次数为三次。
所述步骤（5）中所述溶剂回收采用旋转蒸发的方法，并且回收的乙醇可以重复利用。
所述步骤（5）中藻油的提取率≥37%。
进一步，所述步骤（5）取得到的藻油进行气相色谱检测，测定其中主要脂肪酸组成，记录主要的检测数据。
所述步骤（5）中藻油中含有的主要脂肪酸有肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸（EPA），其中EPA占总脂肪酸的质量百分比例≥39%。
本发明的有益效果是：
（1）本发明采用大规模工业生产易行的方法，高效地对富含EPA的微拟球藻油脂进行提取；
（2）提取溶剂乙功醇为低毒性提取剂，可作为生产微藻食用油的安全溶剂；
（3）本发明提取出的藻油经过气相色谱仪检测，EPA的含量占总脂肪酸的39%，可作为工业生产EPA的原料。
附图说明
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
图1是本发明的一种提取工艺流程；
图2是工艺优化中不同种类溶剂对提取率的影响；
图3是工艺优化中不同浓度乙醇对提取率的影响；
图4是工艺优化中超声浸提温度对提取率的影响；
图5是工艺优化中超声浸提时间对提取率的影响；
图6是工艺优化中料液比对提取率的影响；
图7是工艺优化中提取次数对提取率的影响；
图8是藻油的气相色谱图。
具体实施方式
本发明的一种提取工艺流程如图1所示，称取一定量的破壁微拟球藻粉，按1:15（g/mL）的料液比加入90%乙醇溶液，充分混匀，在水浴温度为50 ℃的超声设备中超声浸提30 min。超声浸提结束后在3000 r/min转速下离心5分钟或者进行抽滤处理，离心（或抽滤）后将上清液与沉淀分离。其中沉淀部分需回收进行2次提取，总提取次数为3次，取上清液部分进行旋转蒸发回收乙醇后即得到藻油。对提取的藻油以及原料藻粉进行气相色谱检测。检测步骤如下：
1、肪酸采用三氟化硼法甲酯化：取2 μL油脂加入三氟化硼甲醇溶液和正己烷各1.5 mL，充入氮气，密封。在干式加热器中100 ℃条件下加热60 min，冷却至室温。加入1 mL双蒸水，摇匀1 min，3000 r/ min条件下离心5分钟，将上层己烷相移到一个干净的试管中，加入无水硫酸钠除去水分，移取溶液至干净试管，溶液用硅胶柱过滤。在氮气环境中吹干该过滤液，加入100 μL己烷再溶解。
2、气相色谱分析：用GC-14C型气相色谱仪测定脂肪酸，用N2010色谱数据工作站采集图谱，并处理分析所采集的谱图数据。色谱峰采用混合的脂肪酸甲酯标样来进行鉴定。定量方式采用面积法，定量方法为归一法。
3、谱图采集处理：采用与标准品保留时间对照的方法定性，即根据相对保留值定性；采用面积法定量，即运用面积归一法求各色谱峰面积，并计算样品中的脂肪酸含量。
4、气相色谱分析条件：调节空气到50，调节氢气到75，调节Col（柱温）到140 ℃，调节Det（检测器温度）到270 ℃，调节Aux（进样口温度）到270 ℃。柱温升温程序：140 ℃（1 min）；6 ℃/min、170 ℃（3 min）；9 ℃/ min、220 ℃（18 min）；2 ℃/min、230 ℃（2 min）。
实施例一：EPA藻油提取工艺优化单因素试验
1、溶剂对微藻油提取率的影响
在料液比为1:10、提取30 min，浸提温度45 ℃的条件下，考察不同溶剂对微藻油提取率的影响。结果（图2）表明，以乙醇作为提取溶剂的提取率，明显高于以正己烷和石油醚为提取溶剂的提取率。同样用乙醇作为提取剂，则用95%的乙醇的提取率高于75%的乙醇。
2、乙醇浓度对微藻油提取率的影响
由于油脂的脂溶性特点，作为提取溶剂的乙醇浓度不宜过低，否则产物中水溶性产物较多不利于油脂提取。因此试验选取浓度在60%以上的乙醇为溶剂。以5%浓度为梯度，从60%浓度到95%浓度共设定8个组，料液比1 : 10（g/mL），提取时间为30 min，超声辅助浸提温度为45 ℃。图3显示，当乙醇浓度在60%至90%时，提取率呈逐步上升趋势；当乙醇浓度为90%时提取率达到最大值，之后随乙醇浓度的进一步提高，提取率呈现下降趋势。因此，因此将正交试验的乙醇浓度设为85%、90%和95%。
3、浸提温度对微藻油提取率的影响
选取90%乙醇作为提取剂，超声浸提温度设定8个组，从30 ℃到65 ℃，梯度为5 ℃，料液比为1 : 10，超声浸提时间为30 min，由图4试验结果可见，随温度的上升，微藻油提取率总体呈逐渐上升趋势，提取率差值在3%以内。当温度达到50 ℃以后，提取率曲线趋于平缓，在50 ℃和65 ℃时，提取率差值小于1%。考虑到温度越高油脂越容易发生氧化，因此将正交试验的三个温度水平设为45 ℃、50 ℃和55 ℃。
4、浸提时间对微藻油提取率的影响
以90%乙醇为提取剂，温度50℃，料液比1 : 10，超声时间（min），设以下8个提取时间（min）：2、4 、6、8、10、30、60 和120 。结果（图5）显示，微藻油提取率总体上呈随时间延长而提高的趋势。在2 min到3 0 min时，上升趋势明显；30 min之后趋于平缓，各时间段的提取率相差不到2%，变化不大，超声延长时间对藻油提取率的影响并不大，30 min为最佳超声浸提时间。
5、料液比对微藻油提取率的影响
以90%乙醇为提取剂，浸提温度50 ℃，超声浸提时间30 min，设4个料液比：1:5、1:10、1 : 15和1 : 20。结果（图6）表明，随着比值的升高，微藻油提取率总体呈上升趋势。但在实际生产过程中，溶剂过多会造成浪费和生产成本增加，因此将正交试验的三个料液比水平定为：1 : 5、1 : 10和1 : 15。
6、提取次数对微藻油提取率的影响
对一次浸提后的剩渣作索氏抽提分析发现，剩渣中仍有微藻油残留。为此进行了增加提取次数提高提取率的探索。在90%乙醇、料液比1 : 10、温度为50 ℃、浸提30 min的条件下，进行了提取1~4次的效果比较。结果（图7）显示，虽然藻油的提取率总体上随着提取次数的增加呈增加趋势，但提取2次以后提取率增加幅度逐渐减小。考虑到提取次数多会导致生产过程中溶剂损耗和生产成本增加，因此将正交试验提取的次数定为1次、2次和3次。
实施例二：EPA微藻油提取工艺的正交优化试验
根据以上单因素试验结果，选择乙醇浓度、提取温度、料液比和提取次数，进行L9（34）正交试验（表1）。从正交试验结果（表2，表3），影响微藻油提取率的因素依次为：提取次数（D）＞料液比（C）＞提取温度（B）＞乙醇浓度（A），统计结果达到极显著水平（p＜0.0001）。优化工艺组合为A2B2C3D3，即乙醇浓度90%，提取温度50 ℃，料液比1 : 15，提取3次。按照此优化提取工艺条件进行验证，微藻油提取率为37.6%。
表1 正交试验因素水平
A：乙醇浓度；B：提取温度；C：料液比；D：提取次数
表2 正交试验结果与分析
A：乙醇浓度；B：提取温度；C：料液比；D：提取次数
表3 正交试验结果方差分析
| 方差来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | 显著性 |
| A | 22.65 | 2 | 11.33 | 96.87 | ＜.0001 |
| B | 37.58 | 2 | 18.79 | 160.73 | ＜.0001 |
| C | 389.54 | 2 | 194.77 | 1665.93 | ＜.0001 |
| D | 435.70 | 2 | 217.85 | 1863.30 | ＜.0001 |
| 误差 | 2.10 | 18 | |||
| 总和 | 887.58 |
A：乙醇浓度；B：提取温度；C：料液比；D：提取次数
实施例三：EPA藻油脂肪酸的气相色谱检测
对提取的藻油以及原料藻粉进行气相色谱检测。检测步骤如下：
①采用三氟化硼法甲酯化分析脂肪酸：取2 μL油脂加入三氟化硼甲醇溶液和正己烷各1.5 mL，充入氮气，密封。在干式加热器中100 ℃条件下加热60 min，冷却至室温。加入1 mL双蒸水，摇匀1 min，3000 r/min条件下离心5分钟，将上层己烷相移到一个干净的试管中，加入无水硫酸钠除去水分，移取溶液至干净试管，溶液用硅胶柱过滤。在氮气环境中吹干该过滤液，加入100 μL己烷再溶解。
②气相色谱分析：用GC-14C型气相色谱仪测定脂肪酸，用N2010色谱数据工作站采集图谱，并处理分析所采集的谱图数据。色谱峰采用混合的脂肪酸甲酯标样来进行鉴定。定量方式采用面积法，定量方法为归一法。
③谱图采集处理：采用与标准品保留时间对照的方法定性，即根据相对保留值定性；采用面积法定量，即运用面积归一法求各色谱峰面积，并计算样品中的脂肪酸含量。
④气相色谱分析条件：调节空气到50，调节氢气到75，调节Col（柱温）到140 ℃，调节Det（检测器温度）到270 ℃，调节Aux（进样口温度）到270℃。柱温升温程序：140 ℃（1 min）；6 ℃/min、170 ℃（3 min）；9 ℃/min、220 ℃（18 min）；2 ℃/min、230 ℃（2 min）。
气相色谱分析结果表明，微藻油中的主要脂肪酸成分是EPA（39.0%），此外，还含有棕榈油酸、棕榈酸、油酸、肉豆蔻酸、亚油酸。具体成分含量见表4、图8。
表4 微藻油的脂肪酸组成
| 脂肪酸成分 | 保留时间（s） | 峰面积[uV*s] | 相对含量（%） | |
| 肉豆蔻酸 | 14 : 0 | 10.14 | 37513 | 4.0% |
| 棕榈酸 | 16 : 0 | 12.50 | 166372 | 17.9% |
| 棕榈油酸 | 16 : 1 | 12.95 | 225901 | 24.3% |
| 油酸 | 18 :1n-9 | 15.60 | 47016 | 5.0% |
| 亚油酸 | 18 : 2n-6 | 16.49 | 37235 | 4.0% |
| AA | 20 : 4n- | 21.18 | 54421 | 5.8% |
| EPA | 20 : 5n- | 22.7 | 363681 | 39.0% |
AA：花生四烯酸；EPA：二十碳五烯酸。
Claims (10)
1.一种富含二十碳五烯酸拟微球藻油脂超声波辅助溶剂提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将破壁拟微球藻粉和提取溶剂混合；
（2）在水浴条件下超声浸提；
（3）超声结束后将料液分离；
（4）分离后的固体部分进行重新浸提或不进行重新浸提；
（5）分离后的液体部分进行溶剂回收即可得到藻油。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的提取溶剂为体积比90%乙醇，料液比为1:15（g/mL）。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中水浴的温度为50℃，超声时间为30min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）所述的料液分离采用离心或者抽滤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）离心转速为3000r/min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中所述重新浸提的次数为两次，总提取次数为三次。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中所述溶剂回收采用旋转蒸发的方法，并且回收的乙醇可以重复利用。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中藻油的提取率≥37%。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步，所述步骤（5）取得到的藻油进行气相色谱检测，测定其中主要脂肪酸组成，记录检测数据。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中藻油中含有的主要脂肪酸有肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸（EPA），其中EPA占总脂肪酸的质量百分比例≥39%。
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