CN111406110A - 藻类多不饱和脂肪酸的制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种制备藻类多不饱和脂肪酸的方法，包括以下步骤：a)使干藻与乙醇接触；b)除去乙醇，以获得粗制油；c)使粗制油与低级醇进行转酯化反应，生成脂肪酸烷基酯；d)提取脂肪酸烷基酯，得到含有脂肪酸烷基酯的相；e)收集含有脂肪酸烷基酯的相；以及f)使所收集的相与硅胶接触。还公开了一种有效地从粗制藻类脂肪酸烷基酯中去除杂质的方法，杂质包括叶绿素、岩藻黄素、和β‑胡萝卜素，该方法包括使粗制藻类脂肪酸烷基酯与硅胶在己烷中接触。

Description

藻类多不饱和脂肪酸的制备

技术领域

本发明涉及一种制备藻类来源的多不饱和脂肪酸的方法，该多不饱和脂肪酸不含、或基本不含包括叶绿素在内的杂质。

背景技术

多不饱和脂肪酸(PUFA)，例如ω-3脂肪酸，对于日常生活和机能非常重要。已确认ω-3脂肪酸，例如顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA)和顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)，具有降低血液中甘油三酯含量的有益效果。ω-3脂肪酸还具有其他心肌保护功能(Dyrberg,et al,ω-3Fatty Acids:Prevention and Treatment of VascularDisease；Kristensen,et al.,eds.,Bi&Gi Publ.,Verona-Springer-Verlag,London,pp.217-26,1995；O'Keefe and Harris,Am.J.Cardiology 2000,85:1239-41；Radack etal.,The effects of low doses of omega-3fatty acid supplementation on bloodpressure in hypertensive subjects:a randomized controlledtrial.Arch.Intern.Med.1991,151:1173-1180)。美国心脏协会推荐使用ω-3脂肪酸来降低心血管和心脏疾病风险。PUFA的其他有益之处包括与预防或治疗炎症、神经退行性疾病和促进认知发展相关的益处(Sugano,Michihiro,Balanced intake of polyunsaturatedfatty acids for health benefits.J.Oleo Sci.2001,50(5):305-311)。

近年来的研究还表明，EPA，而非DHA，是发挥某些上述作用的主要成分(MartinsJG.EPA but not DHA appears to be responsible for the efficacy of omega-3longchain polyunsaturated fatty acid supplementation in depression:evidence froma meta-analysis of randomized controlled trials.J Am Coll Nutr.2009Oct；28(5):525-42.；Eclov JA et al.,EPA,not DHA,prevents fibrosis in pressure overload-induced heart failure:potential role of free fatty acid receptor 4.J LipidRes.2015Dec；56(12):2297-308.doi:10.1194/jlr.M062034.Epub 2015Oct 4)。

ω-3脂肪酸通常来源于海鱼。然而，随着过度捕鱼、鱼体中环境污染物的富集、以及一部分消费者对于动物性食品的厌恶，植物来源的ω-3脂肪酸越来越受到欢迎。在植物源中，藻类生物质显示出巨大的潜力。藻类作为膳食补充剂原料或提取ω-3脂肪酸的原材料的优势在于多个方面，包括与传统陆生油类经济作物相比更高的单位面积产量，对于无其他用途的非生产型非耕地的利用，顺应于大量水资源(淡水、咸水、盐水和废水)的运用，以及对于EPA和/或DHA以及有用副产物例如多糖、蛋白、类胡萝卜素和叶绿素的生产。

藻类，包括微藻，具有较厚且硬的细胞壁，通常由多糖和蛋白构成，细胞通常被破壁，以通过提高提取溶剂与脂肪酸的接触来加强微藻胞内脂质的流出(Halim,R.；Harun,R.；Danquah,M.K.；Webley,P.A.Microalgal cell disruption for biofueldevelopment.Appl.Energy 2012,91,116–121；Cho et al.(2012).Enhancement of lipidextraction from marine microalga,Scenedesmus,associated with high-pressurehomogenization process.J Biomed Biotechnol 2012,359432)。

细胞不破壁而直接使用有机溶剂从藻细胞中提取也有报道，脂质的提取效率取决于溶剂的极性和溶剂混合物的具体组合方式(Lee et al.,Comparison of severalmethods for effective lipid extraction from microalgae.Bioresour.Technol.2010,101(Suppl.1),S75–S77；Lewis et al.,Evaluation of extraction methods forrecovery of fatty acids from lipid-producing microheterotrophs.J.Microbiol.Methods 2000,43,107–116；Lee et al.,Rapid method for the determination of lipidfrom the green alga Botryococcus braunii.Biotechnol.Tech.1998,12,553–556)。还报道过伴随着室温下的温和搅拌的乙醇提取法，所提取的粗制脂质通过添加水和己烷进行液-液分离而纯化(Yang et al.,A novel lipid extraction method from wetmicroalga Picochlorum sp.at room temperature,marine drugs,2014,12,1258-1270)。在脂质提取后，含有大量蛋白的残骸可以再利用，生产鱼饵。Fajardo等人也是先使用乙醇，后用己烷，从干燥的微藻中提取和纯化脂质(Fajardo et al.,Lipid extraction fromthe microalga Phaeodactylumtricornutum.Eur.J.Lipid Sci.Technol.2007,2,120–126.)。

US专利申请公开第20140243540号公开了一种从藻类提取油的方法，使藻浆干燥至2.6％-77.6％的预设含水量，使藻浆与极性溶剂接触，制备出藻-溶剂溶液，并把藻浆中的油提取到溶剂-油溶液中，以及从溶剂-油溶液中分离出所提取的藻油。

提取脂质的一个常见问题是，藻类中自然存在的ω-3脂肪酸是甘油三酯、糖脂和磷脂的粘稠混合物，很难浓缩。因而，甘油三酯、糖脂和磷脂形式的ω-3脂肪酸通常先在转酯化反应中转化为乙酯形式，然后进行纯化步骤例如分子蒸馏。US专利第5,130,061号公开了由粗制鱼油生产EPA和DHA的方法，通过转酯化和两步分子蒸馏的方式。美国专利第9,187,713号公开了一种使用直接转酯化来生产脂肪酸乙酯的方法，其中干燥的藻类生物质与己烷混合，后与乙醇-硫酸溶液混合，得到的反应混合物在60℃回流6小时以获得脂肪酸乙酯。

现有技术藻类脂质的另一个问题是含有大量的叶绿素，使得藻油呈现棕色或深绿色。粗制藻油中的叶绿素浓度为约5320-39998ppm，比芥花油中高117-3076倍。脂溶性的胞内叶绿素很容易被己烷一起提取到粗制油中，且可能对下游的操作和油的质量有严重的不利影响。例如，叶绿素的存在使得硅胶柱色谱层析变得复杂化，叶绿素的存在也使得油更易于光氧化，降低油的储存稳定性，造成异味。

领域内已作出努力来从藻油中去除叶绿素。传统的方法包括使用二氧化硅或粘土的物理吸附、有机溶剂提取、超临界流体提取、氧化处理和色谱层析。然而，没有一个方法能够高效且环保地完全去除叶绿素。例如，色谱层析分离非常耗时。物理吸附中用的粘土和漂白粘土常常不好过滤，需要添加昂贵的助滤剂，而且使用粘土造成大量的油损耗。美国专利第5,053,169号描述了使用二氧化硅来除去荷荷巴油中的微量杂质，特别是磷脂和相关的金属离子，以及叶绿素A。然而，荷荷巴油原本就是淡黄色的，仅含有少量的叶绿素。二氧化硅是否可用于藻油是未知的。

如美国专利第5,059,487中所述，酸处理的无形态二氧化硅也特别适用于甘油酯油中磷脂和/或叶绿素的去除，以得到商业上可接受的杂质水平的油。然而，需要去除二氧化硅吸附剂孔中的强酸。由于上述去除叶绿素的种种困难，很难高效地制备出不含或基本不含叶绿素的藻类脂肪酸。

因而，需要一种新的改善的从完整藻细胞中分离并纯化PUFA的方法，来克服上述现有技术中存在的多种不足之处。

发明内容

本发明的发明人惊讶地发现，在脂质提取前将细胞破壁不仅是非必要的，而且会造成所提取的粗制藻油中多不饱和脂肪酸的产量和浓度降低，尽管油量是增加的。发明人还发现，己烷加上硅胶可以有效地去除粗制脂肪酸乙酯中的杂质，包括叶绿素。不含、或基本不含叶绿素的ω-3脂肪酸可以以高效且便捷的方式从藻类生产出来。此外，用在杂质去除中的硅胶可以通过简单直接的乙醇清洗进行再生，降低生产成本。

因而，在一个方面，本发明提供一种制备藻类多不饱和脂肪酸的方法，包括以下步骤：

a)使干藻与乙醇接触；

b)除去乙醇，以获得粗制油；

c)使粗制油与低级醇进行转酯化反应，得到脂肪酸烷基酯；

d)例如使用己烷与水的混合物提取脂肪酸烷基酯，得到含有脂肪酸烷基酯的相；

e)收集含有脂肪酸烷基酯的相；以及

f)使所收集的含有脂肪酸烷基酯的相与硅胶接触。

藻在合适的光照和温度条件下在合适的培养基中生长，且用在上述方法中的干藻通过絮凝剂，例如氢氧化钠，将培养基的pH调整至约10.5而将藻细胞从其液体培养基中絮凝出，通过离心或过滤来收集藻物质，并使藻物质干燥。干藻也可以通过絮凝剂，例如氢氧化钠，将培养基的pH调整至约10.5而将藻细胞从其液体培养基中絮凝出，通过离心或过滤来收集藻物质，将藻物质的pH调至约pH 7，并使藻物质去盐和干燥。

干藻具有5wt％以下的水含量，并具有完整的细胞壁。藻可以是微藻，例如微拟球藻(Nannochloropsis)属的藻。在一个实施方式中，藻是盐生微拟球藻(Nannochloropsissalina)。

步骤a)的接触包括将干藻混合在乙醇中。接触可以在约78℃持续约30分钟。乙醇可以是99.5％乙醇。干藻与乙醇的重量比可以是约1:10以上且为约1:5以下。在一个实施方式中，重量比为约1:10。

乙醇在步骤b)中通过过滤和/或蒸馏除去。在一些实施方式中，蒸馏在真空旋转蒸发仪中于约55℃和约-0.07Mpa下进行。

用在转酯化中的低级醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其组合。在一个实施方式中，低级醇是乙醇，特别是99.5％乙醇。转酯化反应可以在硫酸的存在下于约70℃进行约2小时，硫酸与低级醇的体积比为约7:100。低级醇与粗制油的体积比为约5.3:1。

脂肪酸烷基酯在步骤d)中使用己烷与水的混合物提取。反应混合物与己烷以及水的体积比为约3:1:1。己烷可以是正己烷。如果需要的话，步骤d)可以进行一次或多次。在提取后，己烷相通过重力作用与水相分离。

含有脂肪酸烷基酯的相可以在步骤e)中通过离心或使用分液漏斗进行收集。

步骤f)的接触包括使含有脂肪酸烷基酯的相与硅胶混合一段时间，该时间足以除去杂质。含有脂肪酸烷基酯的相与硅胶的体积重量比为约5:1.5(ml/g)以上且为约5:0.75以下。在一些实施方式中，含有脂肪酸烷基酯的相与硅胶的比为约5:0.75、5:1、或5:1.5。在优选实施方式中，含有脂肪酸烷基酯的相与硅胶的比为约5:1或5:0.75。步骤f)中使用的硅胶为约60-100目。

本发明的方法还可以包括在硅胶接触后通过过滤从含有脂肪酸烷基酯的相中回收硅胶，回收的硅胶可以通过乙醇清洗而再生。

本发明的方法还可以包括在硅胶接触后将含有脂肪酸烷基酯的相进行进一步的精炼。进一步的精炼包括分子蒸馏和/或色谱层析分离。

脂肪酸烷基酯可以包含EPA烷基酯、DHA烷基酯、和ARA(花生四烯酸)烷基酯。在一些实施方式中，脂肪酸烷基酯包括EPA乙酯、DHA乙酯、和ARA乙酯。

在第二个方面，本发明提供一种从粗制藻脂肪酸烷基酯中有效地去除杂质的方法，杂质包括叶绿素、岩藻黄质和β-胡萝卜素，该方法包括将粗制藻脂肪酸烷基酯与硅胶在己烷中接触。

接触包括将粗制藻脂肪酸烷基酯与硅胶在己烷中混合一段时间，该时间足以除去杂质。粗制脂肪酸烷基酯与己烷的体积比可以是约1:4。粗制脂肪酸烷基酯与硅胶的体积重量比为约1:1.5(ml/g)以上且为约1:0.75以下。在一些实施方式中，粗制脂肪酸烷基酯与硅胶的比为约1:0.75、1:1、或1:1.5。在优选实施方式中，粗制脂肪酸烷基酯与硅胶的比为约1:1或1:0.75。硅胶可以为约60-100目。在接触之后，硅胶可以通过过滤回收，经乙醇清洗而再利用。在一些实施方式中，己烷为正己烷。

粗制藻脂肪酸烷基酯可以由粗制藻油与低级醇的转酯化反应得到，低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。在一个实施方式中，低级醇为乙醇，特别是99.5％乙醇。转酯化反应可以在硫酸的存在下于70℃进行约2小时，其中低级醇与粗制藻油的体积比为约5.3:1，且硫酸与低级醇的体积比为约7:100。

在转酯化反应中生成的脂肪酸烷基酯可以在杂质去除前使用己烷与水的混合物进行提取。反应混合物与己烷以及水的体积比为约3:1:1。含有脂肪酸烷基酯的己烷相可以通过重力作用与水相分离，并通过离心或使用分液漏斗进行收集。

脂肪酸烷基酯可以包含EPA烷基酯、DHA烷基酯、和ARA烷基酯。在一些实施方式中，脂肪酸烷基酯包括EPA乙酯、DHA乙酯、和ARA乙酯。

在第三个方面，本发明提供从粗制藻脂肪酸烷基酯中有效去除杂质的组合物，杂质包括叶绿素、岩藻黄质和β-胡萝卜素，该组合物包含硅胶和己烷。

硅胶为约60-100目，且可以在杂质去除后通过乙醇清洗而再生。

己烷可以是正己烷。

在使用时，组合物与粗制藻脂肪酸烷基酯接触一段时间，该时间足以去除杂质。

硅胶与己烷的重量体积比为约0.75:4(g/ml)以上且为约1.5:4以下。在一些实施方式中，硅胶与己烷的比为约1.5:4、1:4或0.75:4。在优选实施方式中，硅胶与己烷的比为约1:4或0.75:4。

粗制藻脂肪酸烷基酯可以由粗制藻油与低级醇的转酯化反应得到，低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。在一个实施方式中，低级醇为乙醇，特别是99.5％乙醇。转酯化反应可以在硫酸的存在下于70℃进行约2小时，其中低级醇与粗制藻油的体积比为约5.3:1，且硫酸与低级醇的体积比为约7:100。

在转酯化反应中生成的脂肪酸烷基酯可以在杂质去除前使用己烷与水的混合物进行提取。反应混合物与己烷以及水的体积比为约3:1:1。含有脂肪酸烷基酯的己烷相可以通过重力作用与水相分离，并通过离心或使用分液漏斗进行收集。

脂肪酸烷基酯可以包含EPA烷基酯、DHA烷基酯、和ARA烷基酯。在一些实施方式中，脂肪酸烷基酯包括EPA乙酯、DHA乙酯、和ARA乙酯。

在本发明中，硅胶可以在己烷存在下从粗制藻脂肪酸烷基酯中去除杂质例如叶绿素。已经发现杂质去除步骤可以在短时间内完成，得到不含、或基本不含叶绿素的脂肪酸烷基酯。其他杂质也与叶绿素一起去除，留下类胡萝卜素，可以在之后去除。当硅胶与粗制藻脂肪酸烷基酯处于优选的比率时，在纯化的脂肪酸烷基酯中的PUFA烷基酯例如EPA烷基酯的量和/或浓度较高。由于存在上述有利之处，本发明适用于大规模、甚至工业规模的生产。

附图说明

图1示出使用乙醇从干藻提取的粗制藻油。

图2示出使用己烷从转酯化反应混合物中提取的且已去除己烷的粗制脂肪酸乙酯。

图3示出已去除己烷的纯化脂肪酸乙酯。

具体实施方式

在公开并描述本发明的特定实施方式之前，应当理解的是本发明不限于本文公开的特定方法和材料，而可以在一定程度上变化。同时应当理解的是，本文使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而不是限制性的，本发明的范围仅由所附权利要求及其等同方式限定。

在描述并要求保护本发明时，使用以下术语。

单数形式的“一个”、“一种”和“该”、“所述”包括复数指代，除非上下文清楚指出相反情况。因而，例如，“一个步骤”包括一个或多个的该类步骤。

本文所用的术语“PUFA”或“多不饱和脂肪酸”是指任何在碳链骨架中含有多于一个双键的脂肪酸，包括ω-3脂肪酸。PUFA可以是顺式和/或反式构型。

本文所用的术语“ω-3脂肪酸”是指一类从碳链末端开始算第三个碳原子上有双键的一类PUFA。人体生理涉及的三类ω-3脂肪酸是花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。藻类来源的ω-3脂肪酸有天然的甘油三酯、糖脂和磷脂形式。这三种天然形式，与一些游离脂肪酸一起，可以在转酯化反应中转化成乙酯，而乙酯形式可在美国用作处方药和膳食补充剂。

本文所用的术语“絮凝”是指藻类以絮状物形式从混悬液中析出的过程，而术语“去絮凝”是指絮凝的相反过程，即絮凝的絮状物变得分散开。

本文所使用的术语“干藻”是指水分含量5wt％以下的藻。

本文所用的术语“转酯”和“转酯化”是指由另一种醇来交换酯的烷氧基的过程，更具体而言，是将藻油，例如甘油三酯，转化为脂肪酸烷基酯和甘油的过程。转酯化可以通过使用传统的化学方法例如酸或碱催化的反应进行，或通过使用酶催化反应进行。

本文使用的术语“硅胶”是指颗粒状、玻璃质、多孔形式的二氧化硅。其无毒、非易燃，在一般使用中没有反应性且稳定。

本文所用的术语“叶绿素”是指在蓝藻细菌以及藻类和植物的叶绿体中发现的一些类似绿色色素中的任意种。叶绿素是光合作用所必须的，使得植物能够吸收光能。

浓度、含量和其他数据在本文中可以以范围格式呈现。应当理解的是，该范围格式仅出于方便和简洁的目的而使用，应当灵活地解读成不仅包括明确作为范围上下限的数值，还包括在该范围内的所有个体数值或子范围，就如同各个体数值和子范围也明确指出一样。例如，约1％-约20％的重量范围应当解读成不仅包括明确指出的1％-20％的浓度上下限，还包括个体浓度如2％、3％、4％，以及子范围例如5％-15％、10％-20％等。

PUFA和ω-3脂肪酸

由于与服用PUFA相关的重要健康益处，PUFA是众多研究的研究对象。PUFA包括α-亚麻酸(ALA，18:3ω-3)、γ-亚麻酸(GLA，18:3ω-6)、二十碳五烯酸(EPA，20:5ω-3)、花生四烯酸(ARA，20:6ω-6)、二十二碳五烯酸(22:5ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6ω-3)。根据Adarme-Vega及其同事的研究，这些长链ω-3PUFA提供显著的健康益处，特别是在减少心脏病如心律失常、中风和高血压方面(Adarme-Vega TC,Lim DKY,Timmins M,Vernen F,Li Y.Schenk PM.Microalgalbiofactories:a promising approach towardssustainable omega-3fatty acid production.Microb Cell Factories.2012；11:1–10)。同时，它们对于抑郁、类风湿关节炎、哮喘也有益处，且可以用于治疗炎症疾病如类风湿、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、狼疮和囊肿性纤维化。此外，在怀孕妇女中，EPA和DHA的足量摄取对于胎儿大脑的健康发育是关键的。此外，ARA和DHA是正常生长和脑部功能发育所必须的，EPA是调节一些生物机能和防止心律失常、动脉粥样硬化、心血管疾病和癌症所必要的(Pulz MO.Gross W.Valuable products from biotechnology ofmicroalgae.ApplMicrob Biotech.2004；65:635–648)。

鱼油是商业生产ω-3脂肪酸的主要来源，但具有不可持续性。鱼油的质量取决于鱼的种类、捕鱼点的季节/气候和地理位置、以及鱼的饮食质量。此外，鱼油不适合素食主义者，鱼油的味道不被消费者喜欢。在一些情况下，有被脂溶性环境污染物污染的危险(Ryckebosch E,Bruneel C,Muylaert K.Foubert I.Microalgae as an alternativesource of omega-3long chain polyunsaturated fatty acids.Lipid Technol.2012；24:128–130)。因此，藻类是PUFA如ω-3脂肪酸的另一可选来源。

藻类可以在其细胞构造中以油或淀粉形式储存能量。存储的油可以达到藻类重量的60％之多。已经鉴定出一些高产油或淀粉的种类，且已测试其生长条件。在藻类中，EPA存在于硅藻(Bacillariophceae(diatoms))、绿藻(Chlorophyceae)、金藻(Chrysophyseae)、隐藻(Cryptophyceae)、大眼藻(Eustigamatophyceae)和真绿藻(Prasinophyceae)纲中(Singh S,Kate BN.Banerjee UC.Bioactive compounds from cyanobacteria andmicroalgae:an overview.Crit Rev Biotechnol.2005；25:73–95)。

在本发明中，盐生微拟球藻(Nannochloropsis salina)在中国南方培育，用于生产脂肪酸，特别是PUFA。该藻种有丰富的EPA，且包含小比例的其他脂肪酸例如C_16:1和C_16:1脂肪酸。该藻种中的DHA水平可忽略。其他微拟球藻属的种类也可以产生大量的EPA，而几乎没有DHA。

絮凝和去絮凝

在脂质提取前，将藻类生物质絮凝、去絮凝、去盐和干燥。

具体而言，首先用絮凝剂例如氢氧化钠将培养基的pH调节到pH10.5而将藻从液体培养基中絮凝出来。通过离心或过滤收集藻质，然后通过调节pH到约pH7而去絮凝，去盐，然后干燥。

絮凝主要用于减少将要在分离器或过滤器中处理的含藻培养基的体积，可加速藻收集程序，并延长分离器或过滤器的使用寿命。在培养基的pH值变成10或10.5后，藻开始沉降。沉淀物可以之后使用分离器收集。需要注意的是，在使用人工海水替代真正海水作为培养基的时候，使用较少的絮凝剂，因为人工海水包含较少的会与OH^-反应的离子。例如，1吨含藻真海水需要约550g NaOH，而1吨含藻人工海水仅需要约200-300g。在一些实施方式中，首先加入部分的絮凝剂，直到培养基的pH值为例如10，将液体培养基通过泵等移至另一容器，而将形成的固体留下。继续添加絮凝剂，继续在新容器中絮凝藻生物质。

去絮凝过程意在减少或去除藻生物质中的盐、金属氢氧化物和金属氧化物，这些杂质的存在可能会使终产物无法达到作为膳食补充剂或药物成分的质量。当使用稀HCl时，原培养基中离子与絮凝剂形成的固体溶解在溶液中，在离心后随上水层弃掉。

脂质提取

当前，藻油提取方法包括机械挤压、均化、研磨、和溶剂提取。最常用于脂质提取的溶剂是氯仿-甲醇、己烷、己烷-异丙醇或其他相互微溶的溶剂混合物。基于脂质的极性和/或溶解度的不同，必须选择合适的溶剂或混合物用于提取。

当前发明采用环保提取法，使用乙醇，乙醇是99.5％乙醇或更纯的乙醇。乙醇是便宜安全的溶剂，对脂质复合物具有强亲和力。

具体而言，干藻与99.5％乙醇在搅拌下接触。干藻与乙醇的比率、接触的时间和温度，可以由本领域技术人员基于藻种和一些其他因素确定和调整。干藻与99.5％乙醇的重量比可以为1:20以上、1:18以上、1:16以上、1:14以上、或1:12以上，且为1:8以下、1:7以下、1:6以下、1:5以下、或1:4以下。在一个实施方式中，比率为1:10以上、1:5以下。在一个实施方式中，比率为1:10。当比率设置为1:10时，提取步骤中的EPA回收率为约80％。当比率调整为1:5时，EPA回收率减少到约62％。

干藻与乙醇之间的接触可以持续10分钟以上、20分钟以上、30分钟以上、1小时以上、或2小时以上，且为5小时以下、或4小时以下。在一个实施方式中，干藻与99.5％乙醇接触30分钟。接触可以在60-85℃、优选78℃下进行。

在与乙醇接触前，将藻干燥。湿藻带来水分，会降低提取效率和/或使乙醇再利用程序复杂化。

在脂质提取之后，通过过滤和/或蒸馏除去乙醇。

报道称细胞破壁可以加强提取溶剂与脂肪酸的接触，从而促使胞内脂质从微藻中释放。因而，为收集更多的脂肪酸或PUFA，发明人将藻研磨成约2-3μm大小以破坏细胞壁。令人惊讶的是，这样做的结果是，与未研磨的藻相比，尽管粗制油的量更高，得到的脂肪酸，特别是EPA却更少。因此，在本发明中，为以高EPA产量和回收率生产含EPA的产品，藻优选为具有完整细胞壁的粗制藻。

脂质定量

脂质定量的方法在领域内公知。大多报道脂质确认的文献通常使用色谱法，使用火焰离子化检测仪。当前使用的一些其他技术为例如荧光法、比色法、拉曼光谱法、带质谱检测器的气相色谱、带脉冲安培检测的高效液相色谱(HPLC)、反相HPLC、在205nm的UV检测、蒸发光散射检测、常压化学电离质谱、核磁共振、近红外和傅里叶转换红外光谱(Cooksey,K.E.,Guckert,J.B.,Williams,S.A.,and Callis,P.R.(1987)Fluorometricdetermination of the neutral lipid content of microalgal cells using NileRed.J Microbiol Methods 6:333–345；Lee,S.J.,Yoon,B.-D.,and Oh,H.-M.(1998)Rapidmethod for the determination of lipid from the green algaBotryococcusbraunii.Biotechnol Tech 12:553–556；Knothe,G.(2001)Analyticalmethods used in the production and fuel qualityassessment of biodiesel.TransASAE 44:193–200；Meher,L.C.,VidyaSagar,D.,and Naik,S.N.(2006)Technical aspectsof biodiesel production by transesterification–a review.Renew Sustain EnergyRev 10:248–268；Elsey,D.,Jameson,D.,Raleigh,B.,and Cooney,M.J.(2007)Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.J Microbiol Methods 68:639–642；Huang,Y.Y.,Beal,C.M.,Cai,W.W.,Ruoff,R.S.,and Terentjev,E.M.(2010)Micro-Raman spectroscopy of algae:composition analysis and fluorescencebackground Behavior.BiotechnolBioeng 105:889–898；Laurens,L.M.L.,and Wolfrum,E.J.(2010)Feasibility of spectroscopic characterization of algal lipids:chemometric correlation of NIRand FTIR spectra with exogenous lipids in algalbiomass.Bio Energy Res 4:22–35；Wawrik,B.,and Harriman,B.H.(2010)Rapid,colorimetric quantification of lipid from algal cultures.J Microbiol Methods80:262–266；Cheng,Y.-S.,Zheng,Y.,and VanderGheynst,J.(2011)Rapid quantitativeanalysis of lipids using a colorimetric method in a microplate format.Lipids46:95–103；Davey,P.T.,Hiscox,W.C.,Lucker,B.F.,O’Fallon,J.V.,Chen,S.,and Helms,G.L.(2012)Rapid triacylglyceride detection and quantification in live micro-algal cultures via liquid state 1H NMR.Algal Res 1:166–175；De la HozSiegler,H.,Ayidzoe,W.,Ben-Zvi,A.,Burrell,R.E.,and McCaffrey,W.C.(2012)Improving thereliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements inmicroalgal cultures.Algal Res 1:176–184)。

在本申请中，经GC分析进行脂质定量。

转酯化

粗制藻油不便直接用作膳食补充剂，因为所需的PUFA如EPA和DHA的浓度很低。

藻油中的PUFA是天然甘油三酯、糖脂和磷脂的混合物。例如，盐生微拟球藻中的ω-3脂肪酸包含约23％甘油三酯、约59％糖脂和约18％磷脂，几乎没有游离脂肪酸。所有这三种天然ω-3脂肪酸的分子量都很大。黏性粗制油的处理过程例如脂质分离和纯化非常耗时，大分子量的PUFA会使分子蒸馏的条件变得很苛刻。因而，为浓缩EPA和/或其他PUFA，例如，可以使用转酯化反应将三种天然形式与游离脂肪酸转化为烷基酯形式。

在现有技术中，将甘油三酯转酯化以制备酯会使用催化剂，例如酶(Fjerbaek etal.,A Review of the Current State of Biodiesel Production Using EnzymaticTransesterification,Biotechnology and Bioengineering,Apr.2009,vol.102,No.5,pp.1298-1315；Modi et al.,Lipase-mediated Conversion of Vegetable Oils intoBiodiesel Using Ethyl Acetate as Acyl Acceptor,Bioresource Technology,98,2007,pp.1260-1264)；酸/碱催化剂(Rodri et al,Biodiesel Fuels from VegetableOils:Transesterification of CynaraCarduculus L.Oils with Ethanol(7),443-450；Alamu et al.,"Effect of Ethanol-palm Kernel Oil Ratio on Alkali-catalyzedBiodiesel Yield,"Fuel,87,2008,pp.1529-1533)；或多相催化剂(Zabeti et al.,Activity of Solid Catalysts for Biodiesel Production:A Review,Fuel ProcessingTechnology,90,2009,pp.770-777)。

在当前申请中，转酯化反应用选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的低级醇进行。在一个实施方式中，低级醇为乙醇，特别是99.5％乙醇。乙醇的纯度优选为高于或等于99.5％。反应条件可以经本领域技术人员确定和/或调整。例如，硫酸可以用来催化反应，硫酸与低级醇的体积比为7:100。在一些实施方式中，转酯化反应在70℃进行2小时。在一些实施方式中，低级醇与粗制油的体积比为5.3:1。

如果用藻，而非藻中提取的脂质，直接进行转酯化反应，尽管时间较短，粗制脂肪酸烷基酯中的PUFA产量和浓度都会显著降低。此外，藻蛋白和多糖会被反应物和/或硫酸污染，需要更加复杂的方法来纯化这些副产物。因此，在本发明中，优选在用乙醇从藻粉中提取的藻油后进行转酯化反应。

脂肪酸烷基酯的提取

在转酯化之后，使用己烷和水，将脂肪酸烷基酯与催化剂和一些其他水溶性杂质分离。反应混合物与己烷以及水的比率可以由本领域技术人员确定。在一些实施方式中，反应混合物与己烷以及水的体积比为3:1:1。

分离可以在分液漏斗中经重力作用进行，其中会形成三层，乳化相形成在上己烷相与下水相之间。乳化相可以再次与己烷混合，以进一步提取脂肪酸烷基酯。含有脂肪酸烷基酯的己烷相用水进一步清洗，以除去一些杂质，例如水溶性催化剂。

与水不混溶的一些其他有机溶剂也可以替代己烷使用，例如石油醚和环己烷等。

杂质(叶绿素)去除

粗制藻油中的叶绿素浓度为5320-39998ppm，比芥花油高出117-3076倍。由于大量叶绿素的存在，藻油呈现暗绿色，甚至黑色，转酯化之后的粗制藻脂肪酸烷基酯呈暗棕色。

叶绿素很容易与脂肪酸烷基酯一起被己烷提取出来，对下游纯化过程有严重的负面影响。例如，叶绿素的存在使得硅胶柱层析复杂化。

从植物油中去除叶绿素的传统方法包括物理吸附、氧化处理和磷酸脱胶(Issariyakul,T.；Dalai,A.K.Biodiesel Production from Greenseed CanolaOil.Energy Fuels 2010,24,4652–4658.；Bahmaei,M.；sadatSabbaghian,E.；Farzadkish,E.Development of a method for chlorophyll removal from canola oil usingmineral acids.J.Am.Oil Chem.Soc.2005,82,679–684.；Ghazani,S.；Marangoni,A.Minorcomponents in canola oil and effects of refining on these constituents:Areview.J Am.Oil Chem.Soc.2013,90,923–932)。Baroi等人报道，催化剂可以通过在转酯化反应过程中从原料(已除去75.56％叶绿素)中吸附叶绿素而改进生物柴油的质量(Baroi,C.；Dalai,A.K.Simultaneous esterification,transesterification andchlorophyll removal from green seed canola oil using solid acidcatalysts.Catal.Today2013,207,74–85)。Bahmaei等人的另一个研究显示，高达30ppm的叶绿素浓度可以通过将粗制芥花油与磷酸硫酸(2:0.75，v/v)的0.4wt％混合物于50℃混合5分钟而降至低于0.01ppm的量(Bahmaei,M.；Sabbaghian,E.；Farzadkish,E.Developmentof a method for chlorophyll removal from canola oil using mineralacids.J.Am.Oil Chem.Soc.2005,82,679–684)。Przybylski等人报道，芥花油的总叶绿素含量在用活性漂白粘土漂白后降至低于1ppm(Przybylski,R.；Mag,T.；Eskin,N.A.M.；McDonald,B.E.Canola Oil.In Bailey’s Industrial Oil and Fat Products,6th ed.；Shahidi,F.,Ed.；Wiley-Interscience:Hoboken,NJ,USA,2005)。通常而言，粗制芥花油中叶绿素的浓度为13–30ppm(Diosady,L.L.Chlorophyll removal from edibleoils.Int.J.Appl.Sci.Eng.2005,2,81–88)，比藻油中的叶绿素量低得多。

同时还发现某些无形态二氧化硅特别适合去除荷荷巴油中的微量污染物，特别是磷脂和相关金属离子，以及叶绿素A，如美国专利5,053,169中所述。绿色着色度的降低为市场要求所偏好。然而，荷荷巴油原本就是淡金色的，仅含有少量叶绿素，远远低于藻油中的含量。酸处理的无形态二氧化硅还特别适用于从甘油中去除磷脂和/或叶绿素，以得到市场上可接受量污染物的油，如US专利5,059,487所述。二氧化硅吸附剂孔中的强酸大大增强了其去除叶绿素的能力。然而，强酸可能会最终污染藻类终产品。

有时候，当需要从藻油中去除高浓度叶绿素时，可以采用非二氧化硅的其他叶绿素吸附剂。因为大多数通过结垢、毒化或竞争吸附不利地影响通常用于色素去除的吸附剂(中性土、活性土、和碳)对叶绿素的吸附的微量污染物(例如皂类和磷脂)，可以使用二氧化硅在精炼过程中有选择地去除，在与二氧化硅联合使用时，叶绿素吸附剂的效率会大大提高。特定吸附剂以这种方式组合使用会改进加工处理和过程控制并同时改进精炼油的质量。

如上所述，藻油包含高浓度的叶绿素。有机溶剂提取和超临界流体提取可用于藻油的叶绿素去除。丙酮无法高效去除叶绿素，而甲醇会造成叶绿素A降解产物的形成。二甲基亚砜(DMF)是优于甲醇、乙醇和丙酮的提取溶剂，而本身却有毒性(S.W.Jeffrey,R.F.C.Mantoura,and S.W.Wright,Eds.,Phytoplankton Pigments in Oceanography:Guidelines to Modern Methods,UNESCO,Paris,Farnce,1997.；D.P.Sartory andJ.U.Grobbelaar,“Extraction of chlorophyll a from freshwater phytoplankton forspectrophotometric analysis,”Hydrobiologia,vol.114,no.3,pp.177–187,1984.；D.Simon and S.Helliwell,“Extraction and quantification of chlorophyll a fromfreshwater green algae,”Water Research,vol.32,no.7,pp.2220–2223,1998；R.F.C.Mantoura and C.A.Llewellyn,“The rapid determination of algalchlorophyll and carotenoid pigments and their breakdown products in naturalwaters by reverse-phase highperformance liquid chromatography,”AnalyticaChimicaActa,vol.151,no.2,pp.297–314,1983)。

超临界流体提取是比有机溶剂提取更加环保的叶绿素去除方法，但是需要一整套设备，耗能巨大。

此外，Sathish and Sims(2012)表示，湿法脂质提取能够在经由沉淀的藻脂质提取中去除大部分的叶绿素污染物(Sathish,A.；Sims,R.C.Biodiesel from mixed culturealgae via a wet lipid extraction procedure.Bioresour.Technol.2012,118,643–647)。Chen等指出，在旋转蒸发仪中用漂白粘土处理，能将栅藻(Scenedesmus sp)中的叶绿素和总类胡萝卜素的含量分别降至40.3和199.0ppm(Chen,L.；Liu,T.；Zhang,W.；Chen,X.；Wang,J.Biodiesel production from algae oil high in free fatty acids by two-step catalytic conversion.Bioresour.Technol.2012,111,208–214)。

可以看出，上述的领域内公知方法并不适用于大规模生产。

本发明的发明人已经找到了一种能够在数分钟内一步去除几乎所有色素的方法，包括叶绿素、岩藻黄质和β-胡萝卜素。具体而言，在当前发明中，从转酯化反应中得到的脂肪酸烷基酯首先用己烷和水提取，将一些杂质留在水相中。之后，含有脂肪酸烷基酯的己烷相与硅胶接触。己烷使得硅胶对色素呈现亲和性。仅用约5分钟时间，所有、或几乎所有色素，连同一些其他杂质，被硅胶吸附，并通过过滤回收硅胶而将色素从脂肪酸烷基酯中去除。优选进行搅拌来加强接触。

大量的硅胶利于叶绿素(杂质)去除，但会造成一定程度的PUFA损失。如以下实施例所示，硅胶存在优选量，即，粗制脂肪酸烷基酯与硅胶的体积重量比优选为1:0.75(ml/g)或1:1。使用该比率时，在杂质去除后能回收90％或更多的PUFA例如EPA。

在本发明中使用的硅胶为60目以上、65目以上、或70目以上，且为100目以下、95目以下、或90目以下。硅胶可以简单地通过乙醇清洗而再生。

实施例

annochloropsis salina)在开放池的人工海水中生长7天，人工海水含22g/LNaCl、2.44g/L MgSO₄·7H₂O、0.6g/L KCl、0.25g/L尿素、0.3g/L CaCl₂·2H₂O、4.4mg/LNaH₂PO₄·2H₂O、0.1g/L NaHCO₃、0.75mg/L Na₂EDTA·2H₂O、0.097mg/L FeCl₃·6H₂O、0.5mg/LH₃BO₃、1mg/LMnSO₄、0.05mg/LZnSO₄、0.02mg/LCoCl₂·6H₂O、和0.1mg/L Na₂MoO₄·2H₂O。

取1吨藻液，加入6M NaOH溶液，将pH调节至10.5，在此pH值下藻开始沉降。三小时后，弃上水层，将剩余物经孔径25μm的Miracloth滤布过滤，得到约1kg的藻泥，含水量为约80wt％。使用干燥机(ZPG-G智能喷雾干燥机)对藻泥进行喷雾干燥2小时，进口处的空气温度为180℃，出口处的空气温度为90℃，得到146g含水量5wt％以下的干藻。

称得25g所得的干藻，混合在250g的99.5％乙醇中。得到的混悬液于78℃在连接回流冷凝器的三口圆底烧瓶中用磁力搅拌器搅拌30分钟，以提取脂质。之后，使用50μm孔径的滤纸在连接抽吸泵的布氏漏斗中进行过滤，以除去固体，向该固体加入250g的99.5％乙醇，重复脂质提取步骤。含有脂质的液体与之前得到的滤液混合，得到641ml深绿色含脂液体。深绿色液体之后使用50μm孔径的滤纸在连接抽吸泵的布氏漏斗中进行过滤来除去固体，之后在真空旋转蒸发仪中于-0.07MPa的真空度和55℃下蒸馏，除去乙醇。在蒸馏步骤后共得到9.73g黏性油状粗制藻油，如图1所示。

在藻油中加入51ml的99.5％乙醇和3.57ml的100％硫酸。混合物于70℃进行两小时的转酯化反应。在转酯化之后，在分液漏斗中，对得到的液体加入20ml己烷和20ml水。几分钟后出现三层，即上己烷相、下水相和中间的乳化相。收集含有所生成的脂肪酸乙酯的己烷相，用水洗4-5次，己烷相：水＝1:1，v/v，直至pH变中性。乳化相使用4ml己烷进行再次提取，之后水洗，直至pH变为中性。由于不可避免的己烷相损失，最终总共得到约14.7ml己烷相，含有约2.63g/2.94ml粗制脂肪酸乙酯。

当通过持续流动的氮气去除己烷后，粗制脂肪酸乙酯呈现为深棕色液体，如图2所示。

实施例2藻PUFA乙酯的纯化

向实施例1得到的约14.7ml己烷相(含有约2.63g/2.94ml粗制脂肪酸乙酯)分别加入8.82g、5.88g、4.41g、2.94g或2.20g硅胶(60-100目，柱层析硅胶(精炼)，青岛海洋化工有限公司)，以去除杂质，例如叶绿素。得到的混合物使用涡旋振荡器激烈摇晃5分钟。之后，己烷相变为黄色。己烷相用50μm孔径滤纸在漏斗中于室温进行过滤，除去硅胶。通过连续流动的氮气除去己烷，得到纯化的脂肪酸乙酯。

粗制的和纯化的脂肪酸乙酯进行GC分析。上述GC分析在带有火焰离子化检测仪的气相色谱仪(Ultra Trace，Thermo Scientific，美国)中进行。

柱：DB-23(Agilent Technologies，美国)

60m×0.25mm，膜厚250nm

载气：氮，2ml/min(恒流)

炉：50℃，1min，

50-170℃，40℃/min，

170℃，1min，

170-210℃，18℃/min，

210℃，28min；

进样器：分流比50:1，270℃；

检测器：FID，280℃，空气350ml/min，氢气35ml/min。

粗制的和纯化的脂肪酸乙酯的组成在以下表1中示出。

表1.粗制/纯化脂肪酸乙酯的组分

	粗制脂肪酸乙酯	纯化的脂肪酸乙酯(经2.94g硅胶处理)
			类胡萝卜素(wt％)	19％	25％
EE-EPA(wt％)	22％	28％
			EE-其他FA(wt％)	35％	47％
杂质(wt％)	24％	～0％

从表1可以看出，硅胶吸附了几乎所有杂质，包括叶绿素，留下了EPA和其他脂肪酸以及类胡萝卜素。

以下表2示出了经不同量硅胶处理的纯化脂肪酸乙酯中的EPA含量、EPA浓度以及EPA回收率。

表2.纯化脂肪酸乙酯中的EPA产量、浓度和回收率

*EPA回收率＝纯化脂肪酸乙酯中的EPA产量/粗制脂肪酸乙酯中的EPA产量×100％

当使用8.82g、5.88g或4.41g硅胶时，叶绿素从脂肪酸乙酯中完全去除。然而，在这些情况下，一些脂肪酸乙酯被硅胶吸附并损失，EPA回收率在约90％，甚至更低。

当使用更少的，例如2.94g或2.20g硅胶时，留有少量叶绿素，但是得到更多EPA乙酯。EPA回收率表明在上述两种情况的杂质去除中没有EPA乙酯损失。

实施例3藻PUFA乙酯的大规模制备和纯化

如同实施例1所述，从藻中制备脂肪酸乙酯，其中使用700g干藻，且所有的试剂量相应增加。之后，将所得的粗制脂肪酸乙酯如同实施例2所述进行纯化，其中粗制脂肪酸乙酯与61.6g硅胶(己烷相：硅胶(ml/g，v/wt)＝5:0.75)接触5分钟。

实施例3的纯化脂肪酸乙酯如图3所示，包含25.93g EPA乙酯，其浓度为27.46wt％，回收率为92.6％，与小规模时近似，表明本发明可在大规模应用。

实施例4去絮凝减少藻生物质中的盐、金属氢氧化物和金属氧化物

盐生微拟球藻在开放池中生长7天。之后，收集1吨藻液，添加约1042ml的6M NaOH，将pH值调节至约10.5，藻在该pH开始沉降。两小时之后，弃掉上水层，将留下的进行离心，5500rpm，5分钟，得到约2000g水分含量为85％的沉淀物。

向沉淀物添加约600ml稀HCl(0.5vol％)，将pH值调节至约7.0。向得到的混悬液添加2400ml水，溶解氯化钠或一些其他盐，之后再次离心，5500rpm，5分钟。弃去上水层，收集沉淀物，并称重。得到约300g水分含量85％的沉淀物，在干燥机中喷雾干燥2小时，进口处空气温度为180℃，出口处空气温度为90℃，获得约146g水分含量5wt％以下的干藻。

与实施例1相比，去絮凝过程减少/除去了含在藻生物质中的杂质，包括大部分的氯化钠和金属氢氧化物/氧化物。

比较例1细胞破壁降低PUFA产量/浓度

盐生微拟球藻在开放池中生长7天。之后，收集1吨藻液，添加6M NaOH，将pH值调节至10.5，藻在该pH开始沉降。三小时之后，弃掉上水层，将剩余物进行过滤，使用孔径为25μm的Miracloth，得到1kg水分含量80％的藻泥。使用干燥机(ZPG-G智能喷雾干燥机)对藻泥喷雾干燥2小时，进口处的空气温度为180℃，出口处的空气温度为90℃，得到146g含水量5wt％以下的干藻。

所得的干藻用研磨机(CWM20振动研磨机，380V/Hz)于960rpm进行研磨，使颗粒大小为2-3μm。

称量得到25g经研磨的藻。使用实施例1中所述的方法，从藻粉中提取出10.37g粗制油。

实施例1和比较例1中得到的粗制油进行转酯化反应，将天然脂肪酸转化为脂肪酸甲酯。如下进行转酯化反应。将5g粗制油转移到Agilent烧瓶中，加入1ml的1M硫酸-甲醇溶液(通过添加5ml(9.2g)浓硫酸和95ml 100％甲醇而制备)。使烧瓶充满N₂，在沸水中加热1小时。在冷却之后，向烧瓶加入200μl蒸馏水。之后，使用200μl正己烷在分液漏斗中提取脂肪酸甲酯。总共进行三次提取，将所收集的己烷相合并在一起。用流动氮气除去己烷，将剩余液体溶解在100μl正己烷中。从所得的溶液中取1μl用于GC分析。

GC分析的条件同上。

实施例1和比较例1的粗制油重量和EPA产量/浓度列于以下表3中。

表3.粗制油量和EPA含量/浓度

	油重(g)	EPA产量(g)	EPA浓度(wt％)
				实施例1	9.73	0.906	9.31
比较例1	10.37	0.838	8.08

令人惊讶的是，由研磨后细胞破壁的细藻粉得到相对少的EPA量或浓度。

包含在实施例1和比较例1粗制油中的脂肪酸的类型和浓度详细示于表4。

表4.粗制油中脂肪酸的类型和浓度

从表4可以看出，从研磨后藻粉中提取的大部分脂肪酸的浓度较低，表明细胞破壁的不利影响。

比较例2.直接用藻进行转酯化获得较少PUFA乙酯

盐生微拟球藻在开放池中生长7天。之后，收集1吨藻液，添加6M NaOH，将pH值调节至10.5，藻在该pH开始沉降。两小时之后，弃掉上水层，将剩余物进行过滤，使用孔径为25μm的Miracloth，得到1kg水分含量80％的藻泥。使用干燥机(ZPG-G智能喷雾干燥机)对藻泥喷雾干燥2小时，进口处的空气温度为180℃，出口处的空气温度为90℃，得到146g含水量5wt％以下的干藻。

将一些获得的干藻使用研磨机(CWM20振动研磨机，380V/Hz)于960rpm进行研磨，使颗粒大小为2-3μm。

分别称得25g粗藻和25g研磨藻，加入250g乙醇(99.5％)和22.15ml硫酸(100％)。混合物于70℃转酯化反应2小时，伴随有磁力搅拌器的搅拌。如实施例1所述，使用己烷提取脂肪酸乙酯。在真空旋转蒸发仪中于-0.07MPa的真空度和45℃下蒸馏，蒸发己烷，剩余的粗制脂肪酸乙酯进行GC分析。

实施例1和比较例2的粗制脂肪酸乙酯中的EPA产量和EPA浓度示于表5。

表5.粗制脂肪酸乙酯中的EPA含量和浓度

当在所提取的藻油上进行转酯化反应时，EPA产量和EPA浓度都高得多。

比较例3.硅胶比漂白粘土更适于杂质去除

如实施例1和实施例2所述制备和纯化脂肪酸乙酯，除使用漂白粘土而非硅胶来从粗制脂肪酸乙酯中去除杂质外。

以下表6示出在杂质去除中使用不同量漂白粘土时纯化脂肪酸乙酯中的EPA产量、浓度和回收率。

表6.纯化脂肪酸乙酯中的EPA产量、浓度和回收率

漂白粘土I(加强版，骏宸膨润土科技有限公司，200目)；漂白粘土II(标准版，骏宸膨润土科技有限公司，200目)；漂白粘土III(特别版，骏宸膨润土科技有限公司，200目)

漂白粘土的杂质(叶绿素)去除能力比硅胶差。此外，当使用漂白粘土时，如表6所示，EPA产量和浓度要低得多。EPA回收率也表明使用漂白粘土去除杂质时会损失很多PUFA。

Claims (19)

1.一种大规模制备藻类多不饱和脂肪酸的方法，包括以下步骤：

a)使干藻与乙醇接触；

b)除去乙醇，以获得粗制油；

c)使粗制油与低级醇进行转酯化反应，得到脂肪酸烷基酯；

d)提取脂肪酸烷基酯，得到含有脂肪酸烷基酯的相；

e)收集含有脂肪酸烷基酯的相；以及

f)使所收集的含有脂肪酸烷基酯的相与硅胶接触。

2.如权利要求1所述的方法，其中干藻的含水量为5wt％以下。

3.如权利要求2所述的方法，其中干藻通过将液体培养基的pH调整至约pH 10.5而将藻细胞从其培养基中絮凝出来，通过离心或过滤来收集藻物质，并将藻物质干燥而得到。

4.如权利要求2所述的方法，其中干藻通过将液体培养基的pH调整至约pH10.5而将藻细胞从其培养基中絮凝出来，通过离心或过滤来收集藻物质，将藻物质的pH再调节至约pH7，并将藻物质去盐和干燥而得到。

5.如权利要求1所述的方法，其中干藻为微拟球藻(Nannochloropsis)属的细胞壁完整的藻。

6.如权利要求5所述的方法，其中藻为盐生微拟球藻(Nannochloropsis salina)。

7.如权利要求1所述的方法，其中，步骤a)中的接触包括将干藻在99.5％乙醇中于78℃混合30分钟，干藻与99.5％乙醇的重量比为1:10-1:5。

8.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)中乙醇通过过滤和/或蒸馏去除。

9.如权利要求1所述的方法，其中转酯化反应在硫酸存在下于70℃进行2小时，低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。

10.如权利要求1所述的方法，其中步骤d)中脂肪酸烷基酯使用己烷和水进行提取，反应混合物与己烷以及水的体积比为3:1:1。

11.如权利要求1所述的方法，其中步骤f)中的接触包括使含有脂肪酸烷基酯的相与硅胶混合一段时间，该时间足以去除杂质。

12.如权利要求1所述的方法，其中含有脂肪酸烷基酯的相与硅胶的体积重量比为5:1.5(ml/g)以上，且为5:0.75以下。

13.如权利要求1所述的方法，其中该方法还包括在步骤f)后从含有脂肪酸烷基酯的相中回收硅胶。

14.如权利要求1所述的方法，其中脂肪酸烷基酯包括EPA烷基酯、DHA烷基酯和ARA烷基酯。

15.一种有效地从粗制藻类脂肪酸烷基酯中去除杂质的方法，杂质包括叶绿素、岩藻黄素、和β-胡萝卜素，该方法包括使粗制藻类脂肪酸烷基酯与硅胶在己烷中接触。

16.如权利要求15所述的方法，其中接触包括使粗制藻类脂肪酸烷基酯与硅胶在己烷中接触一段时间，该时间足以去除杂质。

17.如权利要求15所述的方法，其中粗制脂肪酸烷基酯与己烷的体积比为1:4。

18.如权利要求15所述的方法，其中粗制脂肪酸烷基酯与硅胶的体积重量比为1:1.5(ml/g)以上，且为1:0.75以下。

19.如权利要求15所述的方法，其中粗制藻类脂肪酸烷基酯由粗制藻油与低级醇的转酯化反应得到，低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，转酯化反应在硫酸存在下于70℃进行2小时，在转酯化反应中生成的脂肪酸烷基酯通过使用己烷和水来提取，反应混合物与己烷以及水的体积比为3:1:1。

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