CN106248828A - 一种用于鉴别分析蜚蠊中成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于鉴别分析蜚蠊中成分的方法,其具体步骤包括:(1)收集雄成虫、雌成虫、刚蜕皮成虫、7‑8龄若虫和3‑4龄若虫五个虫态的蜚蠊样品;(2)不同虫态的蜚蠊样品的制备:乙酸乙酯提取后经甲酯化处理;(3)GC‑MS联用分析条件的优化:通过对进样口温度、进样量、进样模式的选择,优化分析蜚蠊不同虫态中成分的GC‑MS条件;(4)鉴别每个虫态下的蜚蠊所特有的成分。本方法灵敏度高,分离成分效果好,鉴别结果稳定可靠,充分发掘了蜚蠊不同虫态中的独有成分及共有成分,利于提高蜚蠊的研究利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于鉴别分析蜚蠊中成分的方法,特别涉及一种采用GC-MS联用技术分析蜚蠊中脂溶性成分的方法。
背景技术
蜚蠊,亦称美洲大蠊(Periplaneta americana),俗称蟑螂,是蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫。蜚蠊是传统的中药材,以干燥和鲜成虫入药,其性寒味咸,有辛辣味,有散瘀消积、利水消肿、解毒等功效。目前蜚蠊已被开发出“肝龙胶囊”、“康复新”、“心脉龙注射液”等系列药品,用于临床治疗。蜚蠊通常以成虫为收获对象,而蜚蠊生长缓慢,饲养至成虫需要较长时间,饲养成本较高。
现有技术中运用GC-MS联用技术研究蜚蠊脂溶性成分,其结果所鉴定的成分在数量和种类上较少,同时其研究对象仅限于蜚蠊的成虫,对蜚蠊的其他生长阶段的分析研究欠缺。如蒙松年等,美洲大蠊中脂溶性化学成分的GC-MS研究,中南药学,2008年2月第6卷第1期公开了一种美洲大蠊中脂溶性化学成分GC-MS分析方法,结果共分离鉴定出了19种成分,主要以烯酸类、烯醇类和烷类为主;罗建蓉等,昆虫美洲大蠊油脂化合物的GC-MS分析,中国民族民间医药,2009年18卷17期中公开了美洲大蠊经甲醇回流提取的油脂部分进行GC-MS化学成分分析,结果共鉴定出23个成分,主要成分是酯类,脂肪酸和烷烃类;梅明等,不同前处理方法对美洲大蠊油脂GC-MS分析影响,现代中药研究与实践,2014年第28卷第2期中公开了经过非甲酯处理、酸甲酯化处理、碱甲酯化处理得到的美洲大蠊油脂并进行GC-MS分析,结果显示非甲酯处理分离和鉴定出13种成分,酸甲酯化处理分离和鉴定出27种成分,碱甲酯化处理分离和鉴定出42种成分,三种处理方法分离和鉴定出来的化合物均以烷烃类和脂肪酸酯类化合物为主;袁东强等,美洲大蠊油脂的提取及性质分析,中国粮油学报,2016年3月第31卷第3期中公开了采用超声波协同微波提取的美洲大蠊油脂进行GC-MS分析,共检测出13种脂肪酸成分,以棕榈酸、油酸和亚油酸为主;曹平等,德国小蠊油脂成分的GC-MS分析,中国民族民间医药,2016年3月第25卷第6期中公开了德国小蠊油脂成分的GC-MS分析,共鉴定了55个成分,主要为油酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸。
与现有技术相比,本发明通过GC-MS联用技术分析了不同虫态蜚蠊的脂溶性成分,改进和筛选了进样口的温度、进样模式,减少样品进样量,其结果所鉴定的化合物在种类和数量上有明显提高。因此,通过GC-MS联用技术分析脂溶性成分来鉴别不同虫态的蜚蠊,利于蜚蠊不同虫态有效成分的深入研究和利用,根据所需成分有针对性的收获不同虫态的蜚蠊,使各虫态的蜚蠊化学成分利用更充分,同时节约养殖时间和成本。
发明内容
本发明目的在于提供一种GC-MS联用技术用于鉴别分析蜚蠊中的脂溶性成分,本方法通过分析不同虫态的蜚蠊脂溶性成分,根据所需成分有针对性的收获不同虫态的蜚蠊,使各虫态的蜚蠊化学成分利用更充分,同时节约养殖时间和成本。
本发明所述的方法通过以下步骤实现:
(1)收集不同虫态的蜚蠊样品:收集雄成虫、雌成虫、刚蜕皮成虫、7-8龄若虫和3-4龄若虫五个虫态的干燥虫体;
(2)不同虫态的蜚蠊样品的制备方法:将干燥的蜚蠊全虫粉粹后称取5g,加入15倍量的乙酸乙酯,常温下浸泡过夜,在70℃温度下超声提取30min,提取3次,抽滤后合并滤液用旋转蒸发仪40℃除去溶剂,得到浓缩后的乙酸乙酯提取物约5mL,低温保存;甲酯化处理:吸取500μL提取物置于试管中,加入2mL正己烷轻轻摇动使其溶解,再加入2mL 0.4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液充分振荡,再放入70℃水浴10min后加入10mL蒸馏水,取出上清液用于GC-MS分析;
(3)不同虫态的蜚蠊样品的GC-MS联用分析条件:
色谱条件:色谱柱为TG-5MS,柱温50.0℃,进样温度280℃,分流,分流比为20.0,进样时间为1.0min,柱前压是53.5kPa,升温程序为:以50℃开始,保留5.0min,以10℃/min升至150℃,保留5.0min,再以5℃/min升至280℃,保留5.0min,最后以3℃/min升至300℃,保留13min,柱流量1.0mL/min;进样量为0.01μL,载气为高纯氦气;
质谱条件:离子源EI,电子能量为70eV,离子源温度200℃,接口温度220℃,质量扫描范围为33~600amu。采用NIST2010标准谱库进行检索同时通过面积归一法从总离子流图中计算各成分的相对百分含量。
具体实施方式
为更加清楚地对本发明进行说明,以下通过具体实施例对本发明的具体实施方式进行更为详细地说明。
实施例1
1实验仪器、材料与试剂
材料与试剂:蜚蠊3-4龄若虫、7-8龄若虫、刚蜕皮成虫、雄成虫和雌成虫的干燥虫体,由四川好医生药业集团有限公司提供。所用试剂均为分析纯试剂。
仪器:GC-MS联用仪(日本岛津GCMS-QP2010),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂RE-5298),干燥箱(上海一恒科学有限公DHG-9140),超声仪(美国SONICS VCX150),粉碎机(上海高翔食品机械厂GX-02)。
2实验部分
2.1乙酸乙酯提取
将干燥的不同虫态的蜚蠊全虫粉粹后称取5g,加入15倍量的乙酸乙酯,常温下浸泡过夜,在70℃温度下超声提取30min,提取3次,抽滤后合并滤液用旋转蒸发仪40℃除去溶剂,得到浓缩后的乙酸乙酯提取物约5mL,低温保存;
2.2甲酯化处理
吸取500μL乙酸乙酯提取物置于试管中,加入2mL正己烷轻轻摇动使其溶解,再加入2mL 0.4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液充分振荡,再放入70℃水浴10min后加入10mL蒸馏水,取出上清液用于GC-MS分析。
2.3GC-MS分析条件
2.3.1色谱条件:色谱柱为TG-5MS(30m×0.25mm×0.25μm),柱温50.0℃,进样温度280℃,分流,分流比为20.0,进样时间为1.0min,柱前压是53.5kPa,升温程序为:以50℃开始,保留5.0min,以10℃/min升至150℃,保留5.0min,再以5℃/min升至280℃,保留5.0min,最后以3℃/min升至300℃,保留13.0min,柱流量1.0mL/min;进样量为0.01μL,载气为高纯氦气;
2.3.2质谱条件:离子源EI,电子能量为70eV,离子源温度200℃,接口温度220℃,质量扫描范围为33~600amu。采用NIST2010标准谱库进行检索同时通过面积归一法从总离子流图中计算各成分的相对百分含量。
3实验结果
按上述条件对蜚蠊乙酸乙酯提取甲酯化处理物进行GC-MS分析,得到各虫态组的GC-MS图谱,再经计算机检索及人工与标准图谱核对,对各成分进行鉴定。
不同虫态的蜚蠊乙酸乙酯提取物甲酯化后经GC-MS分析共鉴定出120种化合物,其中脂肪酸类有63种,酯类有15种,烷烃类有25种,醇类有7种,酮酰氯和醚类各有1种,酚类有2种,见表1。从表1可见,各虫态组的独有成分种类:雄成虫组、雌成虫组和3-4龄若虫组各含有14种独有成分,7-8龄若虫组含有7种独有成分,刚蜕皮成虫组含有16种独有成分。除去各虫态组的独有成分外,剩余17种成分为五个虫态组所共有成分。
表1蜚蠊五个虫态组乙酸乙酯提取物的GC-MS分析结果
注:表中“-”表示未检测出该成分。
对比实施例
采用相同的蜚蠊样品,以正己醇和石油醚为溶剂,提取不同虫态的蜚蠊样品的脂溶性成分进行GC-MS分析。
对比实施例1
1实验仪器、材料与试剂
材料:蜚蠊雄成虫和雌成虫、刚蜕皮成虫、7-8龄若虫、3-4龄若虫的干燥虫体,由四川好医生药业集团有限公司提供。所用试剂均为分析纯试剂。
仪器:GC-MS联用仪(日本岛津GCMS-QP2010),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂RE-5298),干燥箱(上海一恒科学有限公DHG-9140),超声仪(美国SONICS VCX150),粉碎机(上海高翔食品机械厂GX-02)。
2实验部分
2.1正己烷提取
将干燥的不同虫态的蜚蠊全虫粉粹后称取5g,加入15倍量的正己烷,常温下浸泡过夜,在50℃温度下超声提取30min,提取3次,抽滤后合并滤液用旋转蒸发仪43℃除去溶剂,得到浓缩后的正己烷提取物约5mL,低温保存备用。吸取1mL正己烷加入100μL浓缩后的提取物作为供试样品,用于GC-MS分析。
2.3GC-MS分析条件
2.3.1色谱条件:色谱柱为TG-5MS(30m×0.25mm×0.25μm),柱温40.0℃,进样温度260℃,不分流,进样时间为1.0min,进样量为0.01μL,柱前压是49.5kPa,升温程序为:以40℃开始,保留5.0min,以10℃/min升至280℃,保留20.0min,柱流量1.0mL/min;载气为高纯氦气。
2.3.2质谱条件:离子源EI,电子能量为70eV,离子源温度200℃,接口温度220℃,质量扫描范围为33~500amu。采用NIST2010标准谱库进行检索同时通过面积归一法从总离子流图中计算各成分的相对百分含量。
3实验结果
不同虫态的蜚蠊正己烷提取物经GC-MS分析共鉴定出24种化合物,其中含烷烃类9种,脂类8种,酮醛类3种和脂肪酸类2种,见表2。从表2中可见,各虫态组的独有成分种类:雌成虫组有5种独有成分,雄成虫组有8种独有成分,7-8龄若虫组有4种独有成分,3-4龄若虫组和刚蜕皮成虫组均无独有成分。
表2蜚蠊五个虫态组正己烷提取物的GC-MS分析
注:表中“-”表示未检测出该成分。
对比实施例2
1实验仪器、材料与试剂
材料:蜚蠊雄成虫和雌成虫、刚蜕皮成虫、7-8龄若虫、3-4龄若虫的干燥虫体,由四川好医生药业集团有限公司提供。所用试剂均为分析纯试剂。
仪器:GC-MS联用仪(日本岛津GCMS-QP2010),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂RE-5298),干燥箱(上海一恒科学有限公DHG-9140),超声仪(美国SONICS VCX150),粉碎机(上海高翔食品机械厂GX-02)。
2实验部分
2.1石油醚提取
将干燥的不同虫态的蜚蠊全虫粉粹后称取5g,加入15倍量的石油醚,常温下浸泡过夜,在45℃温度下超声提取30min,提取3次,抽滤后合并滤液用旋转蒸发仪37℃除去溶剂,得到浓缩后的石油醚提取物约5mL,低温保存备用。
2.3GC-MS分析条件
2.3.1色谱条件:色谱柱为TG-5MS(30m×0.25mm×0.25μm),柱温50.0℃,进样温度280℃,分流,分流比为20.0,进样时间为1.0min,柱前压是53.5kPa,升温程序为:以50℃开,保留5.0min,以10℃/min升至150℃,保留5.0min,再以5℃/min升至280℃,保留5.0min,最后以3℃/min升至300℃,保留13.0min,柱流量1.0mL/min;进样量为0.01μL,载气为高纯氦气;
2.3.2质谱条件:离子源EI,电子能量为70eV,离子源温度200℃,接口温度220℃,质量扫描范围为33~600amu。采用NIST2010标准谱库进行检索同时通过面积归一法从总离子流图中计算各成分的相对百分含量。
3实验结果
不同虫态的蜚蠊石油醚提取物经GC-MS分析共鉴定出49种化合物,其中含烷烃类有27种,酸类有3种,醇类有5种,酯类13种,酰胺、酚和醛类各1种,见表3。从表3中可见,各虫态组的独有成分种类:雌成虫组有15种独有成分,雄成虫组有8种独有成分,7-8龄若虫组有16种独有成分,3-4龄若虫组和刚蜕皮成虫组均无独有成分。
表3蜚蠊五个虫态组石油醚提取物的GC-MS分析
注:表中“-”表示未检测出该成分。
本发明的技术效果
通过与比对实施例1和比对实施例2的结果比较,可见以乙酸乙酯作为提取溶剂,利用GC-MS联用技术分析,可鉴别出120种成分,并且五个虫态均有各自独有的成分;而以正己醇和石油醚作为提取溶剂,分别鉴别出29种和49种成分,同时上述两种溶剂在雌成虫组、雄成虫组、7~8龄若虫组有各自独有的成分,在3~4龄若虫组和刚蜕皮成虫组无独有成分。因此,本发明所用的方法其最终鉴定的成分在数量及种类方面较其他溶剂效果有显著提高,同时能通过该方法所鉴定的各虫态其独有的成分进行蜚蠊虫态的区别,利于蜚蠊不同虫态有效成分的深入研究和利用,根据所需成分有针对性的收获不同虫态的蜚蠊,使各虫态的蜚蠊化学成分利用更充分,同时节约养殖时间和成本。
Claims (5)
1.一种用于鉴别分析蜚蠊中成分的方法,其特征在于,所述的方法由以下步骤实现:
(1)收集不同虫态的蜚蠊样品;
(2)不同虫态的蜚蠊样品的制备方法;
(3)不同虫态的蜚蠊样品的GC-MS联用分析条件;
(4)基于GC-MS检测结果,分析并确定每个虫态下的蜚蠊所独有的成分。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴别分析蜚蠊中成分的方法,其特征在于:所述步骤(1)收集不同虫态的蜚蠊样品:分别收集雄成虫、雌成虫、刚蜕皮成虫、7-8龄若虫和3-4龄若虫五个虫态的干燥虫体。
3.根据权利要求1所述的一种用于鉴别分析蜚蠊中成分的方法,其特征在于:所述步骤(2)不同虫态的蜚蠊样品的制备方法:将干燥的蜚蠊全虫粉粹后称取5g,加入15倍量的乙酸乙酯,常温下浸泡过夜,在70℃温度下超声提取30min,提取3次,抽滤后合并滤液用旋转蒸发仪40℃除去溶剂,得到浓缩后的乙酸乙酯提取物约5mL,低温保存;甲酯化处理:吸取500μL提取物置于试管中,加入2mL正己烷轻轻摇动使其溶解,再加入2mL 0.4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液充分振荡,再放入70℃水浴10min后加入10mL蒸馏水,取出上清液用于GC-MS分析。
4.根据权利要求1所述的一种用于鉴别分析蜚蠊中成分的方法,其特征在于:所述步骤(3)不同虫态的蜚蠊样品的GC-MS联用分析条件:
色谱条件:色谱柱为TG-5MS,柱温50.0℃,进样温度280℃,分流,分流比为20.0,进样时间为1.0min,柱前压是53.5kPa,升温程序为:以50℃开始,保留5.0min,以10℃/min升至150℃,保留5.0min,再以5℃/min升至280℃,保留5.0min,最后以3℃/min升至300℃,保留13.0min,柱流量1.0mL/min;进样量为0.01μL,载气为高纯氦气;
质谱条件:离子源EI,电子能量为70eV,离子源温度200℃,接口温度220℃,质量扫描范围为33~600amu。
5.根据权利要求1~4任意一项所述一种用于鉴别分析蜚蠊中成分的方法,其特征在于所述蜚蠊为美洲大蠊。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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