CN110672737A - 美洲大蠊的鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种美洲大蠊的鉴别方法，具体是：将待测样本经酶解处理，制成供试品溶液；然后对供试品溶液进行液质联用检测，以确定所述待测样本是否为美洲大蠊；其中，采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，以特征肽段离子对进行MRM扫描。本发明的鉴别方法基于寻找到的特征肽，采用质谱的多反应监测，通过特征离子对的检出来区别美洲大蠊及其混伪品，该方法的特征性强，灵敏度高，能对于美洲大蠊的各种混伪品种进行鉴别，并且可以适用于无法进行DNA鉴定检测的相关提取物及制剂的鉴别。

Description

美洲大蠊的鉴别方法
技术领域
本发明涉及美洲大蠊的中药药材、提取物及相关制剂的鉴别技术领域。
背景技术
美洲大蠊为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》：美洲大蠊“味咸、寒；治血瘀症坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。目前应用于临床的蜚蠊主要为美洲大蠊，并以此原料开发出康复新液、心脉龙注射液等制剂，主要用于治疗心血管病、创伤的愈合、肿瘤等疾病。
美洲大蠊为临床常用药材，临床上易混伪品主要有德国小蠊、杜比亚及土鳖虫等昆虫。由于昆虫蛋白种类、含量差异不大，现行标准采用紫外-可见分光光度法测定总氨基酸的含量，难以控制混伪品冒充美洲大蠊的情况。地方标准中的定性采用薄层色谱鉴别方法，混伪品与正品几乎无法区别，无法确定投料中是否混杂伪品。此外，美洲大蠊提取物及其制剂经过加工、处理，DNA破坏严重，因而无法通过DNA鉴定方法进行鉴别。
因此开发具有专属性强、灵敏度高的鉴别美洲大蠊混伪品的鉴别方法，对于该类药材、提取物和制剂的质量控制具有重要意义。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于克服现有的美洲大蠊测定或鉴别方法无法快速、准确地区分或鉴别美洲大蠊及其混伪品，而DNA鉴定无法适用于提取物和制剂等的缺陷，提供一种美洲大蠊的鉴别方法。本发明的鉴别方法基于寻找到的特征肽，采用质谱的多反应监测，通过特征离子对的检出来区别美洲大蠊及其混伪品，该方法的特征性强，灵敏度高，能对于美洲大蠊的各种混伪品种进行鉴别。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种美洲大蠊的鉴别方法，其包括下述步骤：
(1)将待测样本经酶解处理，制成供试品溶液；
(2)对所述供试品溶液进行液质联用检测，以确定所述待测样本是否为美洲大蠊；
其中，采用电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测(MRM)，以①和/或②的特征肽段离子对进行MRM扫描；
①质荷比(m/z)510.8(双电荷)→369.0、质荷比(m/z)510.8(双电荷)→239.9；
②质荷比(m/z)627.3(三电荷)→603.5、质荷比(m/z)627.3(三电荷)→516.7。
本发明中，所述的美洲大蠊的鉴别方法不限于鉴别美洲大蠊药材，还包括美洲大蠊提取物，以及含有美洲大蠊提取物的制剂(例如康复新片、康复新液)的鉴别。因而，在没有明确限定的情况下，本发明中术语“美洲大蠊”一词泛指美洲大蠊药材、美洲大蠊提取物和含有美洲大蠊提取物的制剂。
步骤(1)中，将所述待测样本经酶解处理，制成供试品溶液。
按本领域常识，当所述待测样本为药材或片剂时，一般先进行预处理，再进行酶解处理；当所述待测样品为提取物或液体制剂时，可直接进行酶解处理。
例如，所述待测样本为药材，所述预处理操作较佳地包括下述操作：将药材与乙醚混合超声，过滤，干燥；再与乙醇混合超声，离心后干燥，即可。
又例如，所述待测样本为片剂，所述预处理较佳地包括下述操作：将片剂研磨成细颗粒，即可。
步骤(1)中，所述酶解处理的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述酶解处理的溶剂较佳地为碳酸氢铵溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或磷酸盐缓冲液。所述酶解处理所用的酶较佳地为胰蛋白酶。
在本发明的一些具体实施方式中，所述酶解处理较佳地包括下述步骤：
1)将液体待测样品或者经预处理的固体待测样品，与碳酸氢铵溶液混合超声，过滤；
2)滤液和胰蛋白酶混合，进行酶解反应，即可。
步骤1)中，所述样品与碳酸氢铵溶液的混合比例较佳地为(1.5-15)g/20mL。所述碳酸氢铵溶液的溶度较佳地为0.5-2％，例如1％。所述过滤一般采用微孔滤膜进行。在所述过滤后，还可以进一步通过紫外280nm下检测溶液中的总蛋白浓度，用碳酸氢铵溶液稀释至滤液的吸光度为1.0。
步骤2)中，所述胰蛋白酶一般以胰蛋白酶溶液的形式进行混合，通常采用碳酸氢铵溶液进行配制，所述胰蛋白酶溶液的浓度较佳地为0.25mg/mL。所述滤液与胰蛋白酶溶液的体积比较佳地为10：(1.25-5.0)。所述酶解反应的时间较佳地为12-24小时，更佳地为18-24小时。所述酶解反应的温度一般选择37℃。
步骤(1)中，在待测样本为药材的情况下，在所述酶解处理后，一般还可以进行后处理操作以去除杂质。所述后处理的方法例如是：将酶解后的反应液过固相萃取柱，取过柱液作为供试品溶液。在待测样本为提取物或制剂的情况下，酶解后的反应液可直接作为供试品溶液。
步骤(2)中，对所述供试品溶液进行液质联用检测，以确定所述待测样本是否为美洲大蠊。
其中，液相色谱的条件可按本领域常规进行选择，可参照高效液相色谱-质谱法(中国药典通则0512和中国药典2015年版四部通则0431)试验。
在本发明的一些具体实施方式中，所述液相色谱的条件优选如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径一般为2.1mm)；
以乙腈为流动相A，以0.05-0.2％甲酸溶液(例如0.1％的甲酸溶液)为流动相B；
梯度洗脱：0→12min，流动相A为10％；12→20min，流动相A为10％→30％；20→25min，流动相A为30％；
流速为0.2mL/min。
按本领域常识，通过电离子喷雾正离子模式进行多反应监测，根据特征离子对的出峰与否，可鉴别出美洲大蠊与其他易混品种。本发明中，所使用的特征离子对如表1所示。
表1美洲大蠊特征离子对
质荷比(m/z) 子离子
510.8(双电荷) 369.0、239.9
627.3(三电荷) 603.5、516.7
通常，按上述检测离子对测定的美洲大蠊的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)首次基于美洲大蠊特征肽段的离子对，提供了一种能够对美洲大蠊同属混伪品进行鉴别的方法。
(2)本发明的鉴别方法可以精准、快速对美洲大蠊伪品及易混品进行鉴别。
(3)本发明的鉴别方法适用于无法进行DNA鉴定检测的相关提取物及制剂的鉴别。
附图说明
图1为美洲大蠊及其混伪品TLC图。
图2为蜚蠊对照药材样品特征离子对多反应监测扫描图(MRM)。
图3为美洲大蠊对照药材样品特征离子对多反应监测扫描图。
图4为德国小蠊药材样品特征离子对多反应监测扫描图。
图5为杜比亚药材样品特征离子对多反应监测扫描图。
图6为土鳖虫药材样品特征离子对多反应监测扫描图。
图7实施例2样品(美洲大蠊药材)特征离子对多反应监测扫描图。
图8实施例3样品(美洲大蠊提取物)特征离子对多反应监测扫描图。
图9为实施例4样品(康复新含片)特征离子对多反应监测扫描图。
图10为实施例5样品(康复新液)特征离子对多反应监测扫描图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所用的主要设备、仪器和试剂如下：
Agilent 1200RRLC-6430LC/MS，色谱柱Thermo Accucore C18(150×2.1mm，2.6μm)；数据分析采用SIEVEx86软件和SIMCA14软件；
胰蛋白酶购自Promega公司；
SPE固相萃取柱：(Agilent Zorbax SPE C18-EC；100mg，1ml)；
蜚蠊对照药材(批号：121696-201401)由中国食品药品检定研究院提供，根据其拉丁名Periplaneta Americana(Linnaenus)即为美洲大蠊；
美洲大蠊、德国小蠊、杜比亚和土鳖虫样品均经浙江省食品药品检验研究院主任药师鉴定确认。
对比实施例1
按地方标准，采用薄层色谱鉴别美洲大蠊及其混伪品。其中，湖南省中药材标准和云南省中药材标准以丙氨酸作为对照，四川省中药材标准以美洲大蠊对照药材为对照。
试验结果见图1，其中1为美洲大蠊(批号20171128、新昌)、2为美洲大蠊(批号Q20170802、云南)、3为美洲大蠊对照药材、4为德国小蠊(批号20180028)、5为杜比亚(批号20180029)、6为土鳖虫(批号20180030)、7为丙氨酸。从图1可以看出，混伪品与正品几乎无法区别。
实施例1
对蜚蠊对照药材、美洲大蠊对照药材、德国小蠊药材、杜比亚药材和土鳖虫药材进行检测，具体如下：
分别取粉末样品约2.5g，置具塞锥形瓶中，加50mL乙醚，超声处理30分钟，滤过，残渣挥干乙醚，加入85％乙醇50mL超声处理30分钟，离心，倾去上清液，残渣置60℃烘箱内干燥3小时，取出，加入1％碳酸氢铵溶液20mL，超声处理30分钟，用微孔滤膜滤过，在紫外280nm下测定总蛋白浓度，用1％碳酸氢铵稀释至溶液的吸光度约为1.0，吸取上述续滤液100μL置微量进样瓶中，加入胰蛋白酶25μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.25mg的溶液，临用时配制)，置37℃烘箱中恒温酶解18小时，过固相萃取柱，作为供试品溶液。
对供试品溶液进行液质联用检测：取供试品溶液，进样4μL；参照高效液相色谱-质谱法(中国药典通则0512和中国药典2015年版四部通则0431)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径为2.1mm)；以乙腈为流动相A，以0.15％甲酸溶液为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.2mL。
表2
Figure BDA0002220342000000061
采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI+)，进行多反应监测，选择质荷比(m/z)510.8(双电荷)→369.0、质荷比(m/z)510.8(双电荷)→239.9以及质荷比(m/z)627.3(三电荷)→603.5、质荷比(m/z)627.3(三电荷)→516.7作为检测离子对。
检测结果见图2-图6。可以看出，图2的蜚蠊(即美洲大蠊)对照药材的MRM和图3的美洲大蠊对照药材的相一致，其中出现色谱保留时间一致的色谱峰，且色谱峰的信噪比均大于3：1。而图4的德国小蠊药材、图5的杜比亚药材和图6的土鳖虫药材，这三种混伪品均未呈现与对照药材色谱保留时间一致的色谱峰。
实施例2
取待鉴定药材粉末(批号：Q20170802，产地：云南大理巍山)2.5g，置具塞锥形瓶中，加50mL乙醚，超声处理30分钟，滤过，残渣挥干乙醚，加入85％乙醇50mL超声处理30分钟，离心，倾去上清液，残渣置60℃烘箱内干燥3小时，取出，加入1％碳酸氢铵溶液20mL，超声处理30分钟，用微孔滤膜滤过，吸取上述续滤液100μL置微量进样瓶中，加入胰蛋白酶30μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.25mg的溶液，临用时配制)，置37℃烘箱中恒温酶解24小时，作为供试品溶液。
按实施例1相同的方法进行液质联用检测，取供试品溶液，进样4μL。检测的MRM图谱如图7所示，MRM色谱峰的信噪比均大于3：1，经MRM图谱鉴定该药材为美洲大蠊药材。
实施例3
取蜚蠊属待鉴定药材提取物1.5g，加入1％碳酸氢铵溶液20mL，超声处理30分钟，用微孔滤膜滤过，吸取上述续滤液100μL置微量进样瓶中，加入胰蛋白酶25μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.25mg的溶液，临用时配制)，置37℃烘箱中恒温酶解24小时，作为供试品溶液。
按实施例1相同的方法进行液质联用检测，取供试品溶液，进样4μL。检测的MRM图谱如图8所示，MRM色谱峰的信噪比均大于3：1，经MRM图谱鉴定该药材提取物为美洲大蠊提取物。
实施例4
取康复新含片15片，研细，加入1％碳酸氢铵溶液20mL，超声处理30分钟，用微孔滤膜滤过，吸取上述续滤液100μL置微量进样瓶中，加入胰蛋白酶30μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.25mg的溶液，临用时配制)，置37℃烘箱中恒温酶解12小时，作为供试品溶液。
按实施例1相同的方法进行液质联用检测，取供试品溶液，进样4μL。检测的MRM图谱如图9所示，MRM色谱峰的信噪比均大于3：1，经MRM图谱鉴定该康复新含片中所用药材为美洲大蠊。
实施例5
取康复新液100mL，置旋转蒸发器中60℃内干燥至流浸膏状，加入1％碳酸氢铵溶液20mL，超声处理30分钟，用微孔滤膜滤过，吸取上述续滤液100μL置微量进样瓶中，加入胰蛋白酶40μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.25mg的溶液，临用时配制)，置37℃烘箱中恒温酶解24小时，作为供试品溶液。
按实施例1相同的方法进行液质联用检测，取供试品溶液，进样4μL。检测的MRM图谱如图10所示，MRM色谱峰的信噪比均大于3：1，经MRM图谱鉴定该康复新液中所用药材为美洲大蠊。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种美洲大蠊的鉴别方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)将待测样本经酶解处理，制成供试品溶液；
(2)对所述供试品溶液进行液质联用检测，以确定所述待测样本是否为美洲大蠊；
其中，采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，以①和/或②的特征肽段离子对进行MRM扫描；
①质荷比510.8双电荷→369.0、质荷比510.8双电荷→239.9；
②质荷比627.3三电荷→603.5、质荷比627.3三电荷→516.7。
2.如权利要求1所述的美洲大蠊的鉴别方法，其特征在于，所述待测样本为药材或片剂，先进行预处理，再进行酶解处理。
3.如权利要求2所述的美洲大蠊的鉴别方法，其特征在于，所述待测样本为药材，所述预处理操作包括下述操作：将药材与乙醚混合超声，过滤，干燥；再与乙醇混合超声，离心后干燥，即可。
4.如权利要求2所述的美洲大蠊的鉴别方法，其特征在于，所述待测样本为片剂，所述预处理包括下述操作：将片剂研磨成细颗粒，即可。
5.如权利要求1-4任一项所述的美洲大蠊的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酶解处理的溶剂为碳酸氢铵溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或磷酸盐缓冲液；
和/或，步骤(1)中，所述酶解处理所用的酶为胰蛋白酶。
6.如权利要求5所述的美洲大蠊的鉴别方法，其特征在于，所述酶解处理包括下述步骤：
1)将液体待测样品或者经预处理的固体待测样品，与碳酸氢铵溶液混合超声，过滤；
2)滤液和胰蛋白酶混合，进行酶解反应，即可。
7.如权利要求6所述的美洲大蠊的鉴别方法，其特征在于，步骤1)中，所述样品与碳酸氢铵溶液的混合比例为(1.5-15)g/20mL；
和/或，步骤1)中，所述碳酸氢铵溶液的溶度为0.5-2％；
和/或，步骤1)中，所述过滤采用微孔滤膜进行。
8.如权利要求6所述的美洲大蠊的鉴别方法，其特征在于，步骤2)中，所述胰蛋白酶以胰蛋白酶溶液的形式进行混合，所述滤液与胰蛋白酶溶液的体积比为10：(1.25-5.0)；
和/或，步骤2)中，所述酶解反应的时间为12-24小时；
和/或，步骤2)中，所述酶解反应的温度为37℃。
9.如权利要求5所述的美洲大蠊的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)中，待测样本为药材，在所述酶解处理后，还进行后处理操作以去除杂质；所述后处理的方法为：将酶解后的反应液过固相萃取柱，取过柱液作为供试品溶液。
10.如权利要求1-4任一项所述的美洲大蠊的鉴别方法，其特征在于，步骤(2)中，所述液相色谱的条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
以乙腈为流动相A，以0.05-0.2％甲酸溶液为流动相B；
梯度洗脱：0→12min，流动相A为10％；12→20min，流动相A为10％→30％；20→25min，流动相A为30％；
流速为0.2mL/min。
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