CN105920065A - 一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法及其应用 - Google Patents

一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法及其应用。其中分离纯化方法包括原材料的预处理、粉碎、脱脂，超声波粗提制备紫背天葵粗皂甙，最后经过大孔树脂梯度洗脱得到纯度较高的3种紫背天葵皂甙组分。本发明进行了脱脂操作，使得后期的皂甙提取快速且充分；选用简单快速的超声波在最优的超声波条件下进行浸提，能够达到80%以上的提取率；提取完成后利用高浓度的乙醇进行沉淀处理，能够有效去除蛋白等的杂质干扰。另外，通过动物实验证明了紫背天葵皂甙具有极强的抗氧化性能，能够显著增强机体免疫力，能够作为增强免疫力药物或保健品进行开发利用。

Description

一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法及其应用
技术领域
本发明属于天然化合物分离纯化领域，具体涉及一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法，本发明还涉及分离纯化得到的紫背天葵皂甙的应用。
背景技术
皂甙是广泛存在于植物界和某些海洋生物中的一种特殊苷类，大多可溶于水，振摇后易起持久性的肥皂样泡沫，因而得名。皂甙对人体的新陈代谢起着重要的生理作用。它可以抑制血清中脂类氧化，抑制过氧化脂质的生成，降低血清中胆固醇的含量，抑制过氧化脂质对肝脏的损伤，防止动脉硬化，因而它具有免疫调节的作用。它可以提高 NK 细胞、LAK细胞的数量，增强机体免疫力。皂甙对核酸和蛋白质合成有促进作用，可增加肝、肌肉组织中蛋白质与 DNA 的含量，提高机体的耐力，因而具有抗疲劳作用。皂甙还可以抑制肿瘤细胞的生长并具有消肿抗炎症的作用。许多皂甙具有抗菌和抗病毒活性。皂甙抗菌作用的机理之一是由于皂甙能与细菌细胞膜中的胆固醇形成复合物，因此认为这种抗菌活性和溶血性质有关。皂甙抗病毒的作用机理则是通过增强机体免疫功能或直接杀死病毒而起作用的。
紫背天葵(Begoniafimbritipula Hance)是广东省鼎湖山国家级自然保护区的特色植物，见于海拔200～1120 m溪谷两侧近水处的向阳石壁处，属中国特有物种。紫背天葵叶基生，常见l一3片，表皮毛明显。叶片既可人药，又是一种很好的消食保健品，俗称红天葵。紫背天葵具清热解毒、止渴生津、活血消肿、润燥止咳之功效；大多推测这些功效与紫背天葵中的皂甙有密切关系。但是目前还没有对紫背天葵皂甙进行具体研究，如何分离纯化紫背天葵皂甙，对紫背天葵皂甙的构效关系尚未清楚，因而对其的实际活性研究也未见报道。鉴于紫背天葵独特的药物活性，分离纯化紫背天葵皂甙并进行进一步的研究是很有必要的，并且能为紫背天葵皂甙的临床应用研究提供理论依据。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的之一是提供一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法，以填补现有技术中关于紫背天葵皂甙提取的空白；本发明的目的之二是提供紫背天葵皂甙的应用，进一步揭示其药用价值。
为达到上述目的，本发明所采用的第一技术方案是，一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其具体步骤为：
（1）预处理：选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用；
（2）粉碎：将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末；
（3）脱脂：将步骤（2）制得的紫背天葵叶粉末中加入石油醚，超声波冷浸，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂后得到紫背天葵叶脱脂品，备用；
（4）粗皂甙提取：将步骤（3）脱脂后的紫背天葵叶粉末加入乙醇液超声波提取，连续提取两次；
（5）提取液浓缩：将步骤（4）中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液；
（6）沉淀处理：将步骤（5）得到的浓缩液加入乙醇，进一步沉淀去除杂质；
（7）离心：离心去除沉淀，保留上清液备用；
（8）萃取：将步骤（7）离心之后的上清液中加入乙醚，充分搅拌，静置萃取；
（9）蒸干：将步骤（8）得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，得到蒸发浓缩液后进行冷冻干燥得到了紫背天葵粗皂甙；
（10）纯化：将步骤（9）制得的紫背天葵粗皂甙加少量乙醇溶解，利用大孔树脂进行进一步的分离；
（11）分析：通过香草醛-硫酸法测定收集各管中的皂甙含量，绘制曲线，根据曲线不同峰值，混合峰值附近的收集管中的洗脱液，蒸发浓缩并冻干不同峰值的组分。
进一步的，步骤（2）中所述的干燥粉碎的具体操作为：指在60-75℃真空干燥箱中干燥 12-16.5h，粉碎后过孔径为 0.21-0.36mm 的筛。
进一步的，步骤（3）中在进行超声波操作时，超声波冷浸2-4h后，再静置0.5-1h，冷浸过程中不断搅拌，搅拌速率为100-150r/min。
进一步的，步骤（3）中所述紫背天葵叶粉末与石油醚的质量比为1：8-11。
进一步的，步骤（4）中所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1：25-36；加入质量分数为46-55%的乙醇液超声波提取，提取温度为45-50℃，连续提取两次，第一次提取时间为35-40min，第二次提取时间为30-34min。
进一步的，步骤（5）中蒸发条件具体为：真空度为0.02-0.07MPa，冷凝水的温度为-8- -10℃，回收温度为48-55℃。
进一步的，步骤（6）按照体积比1：4-6加入95%的乙醇，充分搅拌后，于4℃静置2-4h。
进一步的，步骤（7）离心条件设定为：转速为4000rmp/min，离心15-20min。
进一步的，步骤（8）中加入与上清液等体积的乙醚进行萃取，充分搅拌，静置萃取0.5-1h，重复萃取3次。
进一步的，步骤（9）中蒸发条件为：真空度为0.02-0.07MPa，冷凝水的温度为-8- -6℃，回收温度为40-45℃。
进一步的，在步骤（10）层析操作之前，通过AB-8大孔树脂进行脱色实验，使用6-8%的乙醇液洗脱2-3个柱体积，最终以75-80%的乙醇回收，进行脱色处理。
进一步的，步骤（10）大孔树脂经68-75%的乙醇液、蒸馏水浸泡，清洗后装柱，并以蒸馏水充分清洗层析柱，上样后分别以水和不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，设定流速为1.3ml/min，13ml每管收集洗脱液。
进一步的，步骤（10）中的大孔树脂优选为AB-8、Diaion HP - 10、Diaion HP –20、HPD-450和Amberlite XAD-4。
进一步的，步骤（10）中的大孔树脂优选为Amberlite XAD-4。
上述制得的紫背天葵粗皂甙经实验验证其有较强的抗氧化特性，能够用于增强免疫力的药物或保健品研究中。
本发明的有益效果是：本发明首次对紫背天葵叶的皂甙进行提取，并进行了有效的分离纯化，为后期研究提供了实验基础和理论依据。为充分提取皂甙，在原料前期处理时，进行了脱脂操作，使得后期的皂甙提取快速且充分；选用简单快速的超声波在最优的超声波条件下进行浸提，能够达到80%以上的提取率；提取完成后利用高浓度的乙醇进行沉淀处理，能够有效去除蛋白等的杂质干扰；利用梯度洗脱能够有效分离紫背天葵叶粗皂甙，得到了3种主要的组分，经分析明确了三种组分的纯度均达到92%以上。另外，对提取得到的紫背天葵叶粗皂甙进行生物学实验，发现其有较强的抗氧化性能，在增强免疫力方面具有突出的价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其具体步骤为：
（1）预处理：选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用；
（2）粉碎：将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末；75℃真空干燥箱中干燥 16.5h，粉碎后过孔径为 0.21mm 的筛；
（3）脱脂：将步骤（2）制得的紫背天葵叶粉末中加入石油醚，超声波冷浸2.5h后，冷浸过程中不断搅拌，搅拌速率为100r/min，再静置0.5-1h，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂后得到紫背天葵叶脱脂品，备用；所述紫背天葵叶粉末与石油醚的质量比为1：10；
（4）粗皂甙提取：将步骤（3）脱脂后的紫背天葵叶粉末加入质量分数为55%的乙醇液超声波提取，提取温度为50℃，连续提取两次，第一次提取时间为38min，第二次提取时间为32min；所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1：30；
（5）提取液浓缩：将步骤（4）中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件为：真空度为0.07MPa，冷凝水的温度为-8℃，回收温度为55℃；
（6）沉淀处理：将步骤（5）得到的浓缩液按照体积比1：5加入95%的乙醇，充分搅拌后，于4℃静置2-4h，进一步沉淀去除杂质；
（7）离心：转速为4000rmp/min，离心15-20min，去除沉淀，保留上清液备用；
（8）萃取：将步骤（7）离心之后的上清液中加入等体积的乙醚，充分搅拌，静置萃取0.5-1h，重复萃取3次；
（9）蒸干：将步骤（8）得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件为：真空度为0.07MPa，冷凝水的温度为-8℃，回收温度为45℃，得到蒸发浓缩液后进行冷冻干燥得到了紫背天葵粗皂甙；
（10）纯化：将步骤（9）制得的紫背天葵粗皂甙加少量乙醇溶解，利用Diaion HP – 20大孔树脂进行进一步的分离；大孔树脂经70%的乙醇液、蒸馏水浸泡，清洗后装柱，并以蒸馏水充分清洗层析柱，上样后分别以水和不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，设定流速为1.3ml/min，13ml每管收集洗脱液；梯度洗脱的两相条件：0-15min 90%水 10%乙醇—40%水60%乙醇；16-40min 40%水 60%乙醇—20%的水 80%的乙醇；41min-70min 20%的水 80%的乙醇—5%水 95%乙醇；
（11）分析：通过香草醛-硫酸法测定收集各管中的皂甙含量，绘制曲线，得到了3个峰值，混合峰值附近的收集管中的洗脱液，蒸发浓缩并冻干不同峰值的组分，分别为S1、S2和S3组分，最后再将得到的各组分进行皂甙含量测定。
实施例2
一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其具体步骤为：
（1）预处理：选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用；
（2）粉碎：将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末；60℃真空干燥箱中干燥 12h，粉碎后过孔径为 0.36mm 的筛；
（3）脱脂：将步骤（2）制得的紫背天葵叶粉末中加入石油醚，超声波冷浸2h后，冷浸过程中不断搅拌，搅拌速率为150r/min，再静置0.5-1h，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂后得到紫背天葵叶脱脂品，备用；所述紫背天葵叶粉末与石油醚的质量比为1：8；
（4）粗皂甙提取：将步骤（3）脱脂后的紫背天葵叶粉末加入质量分数为50%的乙醇液超声波提取，提取温度为45℃，连续提取两次，第一次提取时间为35min，第二次提取时间为34min；所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1：25；
（5）提取液浓缩：将步骤（4）中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件为：真空度为0.02MPa，冷凝水的温度为-10℃，回收温度为48℃；
（6）沉淀处理：将步骤（5）得到的浓缩液按照体积比1：4加入95%的乙醇，充分搅拌后，于4℃静置2-4h，进一步沉淀去除杂质；
（7）离心：转速为4000rmp/min，离心15-20min，去除沉淀，保留上清液备用；
（8）萃取：将步骤（7）离心之后的上清液中加入等体积的乙醚，充分搅拌，静置萃取0.5-1h，重复萃取3次；
（9）蒸干：将步骤（8）得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件为：真空度为0.02MPa，冷凝水的温度为-6℃，回收温度为40℃，得到蒸发浓缩液后进行冷冻干燥得到了紫背天葵粗皂甙；
（10）纯化：将步骤（9）制得的紫背天葵粗皂甙加少量乙醇溶解，利用Amberlite XAD-4大孔树脂进行进一步的分离；大孔树脂经75%的乙醇液、蒸馏水浸泡，清洗后装柱，并以蒸馏水充分清洗层析柱，上样后分别以水和不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，设定流速为1.3ml/min，13ml每管收集洗脱液；梯度洗脱的两相条件：0-15min 90%水 10%乙醇—40%水60%乙醇；16-40min 40%水 60%乙醇—20%的水 80%的乙醇；41min-70min 20%的水 80%的乙醇—5%水 95%乙醇；
（11）分析：通过香草醛-硫酸法测定收集各管中的皂甙含量，绘制曲线，得到了3个峰值，混合峰值附近的收集管中的洗脱液，蒸发浓缩并冻干不同峰值的组分，分别为S1、S2和S3组分，最后再将得到的各组分进行皂甙含量测定。
实施例3
一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其具体步骤为：
（1）预处理：选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用；
（2）粉碎：将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末；70℃真空干燥箱中干燥 14h，粉碎后过孔径为 0.30mm 的筛；
（3）脱脂：将步骤（2）制得的紫背天葵叶粉末中加入石油醚，超声波冷浸4h后，冷浸过程中不断搅拌，搅拌速率为120r/min，再静置0.5-1h，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂后得到紫背天葵叶脱脂品，备用；所述紫背天葵叶粉末与石油醚的质量比为1：11；
（4）粗皂甙提取：将步骤（3）脱脂后的紫背天葵叶粉末加入质量分数为46%的乙醇液超声波提取，提取温度为48℃，连续提取两次，第一次提取时间为40min，第二次提取时间为30min；所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1：36；
（5）提取液浓缩：将步骤（4）中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件为：真空度为0.05MPa，冷凝水的温度为-9℃，回收温度为52℃；
（6）沉淀处理：将步骤（5）得到的浓缩液按照体积比1：6加入95%的乙醇，充分搅拌后，于4℃静置2-4h，进一步沉淀去除杂质；
（7）离心：转速为4000rmp/min，离心15-20min，去除沉淀，保留上清液备用；
（8）萃取：将步骤（7）离心之后的上清液中加入等体积的乙醚，充分搅拌，静置萃取0.5-1h，重复萃取3次；
（9）蒸干：将步骤（8）得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件为：真空度为0.05MPa，冷凝水的温度为-7℃，回收温度为42℃，得到蒸发浓缩液后进行冷冻干燥得到了紫背天葵粗皂甙；
（10）纯化：将步骤（9）制得的紫背天葵粗皂甙加少量乙醇溶解，利用HPD-450大孔树脂进行进一步的分离；大孔树脂经68%的乙醇液、蒸馏水浸泡，清洗后装柱，并以蒸馏水充分清洗层析柱，上样后分别以水和不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，设定流速为1.3ml/min，13ml每管收集洗脱液；梯度洗脱的两相条件：0-15min 90%水 10%乙醇—40%水 60%乙醇；16-40min 40%水 60%乙醇—20%的水 80%的乙醇；41min-70min 20%的水 80%的乙醇—5%水95%乙醇；
（11）分析：通过香草醛-硫酸法测定收集各管中的皂甙含量，绘制曲线，得到了3个峰值，混合峰值附近的收集管中的洗脱液，蒸发浓缩并冻干不同峰值的组分，分别为S1、S2和S3组分，最后再将得到的各组分进行皂甙含量测定。
对比例1：
一种紫背天葵皂甙的提取方法，其具体步骤为：
（1）预处理：选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用；
（2）粉碎：将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末；75℃真空干燥箱中干燥 16.5h，粉碎后过孔径为 0.21mm 的筛；
（3）脱脂：将步骤（2）制得的紫背天葵叶粉末中加入石油醚，超声波冷浸2.5h后，冷浸过程中不断搅拌，搅拌速率为100r/min，再静置0.5-1h，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂后得到紫背天葵叶脱脂品，备用；所述紫背天葵叶粉末与石油醚的质量比为1：11；
（4）粗皂甙提取：将步骤（3）脱脂后的紫背天葵叶粉末加入质量分数为55%的乙醇液搅拌提取，提取温度为50℃，连续提取两次，第一次提取时间为38min，第二次提取时间为32min；所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1：35；
（5）提取液浓缩：将步骤（4）中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件为：真空度为0.07MPa，冷凝水的温度为-8℃，回收温度为55℃；
（6）沉淀处理：将步骤（5）得到的浓缩液按照体积比1：5加入95%的乙醇，充分搅拌后，于4℃静置2-4h，进一步沉淀去除杂质；
（7）离心：转速为4000rmp/min，离心15-20min，去除沉淀，保留上清液备用；
（8）萃取：将步骤（7）离心之后的上清液中加入等体积的乙醚，充分搅拌，静置萃取0.5-1h，重复萃取3次；
（9）蒸干：将步骤（8）得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件为：真空度为0.07MPa，冷凝水的温度为-8℃，回收温度为45℃，得到蒸发浓缩液后进行冷冻干燥得到了紫背天葵粗皂甙；并通过香草醛-硫酸法测定其皂甙含量。
对比例2：
一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其具体步骤为：
（1）预处理：选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用；
（2）粉碎：将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末；72℃真空干燥箱中干燥 16 h，粉碎后过孔径为 0.25mm 的筛；
（3）脱脂：将步骤（2）制得的紫背天葵叶粉末中加入石油醚，超声波冷浸3h后，冷浸过程中不断搅拌，搅拌速率为130r/min，再静置0.5h，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂后得到紫背天葵叶脱脂品，备用；所述紫背天葵叶粉末与石油醚的质量比为1：9；
（4）粗皂甙提取：将步骤（3）脱脂后的紫背天葵叶粉末加入质量分数为55%的乙醇液超声波提取，提取温度为50℃，连续提取两次，第一次提取时间为36min，第二次提取时间为33min；所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1：35；
（5）提取液浓缩：将步骤（4）中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件为：真空度为0.06MPa，冷凝水的温度为-8℃，回收温度为55℃；
（6）沉淀处理：将步骤（5）得到的浓缩液按照体积比1：5加入95%的乙醇，充分搅拌后，于4℃静置2-4h，进一步沉淀去除杂质；
（7）离心：转速为4000rmp/min，离心15-20min，去除沉淀，保留上清液备用；
（8）萃取：将步骤（7）离心之后的上清液中加入等体积的乙醚，充分搅拌，静置萃取0.5-1h，重复萃取3次；
（9）蒸干：将步骤（8）得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，蒸发条件为：真空度为0.06MPa，冷凝水的温度为-8℃，回收温度为45℃，得到蒸发浓缩液后进行冷冻干燥得到了紫背天葵粗皂甙；
（10）纯化：将步骤（9）制得的紫背天葵粗皂甙加少量乙醇溶解，利用大孔树脂进行进一步的分离；大孔树脂经70%的乙醇液、蒸馏水浸泡，清洗后装柱，并以蒸馏水充分清洗层析柱，上样后以不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，20%乙醇洗脱2个柱体积，40%乙醇洗脱3个柱体积，60%乙醇洗脱2个柱体积；
（11）分析：通过香草醛-硫酸法测定步骤（10）中收集3组中的皂甙含量，S1、S2和S3三组。
经过对实施例1-3和对比例1-2的皂甙含量分析，结果见表1，可以看出，本发明所提供的方法，超声波提取的粗皂甙含量较高，能够满足粗皂甙在大多数实验中使用；根据所设定的梯度洗脱，分离出的三组分皂甙含量达到92%以上，纯度较高，相较于一般所用的洗脱方式，具有一定的优越性。
表1 各实验组的皂甙含量结果
试验组 紫背天葵粗皂甙含量（%） 紫背天葵皂S1（%） 紫背天葵皂S2（%） 紫背天葵皂S3（%）
实施例1 82 92.1 94.5 93.2
实施例2 83.4 92.0 95.3 92.7
实施例3 82.7 93.4 95.7 92.3
对比例1 60.7 / / /
对比例2 82.1 84.5 87.4 85.9
下面通过动物实验对紫背天葵粗皂甙进行生物性能评价。
1. 实验动物
C57/BL6小鼠，雄性，体重16-20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2011-0008。
2. 试验方法
将C57/BL6小鼠按体重随机分为4组：实施例1组、实施例2组、实施例3组、正常对照组，模型组，每组10只。实施例1组、实施例2组、实施例3组以及模型组均为过氧化氢损伤组，小鼠适应三天后，实施例1组、实施例2组、实施例3组均按照180mg/kg的皂甙含量进行灌服，模型组则灌服等量的蒸馏水。实验期为一周。自由进食和进水，末日隔夜停食不停水，次日晨断尾、眼眶取血后，颈椎脱臼致死，并取所需器官进行各项指标测定。
3. 试验结果
通过试剂盒对小鼠血液中的SOD、MDA、CAT和GSH-PX进行活性测定，结果见表2。可以看出，实施例1组到3组与正常对照组之间均没有显著性差异，而模型组与实施例3组和正常对照组之间均有显著性差异，甚至是极显著性差异，以此说明了紫背天葵皂甙能够有效修复过氧化氢对小鼠机体的损害，即紫背天葵皂甙具有较强的抗氧化性。另外，通过对各组小鼠脾脏、胸腺的重量指数分析，实施例1组到3组与正常对照组之间均没有显著性差异，而模型组与实施例3组和正常对照组之间均有显著性差异，说明了紫背天葵皂甙对小鼠的免疫器官具有良好的保护作用，进一步说明了紫背天葵皂甙能够增强免疫力，可以作为增强免疫力的药物开发利用。
表2 紫背天葵皂甙对小鼠血液中的SOD、MDA、CAT和GSH-PX活性影响
组别 SOD/U GSH-PX/U CAT/U/ml MDA/mmol/ml
实施例1组 735.2±12.21 70.26±2.57 12.47±0.97 6.67±0.34
实施例2组 757.4±13.41 71.32±3.14 11.67±1.03 6.54±0.42
实施例3组 766.1±14.11 69.38±3.22 12.85±0.98 6.70±0.28
模型组 665.4±15.37** 65.77±5.69* 8.89±1.95* 4.89±0.65**
正常对照组 777.3±14.35 73.57±3.64 13.07±0.89 6.99±0.12
注：**P<0.01；*P<0.05。

Claims (10)

1.一种紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，具体步骤为：
预处理：选取紫背天葵鲜嫩叶，去除杂物、清洗干净后待用；
粉碎：将处理好的紫背天葵叶干燥并粉碎成粉末；
脱脂：将步骤（2）制得的紫背天葵叶粉末中加入石油醚，超声波冷浸，然后过滤除去滤液，滤渣挥发干溶剂后得到紫背天葵叶脱脂品，备用；
粗皂甙提取：将步骤（3）脱脂后的紫背天葵叶粉末加入乙醇液超声波提取，连续提取两次；
提取液浓缩：将步骤（4）中得到的提取液进行真空旋转蒸发得到浓缩液；
沉淀处理：将步骤（5）得到的浓缩液加入乙醇，进一步沉淀去除杂质；
离心：离心去除沉淀，保留上清液备用；
萃取：将步骤（7）离心之后的上清液中加入乙醚，充分搅拌，静置萃取；
蒸干：将步骤（8）得到的萃取液混合，并进行真空旋转蒸发得到浓缩液，得到蒸发浓缩液后进行冷冻干燥得到了紫背天葵粗皂甙；
纯化：将步骤（9）制得的紫背天葵粗皂甙溶解，利用大孔树脂进行进一步的分离；
分析：通过香草醛-硫酸法测定收集各管中的皂甙含量，绘制曲线，根据曲线不同峰值，混合峰值附近的收集管中的洗脱液，蒸发浓缩并冻干不同峰值的组分。
2.如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤（2）中干燥粉碎的具体操作为：在60-75℃真空干燥箱中干燥 12-16.5h，粉碎后过孔径为 0.21-0.36mm的筛。
3.如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）中在进行超声波操作时，超声波冷浸2-4h后，再静置0.5-1h，冷浸过程中不断搅拌，搅拌速率为100-150r/min；所述紫背天葵叶粉末与石油醚的质量比为1：8-11。
4.如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤（4）中所述紫背天葵叶脱脂粉末与提取液乙醇的质量比为1：25-36；加入质量分数为46-55%的乙醇液超声波提取，提取温度为45-50℃，连续提取两次，第一次提取时间为35-40min，第二次提取时间为30-34min。
5.如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤（5）中蒸发条件具体为：真空度为0.02-0.07MPa，冷凝水的温度为-8- -10℃，回收温度为48-55℃。
6.如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，在步骤（10）层析操作之前，通过AB-8大孔树脂进行脱色实验，使用6-8%的乙醇液洗脱2-3个柱体积，最终以75-80%的乙醇回收，进行脱色处理。
7.如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤（10）大孔树脂经68-75%的乙醇液、蒸馏水浸泡，清洗后装柱，并以蒸馏水充分清洗层析柱，上样后分别以水和不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱。
8.如权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤（10）中的大孔树脂为AB-8、Diaion HP-10、Diaion HP-20、HPD-450和Amberlite XAD-4。
9.如权利要求8所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法，其特征在于，步骤（10）中的大孔树脂为Amberlite XAD-4。
10.权利要求1所述的紫背天葵皂甙的分离纯化方法所制得的紫背天葵皂甙在制备增强免疫力药物或保健品中的应用。
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