CN109453212A - 一种具有抗癌作用的毛诃子提取物及其有效部位制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及毛诃子抗癌活性部位及其制备方法，包括对含有活性成分部位的提取，以及采用大孔吸附树脂进行富集的工艺研究，还包括对活性成分中有效成分的鉴定，以及该活性部位用于体内或体外抑制肝癌HepG2、肺癌A549、肺腺癌NCI‑H1703、胃癌BGC823、骨肉瘤细胞MG‑63、结直肠癌HCT116、乳腺癌MCF‑7、神经母瘤细胞shsy5y、肾癌ACHN、肝正常细胞L02、人乳腺导管癌细胞ZR75‑1、人结肠直肠腺癌细胞Colo‑205、人乳腺导管癌细胞BT‑474、人乳腺癌细胞T‑47D、人宫颈癌细胞株HeLa、肝癌细胞H22等药物中的用途。本发明将大孔吸附树脂应用毛诃子抗癌活性部位的富集方法，工艺简单、安全无毒、生产成本低，可用于工业生产，具有巨大的经济效益和较大的推广性。

Description

一种具有抗癌作用的毛诃子提取物及其有效部位制备方法
技术领域
本发明涉及毛诃子抗癌提取物及其有效部位制备方法，还涉及到该活性部位的制药用途。
背景技术
毛诃子始载于《新修本草》，是使君子科植物毗黎勒Terminalia billerica (Gaertn.) Roxb.的干燥成熟果实。又名均保奈、噶拉珠玛、作贝相、莫合、如卡、次木西、巴那、纳合、曼吉德，都离、帕肉拉等，是常用的藏药、蒙药和维药。毛诃子味苦、涩，性平，有清热解毒、收敛养血、调和诸药之功效，用于治疗各种热症、泄痢、黄水病、肝胆病、病后虚弱，且能去腐生肌、愈合伤口，使皮肤滋润光泽。在部颁标准藏药、蒙药和维药分册中，其涉及方药（剂）众多，且这些方药（剂）多具有清热解毒、收敛养血、消食、止咳的作用。
毛诃子常与诃子、余甘子配伍出现在藏药复方中，谓之“大三果”，具有清热凉血、解毒生津的作用，常用于治疗热病、发烧、劳累过度等症。其使用频繁，为众多藏药复方的基础方，且在此基础方中毛诃子作为辅助药，性平，味涩、苦，助君药清热解毒、收敛养血。
现代药理研究表明，毛诃子具有抗氧化、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化等功效，还可用于治疗腹泻和四氯化碳所致的肝损伤等症。其提取物经乙酸乙酯萃取后，其乙酸乙酯部位具有较强的清除DPPH自由基的能力，显示出较好的抗氧化活性。此外，毛诃子提取物可显著提高链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血浆中胰岛素、C肽和糖耐量水平，降低血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、尿素、尿酸和肌酐水平。体外溶栓实验还发现毛诃子溶栓活性达32.95%，可作为未来溶栓候选药物。另外，毛诃子丙酮提取物对四氯化碳诱导的肝损伤模型具有很好的保护作用，能恢复肝功能各项指标（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、白蛋白）和肝氧化应激指标（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽），提示该植物在在减轻肝脏氧化应激和组织损伤方面的治疗潜力。相关学者通过体内实验发现毛诃子抑制腹泻率为41.87%，可作为一种治疗腹泻的有效药物。
虽然现有研究发现毛诃子具有诸多药理活性，但是对于毛诃子在抗癌活性方面的研究，特别是抗癌活性部位提取富集等工艺方面的技术发展仍然存在显著的差距，现有技术中对毛诃子抗癌活性研究也不全面，且2015版《中国药典》中仅对毛诃子药材进行性状鉴别和显微鉴别、理化鉴别。因此，本申请旨在对毛诃子有效部位的提取富集工艺、质量控制方法、抗癌活性进行研究，为毛诃子开发利用提供依据。
发明内容
本发明涉及毛诃子抗癌提取物及其活性部位制备方法，包括对含有活性成分部位的提取，以及采用大孔吸附树脂进行富集的工艺研究，还包括对活性成分中有效成分的鉴定，解决了长期以来抗癌活性研究不明确、提取富集工艺不全面，现有提取工艺有效成分含量低等不足。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种毛诃子抗癌活性部位的制备方法，其特征在于，采用含水有机溶剂从毛诃子中得到具有抗癌活性成分的提取物，然后使用大孔吸附树脂对抗癌活性成分进行富集即得；
（1）将树脂材料先用90-100%的含水有机溶剂浸泡12-48h，用4-10BV 90-100%的含水有机溶剂动态洗脱，再用水洗至无味；用5%酸溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；用5%碱溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；然后用95%的含水有机溶剂洗至洗脱液与水混合（1:5）无白色浑浊；再用水洗至无味，备用；
（2）取毛诃子药材，粉碎，使用8-12倍量50-70%含水有机溶剂提取1-3次，每次8-12h，提取液过滤，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，经减压回收，浓缩，即得具有抗癌活性成分的提取物，所述具有抗癌活性成分的提取物中活性成分含量不低于19.1%，不含100%；
（3）将上述具有抗癌活性成分提取物，加水稀释至一定浓度，以3000r/min离心30min后，得到的上清液按生药量与树脂体积比为1:2-1:5上样于大孔树脂柱（树脂柱径高比为1:7-1:9），吸附速度分别为0.5-2ml/min，吸附完成后，用0-15%含水有机溶剂洗脱1.5-3BV，流速为0.5-2ml/min。再用60-80%含水有机溶剂洗脱4-6BV，洗脱流速为0.5-2ml/min，收集洗脱液，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压浓缩，干燥，即得毛诃子抗癌活性部位，所得抗癌活性部位中有效成分含量不低于51%，不含100%。
毛诃子抗癌活性部位的制备方法，其特征在于，具有抗癌活性成分的提取物制备时，粉碎目数为5-10目；有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮中的任一种；所述具有抗癌活性成分的提取物中活性成分含量不低于19.1%，不含100%。
所述树脂材料选自非极性吸附树脂、极性大孔树脂材料中的任一种，所得抗癌活性部位中有效成分含量不低于51%，不含100%。
所述树脂选自HPD100、HPD400、HPD826、AB-8、DM130、NKA-9、D101中的任一种及其性能相似的大孔树脂。
步骤（1）中酸选择强酸，碱选择强碱，优选的，强酸选择硫酸、盐酸中的任一种，强碱选择氢氧化钠、氢氧化钾中的任一种。
一种毛诃子抗癌活性部位，其特征在于，取毛诃子药材，粉碎，使用8-12倍量50-70%含水有机溶剂提取1-3次，每次8-12h，提取液过滤，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压回收，浓缩，即得具有抗癌活性成分的提取物，所述具有抗癌活性成分的提取物中活性成分含量不低于19.1%，不含100%。
所述的抗癌活性部位，其特征在于，将所述具有抗癌活性成分提取物，加水稀释至一定浓度，以3000r/min离心30min后，得到的上清液按生药量与树脂体积比为1:2-1:5上样于大孔树脂柱柱（树脂柱径高比为1:7-1:9），吸附速度分别为0.5-2ml/min，吸附完成后，用0-15%含水有机溶剂洗脱1.5-3BV，流速为0.5-2ml/min。再用60-80%含水有机溶剂洗脱4-6BV，洗脱流速为0.5-2ml/min，收集洗脱液，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压浓缩，干燥，即得毛诃子抗癌活性部位，所得抗癌活性部位中有效成分含量不低于51%，不含100%。
毛诃子抗癌活性部位，其特征在于，所述抗癌活性部位中活性成分至少包括鞣质类，还含有黄酮、酚酸类、苯甲酸、糖苷等成分；优选的，所述鞣质类至少包含诃子次酸、诃子酸、诃子宁、诃黎勒酸、诃子鞣酸、柯里拉京（鞣云实素）、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖；2,3-二-O-没食子酰基-1,5-脱水葡萄糖醇、3,3'-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃木糖苷、安石榴苷A、安石榴苷B；优选的，所述酚酸类至少包含没食子酸、3,6-二没食子酰葡萄糖、没食子酰葡萄糖、没食子酸甲酯、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、没食子酰肉豆蔻酸酯；鞣花酸、鞣花酸脱氧已糖；3,3'-二甲氧基鞣花酸、3,4-二甲氧基鞣花酸、3,3',4-三甲氧基鞣花酸、（+）-南烛树脂酚、云实酸、丁香酸、芥子酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、对羟基苯甲酸、莽草酸、奎宁酸、丁香苷；优选的，所述苯甲酸类至少包含2,3,4,5,6-五羟基苯甲酸。
一种如上所述方法制得的毛诃子抗癌活性部位、或所述毛诃子抗癌活性部位用于制备治疗癌症药物中的用途。
如上所述的用途，其特征在于，所述抗癌活性部位用于体内或体外抑制人宫颈癌细胞株HeLa、人胃癌细胞株MCF-7、人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、神经母瘤细胞shsy5y、肝癌HepG2、结直肠癌HCT116、乳腺癌MCF-7、肺癌A549、胃癌BGC823、肾癌ACHN、骨肉瘤细胞MG-63、肺腺癌NCI-H1703药物中的用途。
如上所述的用途，其特征还在于所述抗癌活性部位还可用于体内或体外抑制肝癌H22细胞用途。
本发明的优点在于：
本发明优化了大孔吸附树脂分离富集毛诃子抗癌活性部位的生产工艺。与现有技术相比，本发明采用大孔吸附树脂对毛诃子提取物进行洗脱，并比较了毛诃子大孔树脂富集部位、醇提物、除杂溶液部位和上样流出液抗癌活性，确定了经大孔树脂富集得到的部位具有最佳的抗癌活性。
本发明所得活性部位对肝癌HepG2（IC50 38.87μg/ml）、肺癌A549（IC50 37.80μg/ml）、肺腺癌NCI-H1703（IC50 12.07μg/ml）、胃癌BGC823（IC50 50.34μg/ml）、骨肉瘤细胞MG-63（IC50 27.55μg/ml）、结直肠癌HCT116（IC50 39.34μg/ml）、乳腺癌MCF-7（IC50 47.32μg/ml）、神经母瘤细胞shsy5y（IC50 38.51μg/ml）、肾癌ACHN（IC50 62.30μg/ml）、肝正常细胞L02（IC50 78.62μg/ml）、人乳腺导管癌细胞ZR75-1（IC50 27.33µg/mL）、人结肠直肠腺癌细胞Colo-205（IC50 36.63µg/mL）、人乳腺导管癌细胞BT-474（IC50 50.67µg/mL）、人乳腺癌细胞T-47D（IC50 35.98µg/mL），人宫颈癌细胞株HeLa（IC50 31.25µg/mL）、肝癌H22细胞等均有很好的抑制作用。
本发明所使用的溶剂不包括氯仿，甲苯等毒性大、价格贵的有机溶剂，而使用价格低廉、无毒的乙醇，降低了生产成本和毒性。
本发明仅采用大孔吸附树脂对毛诃子抗癌活性部位进行富集，简化工艺流程，有利于企业工业化生产。
附图说明
图1为毛诃子抗癌有效部位对10种不同肿瘤细胞株的抑制率曲线。
具体实施方式
实施例一
（1）将HPD826树脂材料先用95%的乙醇溶剂浸泡24h，用5BV95%的乙醇溶剂动态洗脱，再用水洗至无味；用5%HCl溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；用5%NaOH溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；然后用95%的乙醇溶剂洗至洗脱液与水混合（1:5）无白色浑浊；再用水洗至无味，备用；
（2）取毛诃子药材，粉碎过5目筛，使用10倍量50%含水乙醇溶剂提取3次，每次10h，提取液过滤，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压回收，浓缩，即得具有抗癌活性成分的提取物，所述具有抗癌活性成分的提取物中活性成分含量为19.76%；
（3）将上述具有抗癌活性成分提取物，加水稀释至0.2g生药/ml，以3000r/min离心30min后，得到的上清液按生药量与树脂体积比为1:2-1:5上样于大孔树脂柱（树脂柱径高比为1:7），吸附速度分别为1ml/min，吸附完成后，用10%乙醇溶剂洗脱2BV，流速为0.5ml/min。再用70%乙醇溶剂洗脱5BV，洗脱流速为2ml/min，收集70%乙醇洗脱液，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压浓缩，干燥，即得毛诃子抗癌活性部位，所得抗癌活性部位中有效成分含量为52.48%。
经鉴定，所得抗癌活性部位中含有没食子酰葡萄糖、诃子次酸、三没食子酰葡萄糖、诃子宁、柯里拉京、三没食子酰葡萄糖（鞣云实素）、诃子鞣酸、四没食子酰葡萄糖、诃子酸、五没食子酰葡萄糖、没食子酸、鞣花酸、3,6-二没食子酰葡萄糖、没食子酰葡萄糖、没食子酸甲酯、鞣花酸脱氧已糖、2,3,4,5,6-五羟基苯甲酸。
实施例二
（1）将HPD400树脂材料先用90%的乙醇溶剂浸泡12h，用10BV90%的乙醇溶剂动态洗脱，再用水洗至无味；用5%HCl溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；用5%KOH溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；然后用90%的乙醇溶剂洗至洗脱液与水混合（1:5）无白色浑浊；再用水洗至无味，备用；
（2）取毛诃子药材，粉碎过10目筛，使用8倍量70%含水乙醇溶剂提取1次，每次8h，提取液过滤，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压回收，浓缩，即得具有抗癌活性成分的提取物，所述具有抗癌活性成分的提取物中活性成分含量为19.26%；
（3）将上述具有抗癌活性成分提取物，加水稀释至0.25g生药/ml，以3000r/min离心30min后，得到的上清液按生药量与树脂体积比为1:2-1:5上样于大孔树脂柱（树脂柱径高比为1:9），吸附速度分别为0.5ml/min，吸附完成后，用10%乙醇溶剂洗脱1.5BV，流速为2ml/min。再用70%乙醇溶剂洗脱4BV，洗脱流速为0.5ml/min，收集70%乙醇洗脱液，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压浓缩，干燥，即得毛诃子抗癌活性部位，所得抗癌活性部位中有效成分含量为51.22%。
经鉴定，所得抗癌活性部位中含有没食子酰葡萄糖、诃子次酸、三没食子酰葡萄糖、诃子宁、柯里拉京、三没食子酰葡萄糖（鞣云实素）、诃子鞣酸、四没食子酰葡萄糖、诃子酸、五没食子酰葡萄糖、没食子酸、鞣花酸、3,6-二没食子酰葡萄糖、没食子酰葡萄糖、没食子酸甲酯、鞣花酸脱氧已糖、2,3,4,5,6-五羟基苯甲酸。
实施例三
（1）将AB-8树脂材料先用100%的乙醇溶剂浸泡48h，用4BV100%的乙醇溶剂动态洗脱，再用水洗至无味；用5%硫酸溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；用5%NaOH溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；然后用100%的乙醇溶剂洗至洗脱液与水混合（1:5）无白色浑浊；再用水洗至无味，备用；
（2）取毛诃子药材，粉碎过7目筛，使用12倍量50%含水乙醇溶剂提取2次，每次12h，提取液过滤，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压回收，浓缩，即得具有抗癌活性成分的提取物，所述具有抗癌活性成分的提取物中活性成分含量为19.31%；
（3）将上述具有抗癌活性成分提取物，加水稀释至0.15g生药/ml，以3000r/min离心30min后，得到的上清液按生药量与树脂体积比为1:2-1:5上样于大孔树脂柱（树脂柱径高比为1:6），吸附速度分别为1ml/min，吸附完成后，用15%乙醇溶剂洗脱2BV，流速为2ml/min。再用80%乙醇溶剂洗脱6BV，洗脱流速为2ml/min，收集80%乙醇洗脱液，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压浓缩，干燥，即得毛诃子抗癌活性部位，所得抗癌活性部位中有效成分含量为51.02%。
经鉴定，所得抗癌活性部位中含有没食子酰葡萄糖、诃子次酸、三没食子酰葡萄糖、诃子宁、柯里拉京、三没食子酰葡萄糖（鞣云实素）、诃子鞣酸、四没食子酰葡萄糖、诃子酸、五没食子酰葡萄糖、没食子酸、鞣花酸、3,6-二没食子酰葡萄糖、没食子酰葡萄糖、没食子酸甲酯、鞣花酸脱氧已糖、2,3,4,5,6-五羟基苯甲酸。
实施例四
（1）将NKA-9树脂材料先用90%的乙醇溶剂浸泡36h，用8BV90%的乙醇溶剂动态洗脱，再用水洗至无味；用5%HCl溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；用5%NaOH溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；然后用90%的乙醇溶剂洗至洗脱液与水混合（1:5）无白色浑浊；再用水洗至无味，备用；
（2）取毛诃子药材，粉碎过8目筛，使用10倍量70%含水乙醇溶剂提取3次，每次10h，提取液过滤，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压回收，浓缩，即得具有抗癌活性成分的提取物，所述具有抗癌活性成分的提取物中活性成分含量为19.18%；
（3）将上述具有抗癌活性成分提取物，加水稀释至0.2g生药/ml，以3000r/min离心30min后，得到的上清液按生药量与树脂体积比为1:2-1:5上样于大孔树脂柱（树脂柱径高比为1:8），吸附速度分别为2ml/min，吸附完成后，用5%乙醇溶剂洗脱2.5BV，流速为1.5ml/min。再用70%乙醇溶剂洗脱5BV，洗脱流速为1ml/min，收集70%乙醇洗脱液，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压浓缩，干燥，即得毛诃子抗癌活性部位，所得抗癌活性部位中有效成分含量为51.21%。
经鉴定，所得抗癌活性部位中含有没食子酰葡萄糖、诃子次酸、三没食子酰葡萄糖、诃子宁、柯里拉京、三没食子酰葡萄糖（鞣云实素）、诃子鞣酸、四没食子酰葡萄糖、诃子酸、五没食子酰葡萄糖、没食子酸、鞣花酸、3,6-二没食子酰葡萄糖、没食子酰葡萄糖、没食子酸甲酯、鞣花酸脱氧已糖、2,3,4,5,6-五羟基苯甲酸。
实施例五
一、抗癌活性研究（I）
1仪器与试药
仪器：MCO-15A型CO2培养箱（日本三洋电机国际贸易有限公司公司）；超净工作台（北京半导体设备一厂）；DT5-6A型台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）；NikonTi-S倒置显微镜（日本Nikon公司）；Model680型酶联免疫检测仪（美国BIO-RAD公司）。
试药：RPMI1640培养基（美国HyClone公司）；胎牛血清（美国GIBCO公司）；0.25%Trypsin-EDTA（美国HyClone公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Amresco公司）；DMSO（美国Sigma公司）。
实验细胞株：人宫颈癌细胞株HeLa、人胃癌细胞株MCF-7、人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2。
2方法
2.1主要试剂及药物的配制
毛诃子抗癌活性部位（富集部位）、毛诃子醇提取物、毛诃子上样流出液（大孔树脂富集弃去液），称取四种药物各200mg于2mL容量瓶中，加入DMSO超声溶解至完全溶解，定容，摇匀。储藏在-20℃，备用。
2.2细胞复苏
从液氮罐中取出冻存管，立刻放入37℃水浴中，振摇1~2min使其尽快融化，冻存管口保持液面以上防止污染，溶化后将冻存管擦干，酒精消毒后放入超净台，迅速将冻存管中的细胞悬液转移至离心管，800r/min离心5min，缓缓弃去上清液，加入3min培养基，轻轻吹打，使其吹打成均匀的细胞悬液，转移到已加适量培养基的25m2培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱中继续培养。每12h换液一次。
2.3细胞传代
将培养瓶从细胞培养箱中拿出，置显微镜下观察，当细胞长至80%-90%时可进行传代，首先倒去培养瓶中的旧培养基，用PBS溶液清洗2次，弃去PBS溶液，加0.25%胰酶1mL，轻摇培养瓶，使其均匀分布于平底，迅速放入细胞培养箱中消化。细胞变圆透亮，将离开平底时迅速拿进超净台，垂直放置，弃去胰酶，加3mL完全培养基终止消化，轻轻吹打，使平底细胞尽快脱落，呈单细胞状态，取1mL细胞悬液，加入到已经加好培养基的细胞培养瓶中，轻轻晃动，使细胞均匀分布，完成细胞传代后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中。
2.4细胞铺板
取对数期的细胞，PBS溶液清洗后用胰酶消化，加培养基3mL吹打成单细胞悬液。采用计数板计数，调整细胞浓度，以每孔4*103个细胞接种于96孔板中，X=4*A/N，（A为根据计数板计数所推算出所需细胞的量，N为计数结果的均值）。接种完成后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24h。
2.5细胞给药和MTT法检测
将96孔板分组并进行以下试验：阳性对照组、毛诃子抗癌活性部位（富集部位）、毛诃子醇提取物、毛诃子上样流出液（大孔树脂富集弃去液）。96孔板在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24h后，弃去培养基，给药孔每孔加入6.25、12.5、25、50、100、200µg/mL的样品各150µL。阳性对照为5-FU，各组均设4个复孔。给药后置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养48h。每孔加入150µL的MTT溶液，轻轻振药96孔板后，继续置于培养箱中培养4h后，弃去MTT溶液，用吸水纸吸干后加DMSO溶液150µL，置于微震动仪震动10min充分溶解，充分溶解后于酶标仪上570nm处测定OD值，计算抑制率。
3 结果
表1不同部位对4种不同肿瘤细胞株增殖抑制作用
采用MTT法测定分别对人肺癌细胞株A549、人胃癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株HepG2、人宫颈癌细胞株HeLa增殖的影响。经研究发现毛诃子抗癌活性部位（富集部位）、醇提物分别对4种细胞有不同程度的抑制作用，且此抑制作用随着药物浓度的增加而增大。毛诃子上样流出液确未发现对4种癌细胞有抑制生长的作用。结果表明毛诃子鞣质部位、毛诃子醇提物、毛诃子除杂部位具有显著的抗癌活性，尤其是对MCF-7细胞有较好的抑制活性的作用。
二、抗癌活性研究（II）
1 实验材料
1.1药品与试剂
毛诃子药材（购自北京藏医院，产地尼泊尔），经北京中医药大学生药系阎玉凝教授鉴定为使君子科植物毗黎勒Terminalia bellirica（Geartn.）Roxb.的干燥成熟果实。
1.2细胞株
人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞BGC823、人乳腺癌细胞MCF-7、人结直肠癌细胞HCT116、人神经母瘤细胞SH-SY5Y、人肾癌细胞ACHN、人骨肉瘤细胞MG-63、人肺腺癌细胞NCI-H1703、人正常肝细胞L02生物实验室冻存。
1.3主要仪器
MCO-15A型CO2培养箱（日本三洋电机国际贸易有限公司），超净工作台（北京半导体设备一厂），DT5-6A型台式离心机（北京时代北利离心机有限公司），Axiovret135A倒置显微镜（德国ZEISS公司），PB303-S电子天平（北京Sartorius仪器有限公司），KQ2200B超声仪（昆山市超声仪器有限公司），SpectraMax190酶标仪（美国分子仪器公司），细胞培养板及培养瓶（美国Corning公司），移液枪（德国Eppendorf公司），YX-280D型手提式压力蒸汽锅（合肥市华泰医疗设备有限公司）
1.4主要试剂
环磷酰胺（CTX，山西普德药业股份有限公司），RPMI1640培养基（美国GibcoBRL公司），胰蛋白酶（美国Corning公司），双抗（美国Corning公司），PBS缓冲液（美国Corning公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司），噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司）。
2 实验方法
2.1 溶液配制
毛诃子粗提物的制备：取毛诃子药材粉碎（过50目筛），用乙醇提取、过滤，浓缩后蒸干研磨，得毛诃子粗提物。取提取物，精密称定，置2ml容量瓶中，DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀，配成100mg/mL的粗提物溶液。0.22μm微孔滤膜过滤，细胞给药时采用等比稀释法稀释到各工作浓度，其中每个浓度的含药培养基中所含DMSO终浓度均小于0.1%。
MTT储存液：精密称取MTT粉末250mg，将其溶于50mlPBS缓冲盐中，搅拌，待其充分溶解后，0.22µm孔径生物滤膜过滤除菌，分装，然后置于-20℃保存备用。
2.2 MTT试验检测毛诃子细胞毒活性
2.2.1 实验原理
本实验采用MTT法检测细胞体外存活率，表征试验药物体外抑制肿瘤细胞增殖作用的强弱。
2.2.2 细胞培养
MCF-7、HepG2、A549、HepG2、BGC823、MCF-7、HCT116、SH-SY5Y、ACHN、MG-63、NCI-H1703、人正常肝细胞L02细胞接种（密度以2×104cells/mL为宜）于25cm2的细胞培养瓶中，加入5mL含10%胎牛血清、100U/mL青、链霉素的RPMI-1640培养液，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱培养。隔天换液，待细胞单层长到80%～90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化，传代，取对数生长期细胞进行后续实验。
2.2.3细胞复苏
将细胞冻存管迅速从液氮中取出转移到37℃水浴中，将冻存管的盖子保持在液面以上避免污染，不断搅拌加速解冻。当细胞完全解冻后，消毒冻存管，将解冻后的细胞悬液转移至含完全培养基的离心管中，1000rpm，离心5min。弃去上清液，将细胞重悬于新鲜培养基中，转移至细胞培养瓶中。倒置显微镜下观察细胞的密度及存活率，如果细胞密度过高，可用培养基稀释至适宜浓度。37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。
2.2.4细胞传代
将细胞已融合80%～90%的培养瓶中的旧培养基弃去，PBS缓冲液清洗2次，滴加0.25%胰蛋白酶溶液0.33mL，于37℃、5%CO2培养箱中消化适宜时间，待细胞缩回变圆透亮，从瓶底滑落时，立即加入4mL含10%FBS的细胞培养液终止消化，用吸管将贴在壁上的细胞轻轻吹打成单细胞悬液，分到另外的培养瓶中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养。第二天观察细胞贴壁情况。传代比例参照细胞培养说明。
2.2.5细胞计数
将血盖片盖在血球计数板上，再将细胞正常消化，并缓缓混匀成细胞悬液，用对应的细胞培养基稀释n倍，使细胞处于合适的密度。然后取移液器取10μL沿盖玻片边缘缓慢打入，保证血盖片下充满悬液，避免出现气泡，影响数据的准确度。再将计数板置于显微镜下观察，并用计数器计数,统计四角的四个区域中的细胞数目，求取算术平均数。细胞密度计算方法如下:
（细胞数）/mL=（四个区域细胞总数/4）×n×104
2.2.6细胞冻存
预先配制冻存液：20%胎牛血清，10%二甲基亚砜（DMSO），70%基础培养基。取对数生长期的细胞常规消化成单细胞悬液，计数。细胞悬液离心，1000rpm离心5min。弃上清，将沉淀细胞重悬于细胞冻存液中，分装入冻存管中，每管1.5mL，封口，密封标记细胞种类和冻存日期以及实验人。将细胞冻存管置于-20℃冰箱中约1h，然后再转移至-80℃冰箱中。
2.3 MTT实验
取对数生长期的肿瘤细胞，0.25%胰蛋白酶常规消化成单细胞悬液，调整细胞密度至4000cells/孔左右，接种于96孔培养板中，每孔100μL，置37℃、5%CO2培养箱中培养12h，待细胞贴壁后给药。给药组每孔加入100μL的含药培养基使其终浓度达到6.25mg/L、12.50mg/L、25.05mg/L、50.05mg/L、100.05mg/L、200.05mg/L；阴性对照组为含0.1%DMSO的细胞培养基；空白对照组每孔加150μL的细胞培养基；各组均设4个复孔。给药后置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养48h后，吸弃孔中含药培养基，再每孔加入150μL含MTT的培养基溶液，37℃继续培养4h后，弃去培养液，每孔加入150μLDMSO，震荡10min，使结晶物甲瓒充分溶解。用酶标仪测定各孔在570nm处的吸光度（OD）值。按下式计算生长抑制率，求出IC50，评价药效。以上实验重复3次。 细胞生长抑制率=（阴性对照孔OD值-给药组OD值）/（阴性对照组OD值-空白组OD值）×100%。
3 结果
表2毛诃子醇提取物对10种细胞珠的IC50（μg/ml）值
三、体内抑制H22肝癌荷瘤小鼠实验
1仪器材料
动物：ICR小鼠，18~22g，雄性，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。
细胞株：小鼠肝癌细胞H22，冻存与北京中医药大学生物制药系。
药品与试剂：环磷酰胺（CTX），山西普德药业股份有限公司生产；RPMI1640培养基美国GibcoBRL公司生产；胰蛋白酶，双抗，均购自于北京拜尔迪生物技术有限公司；胎牛血清，购自杭州四季青生物工程有限公司；PBS缓冲液，美国Hyclone公司生产。
仪器：KQ-500DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；MCO-15A型CO2培养箱，日本三洋电机国际贸易有限公司产品；超净工作台，北京半导体设备一厂产品；DT5-6A型台式离心机，北京时代北利离心机有限公司；Axiovret135A倒置显微镜，德国ZEISS公司产品；细胞培养板及培养瓶，美国Corning公司产品；微量移液器，德国Eppendorf公司产品；YX-280D型手提压力蒸汽锅，合肥市华泰医疗设备有限公司产品。
2 实验方法
2.1模型制备
将H22肝癌细胞株置于RPMI1640培养液（含10%FBS）中，调整细胞浓度为5×106cell/mL，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内进行培养，48h后，收集细胞，经无菌PBS稀释后，接种入传代小鼠腹腔内，无菌条件下抽取接种7d的H22腹水瘤小鼠的腹水，加入PBS调整细胞悬液中肿瘤细胞至1×107个/mL。台盼蓝染色进行活细胞计数、检查细胞活性＞95%，在超净工作台中于小鼠右前肢腋部皮下接种细胞悬液，每只0.2mL，建立实体瘤模型。
2.2分组与给药
于皮下接种癌细胞24h后，随机分为5组，每组12只，即模型组，环磷酰胺组（CTX），毛诃子鞣质部位低、中、高剂量组。另取12只未接瘤小鼠作为空白对照组。
给药方法：空白组与模型组均灌胃去离子水，毛诃子鞣质部位低、中、高剂量分别灌胃0.5g/kg·BW、1.0g/kg·BW、2.0g/kg·BW的药液，给药量为10mL/kg·BW，连续给药10d；环磷酰胺组为腹腔注射环磷酰胺0.1g/kg·BW，给药量为5mL/kg·BW，每3天给药1次。
2.3计算抑瘤率、胸腺指数及脾指数
停药次日，小鼠称重，颈椎脱臼法处死，取肿瘤组织，剔除脂肪，称取肿瘤湿重，计算肿瘤抑制率。分别剥取小鼠的脾脏和胸腺，计算脏器指数。
抑瘤率（%）=（模型组平均瘤重-给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%
胸腺指数=胸腺重（mg）/体重（g）
脾脏指数=脾脏重（mg）/体重（g）
3 统计学处理
用SAS8.2统计学软件进行统计分析。计量资料采用±s表示。组间比较用单因素方差分析和独立样本t检验。
4 结果
4.1各组小鼠肿瘤重量及抑瘤率比较
小鼠肿瘤重量：对照组和实验组与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。
表3毛诃子鞣质部位对荷肝癌H22移植瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响（±s）（n=8）
注：与空白组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
4.2各组小鼠胸腺指数及脾指数比较
与空白组比较，毛诃子鞣质部位低、中、高剂量组、模型、阳性组胸腺指数均降低，脾脏指数均升高，且毛诃子鞣质部位中、高剂量组、模型、阳性组胸腺指数均具有显著性差异（P<0.05）；毛诃子鞣质部位低、中、高剂量组、模型组脾脏指数均具有显著性差异（P<0.05）。
与模型组比较，毛诃子鞣质部位低、中、高剂量组胸腺指数均未见显著性变化，但阳性组胸腺指数降低，且差异显著（P<0.05），说明阳性药对小鼠胸腺有明显影响，而毛诃子鞣质部位对胸腺造成的影响是在与对小鼠荷瘤的共同作用下，药物自身对小鼠的胸腺影响并不明显。毛诃子鞣质部位低、中、高剂量组脾脏指数均有降低，且差异显著（P<0.05），说明药物均对小鼠脾脏有影响。见表4。
毛诃子鞣质部位对小鼠H22肝癌细胞的瘤块生长均有一定的抑制作用。与模型组相比，毛诃子鞣质部位低、中、高剂量，环磷酰胺组对小鼠肿瘤抑制率分别为23.20%，36.00%，55.20%，87.20%。毛诃子鞣质部位对H22肝癌荷瘤小鼠模型的胸腺指数无显著影响，脾脏指数有一定影响。这些结果表明，毛诃子鞣质部位在发挥抑制肿瘤作用的同时，其药物不良反应及对胸腺的影响较小，对脾脏有一定影响。
表4毛诃子鞣质部位对荷肝癌H22移植瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响（±s）（n=8）
注：与空白组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

Claims (10)

1.一种毛诃子抗癌活性部位的制备方法，其特征在于，采用含水有机溶剂从毛诃子中得到具有抗癌活性成分的提取物，然后使用大孔吸附树脂对抗癌活性成分进行富集即得；
（1）将树脂材料先用90-100%的含水有机溶剂浸泡12-48h，用4-10 BV、90-100%的含水有机溶剂动态洗脱，再用水洗至无味；用5%酸溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；用5%碱溶液浸泡3h后，3BV洗脱，用水洗至中性；然后用95%的含水有机溶剂洗至洗脱液与水混合（1:5）无白色浑浊；再用水洗至无味，备用；
（2）取毛诃子药材，粉碎，使用8-12倍量50-70%含水有机溶剂提取1-3次，每次8-12h，提取液过滤，在-0.06～-0.09 MPa、45～50℃条件下，经减压回收，浓缩，即得具有抗癌活性成分的提取物，所述具有抗癌活性成分的提取物中活性成分含量不低于19.1%，不含100%；
（3）将上述具有抗癌活性成分提取物，加水稀释至一定浓度，以3000r/min离心30min后，得到的上清液按生药量与树脂体积比为1:2～1:5上样于大孔树脂柱（树脂柱径高比为1:7-1:9），吸附速度分别为0.5-2 ml/min，吸附完成后，用0-15%含水有机溶剂洗脱1.5-3BV，流速为0.5-2 ml/min，再用60-80%含水有机溶剂洗脱4-6 BV，洗脱流速为0.5-2 ml/min，收集洗脱液，在-0.06～-0.09 MPa、45～50℃条件下，减压浓缩，干燥，即得毛诃子抗癌活性部位，所得抗癌活性部位中有效成分含量不低于51%，不含100%。
2.如权利要求1所述的毛诃子抗癌活性部位的制备方法，其特征在于，具有抗癌活性成分的提取物制备时，粉碎目数为5-10目；有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮中的任一种；所述具有抗癌活性成分的提取物中活性成分含量不低于19.1%，不含100%；
所述树脂材料选自非极性吸附树脂、极性大孔树脂材料中的任一种，所得抗癌活性部位中有效成分含量不低于51%，不含100%。
3.如权利要求2所述的毛诃子抗癌活性部位的制备方法，其特征在于，所述树脂优选自HPD100、HPD400、HPD826、AB-8、DM130、NKA-9、D101中的任一种。
4.如权利要求1所述的毛诃子抗癌活性部位的制备方法，其大孔树脂处理方法其特征在于，所述步骤（1）中酸选择强酸，碱选择强碱，优选的，强酸选择硫酸、盐酸中的任一种，强碱选择氢氧化钠、氢氧化钾中的任一种。
5.一种毛诃子抗癌活性部位，其特征在于，取毛诃子药材，粉碎，使用8-12倍量50-70%含水有机溶剂提取1-3次，每次8-12h，提取过滤，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，经减压回收，浓缩，即得具有抗癌活性成分的提取物，所述具有抗癌活性成分的提取物中活性成分含量不低于19.1%，不含100%。
6.如权利要求5所述的抗癌活性部位，其特征在于，将所述具有抗癌活性成分的提取物，加水稀释至一定浓度，以3000r/min离心30min后，得到的上清液按生药量与树脂体积比为1:2～1:5上样于大孔树脂柱（树脂柱径高比为1:7-1:9），吸附速度分别为0.5-2ml/min，吸附完成后，用0-15%含水有机溶剂洗脱1.5-3BV，流速为0.5-2ml/min，再用60-80%含水有机溶剂洗脱4-6BV，洗脱流速为0.5-2ml/min，收集洗脱液，在-0.06～-0.09MPa、45～50℃条件下，减压浓缩，干燥，即得毛诃子抗癌活性部位，所得抗癌活性部位中有效成分含量不低于51%，不含100%。
7.一种毛诃子抗癌活性部位，其特征在于，所述抗癌活性部位中活性成分至少含鞣质类51%以上，包括鞣质类，还含有黄酮、酚酸类、苯甲酸、糖苷等成分；
优选的，所述鞣质类至少包含诃子次酸、诃子酸、诃子宁、诃黎勒酸、诃子鞣酸、柯里拉京（鞣云实素）、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖；2,3-二-O-没食子酰基-1,5-脱水葡萄糖醇、3,3'-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃木糖苷、安石榴苷A、安石榴苷B；
优选的，所述酚酸类至少包含没食子酸、3,6-二没食子酰葡萄糖、没食子酰葡萄糖、没食子酸甲酯、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、没食子酰肉豆蔻酸酯；鞣花酸、鞣花酸脱氧已糖；3,3'-二甲氧基鞣花酸、3,4-二甲氧基鞣花酸、3,3',4-三甲氧基鞣花酸、（+）-南烛树脂酚、云实酸、丁香酸、芥子酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、对羟基苯甲酸、莽草酸、奎宁酸、丁香苷；
优选的，所述苯甲酸类至少包含2,3,4,5,6-五羟基苯甲酸。
8.一种如权利要求1-4所述方法制得的毛诃子抗癌活性部位、或权利要求5-7所述毛诃子抗癌活性部位用于制备治疗癌症药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抗癌活性部位用于体内或体外抑制人宫颈癌细胞株HeLa、人胃癌细胞株MCF-7、人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、神经母瘤细胞shsy5y、肝癌HepG2、结直肠癌HCT116、乳腺癌MCF-7、肺癌A549、胃癌BGC823、肾癌ACHN、骨肉瘤细胞MG-63、肺腺癌NCI-H1703中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征还在于所述抗癌活性部位还可用于体内或体外抑制肝癌H22细胞用途。
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