CN116211869A - 含dna损伤修复抑制剂的药物混合物及混合方法、用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了含DNA损伤修复抑制剂的药物混合物及混合方法、用途，涉及医药技术领域。该药物组合物，包含PRMT5抑制剂；还包含有PARP抑制剂和/或熊果酸衍生物，以及一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。本发明提供的DNA损伤修复抑制剂和PRMT5抑制剂的药物组合，并采用熊果酸衍生物联合PRMT5抑制剂联合治疗方案，对肿瘤细胞有更强的抑制作用，且效果显著优于单独用药，DNA损伤修复抑制剂和熊果酸衍生物均能够有效增加PRMT5抑制剂的药效。

Description

含DNA损伤修复抑制剂的药物混合物及混合方法、用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及含DNA损伤修复抑制剂的药物混合物及混合方法、用途。
背景技术
研究表明PRMT5抑制剂具有潜在的抗肿瘤作用。目前PRMT5抑制剂开发及发展取得飞速进展，其中有些抑制剂进入临床研究阶段。但仍有一部分肿瘤患者对其不敏感。如何提高PRMT5抑制剂对于肿瘤患者的疗效是本领域亟需解决的问题。本发明的目的是提供一种针对三阴性乳腺癌患者的联合治疗方案，具体是对于三阴性乳腺癌患者使用PARP抑制剂联合PRMT5抑制剂，从而提高PRMT5抑制剂的疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供含DNA损伤修复抑制剂的药物混合物及混合方法、用途，并采用熊果酸衍生物联合PRMT5抑制剂联合治疗方案，对肿瘤细胞有更强的抑制作用，且效果显著优于单独用药，DNA损伤修复抑制剂和熊果酸衍生物均能够有效增加PRMT5抑制剂的药效。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
本发明公开熊果酸衍生物联合PRMT5抑制剂在制备预防或治疗实体肿瘤的药物中的用途。
本发明又提供了DNA损伤修复抑制剂联合PRMT5抑制剂在制备预防或治疗实体肿瘤的药物中的用途。
本发明还提供了熊果酸衍生物、PARP抑制剂联合PRMT5抑制剂在制备预防或治疗实体肿瘤的药物中的用途。本发明提供了熊果酸衍生物和/或PARP抑制剂联合PRMT5的两药联合方案用于肿瘤治疗，通过生物学活性分析后发现PARP抑制剂预处理后PRMT5抑制剂对三阴性乳腺癌细胞系Hs578t以及SUM159有更强的抑制作用，且效果显著优于单独用药，具有相加或协同增强效应。同时，通过Bliss模型量化实验证明使用的药物组合为协同作用；并且两者联合使用在皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中的体内药效作用更佳。相比传统用单药治疗，能够有效降低单药的作用浓度，避免或降低因只使用单药治疗的复发性以及获得性耐药事件的发生。本发明的抗肿瘤药物组合物为抗肿瘤治疗或预防提供了新的思路，具有巨大的应用前景。
需要说明的是，上述DNA损伤修复抑制剂选自PARP抑制剂、ATR抑制剂、WEE1抑制剂、ATM抑制剂、CHK1/2抑制剂、DNA-PK抑制剂中的一种。
具体的，PARP抑制剂选自Olaparib、Veliparib、Talazoparib、Niraparib、Rucaparib中的一种；ATR抑制剂选自elimusertib、M6620和AZD6738中的一种；WEE1抑制剂选自ZN-c3、AZD1775中的一种；ATM抑制剂选自AZD0156；CHK1/2抑制剂选自LY2606368、LY2603618、MK-8776、PF-00477736、AZD7762、CBP501、PF-477736、XL844、SRA737、GDC-0575、LY2880070中的一种；DNA-PK抑制剂选自AZD-7648、BR2002、BR101801、CC-115中的一种。
本发明进一步公开了PARP抑制剂联合PRMT5抑制剂在制备预防或治疗实体肿瘤的药物中的用途。
优选地，PARP抑制剂联合PRMT5抑制剂在制备预防或治疗三阴性乳腺癌的药物中的用途。
需要说明的是，PARP抑制剂选自Olaparib、Veliparib、Talazoparib、Niraparib、Rucaparib中的一种。
需要说明的是，PRMT5抑制剂选自GSK3326595、AMG-193、MRTX1719、TNG-908、PF-069399999、PRT543、PRT811、SH-3765、Onametostat、SCR-6920、SKL27969、SYHX2001、AGX323、BRD0639、C220、DS-437、DW14800、GSK3203591、GSK3235025、JBI-778、LLY-283、MRTX9768、MS4322、MS4369、MS4370、PF-06855800中的一种。
需要说明的是，实体肿瘤包括良性实体瘤和恶性实体瘤。
进一步的，良性实体瘤主要包括错构瘤、平滑肌瘤、血管瘤、淋巴管瘤，还有各种腺瘤和腺瘤性息肉等；恶性实体瘤包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌，还有头颈部恶性肿瘤、泌尿系统恶性肿瘤、子宫内膜癌、子宫颈癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、甲状腺癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤等。
需要说明的是，PRMT5抑制剂的剂量范围选自体内10~100mg；进一步的可以是10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg。
需要说明的是，PAPR抑制剂的剂量范围选自体内10~100mg；进一步的可以是10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg。
需要说明的是，熊果酸衍生物的剂量范围选自体内10~100mg；进一步的可以是10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg。
需要说明的是，联合的给药途径选自经口给药、胃肠外给药、经皮给药，所述胃肠外给药包括但不限于静脉注射、皮下注射、肌肉注射。
本发明还公开了一种药物组合物，包含PRMT5抑制剂，还包含有PARP抑制剂和/或熊果酸衍生物，以及一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
进一步需要说明的是，上述载体包括纳米载体。
需要说明的是，上述包覆药剂的纳米载体的制备方法，包括：
取葡聚糖与Fmoc-NH-PHis-COOH、大叶菜酸通过酯化反应制备得到胶束复合物；
取胶束复合物与药剂复混，之后采用红细胞膜、小鼠4T1肿瘤细胞膜对胶束复合物进行膜包覆处理得到包覆药剂的纳米载体。本发明构建了纳米级药物载体，采用大叶菜酸与葡聚糖、聚组氨酸等其它组分复配，制备得到胶束复合物，然后采用红细胞膜以及肿瘤细胞膜包覆在胶束复合物表面，获得纳米载体，能够有效携带药剂，载体的包封率明显增加，其载药能力得到改善；将药剂负载于载体后，够有效增强药剂的疗效，进一步增强了药剂在皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中的体内药效，增加对肿瘤细胞增殖的抑制效果。其原因可能在于大叶菜酸的加入，对胶束复合物结构产生有益影响，进一步引入活性官能团，增加载体负载药剂的能力，在微酸性肿瘤环境下，更好地释放药物，进而作用于靶位点，使得药物充分发挥作用，增强药剂的治疗效果。
具体的，上述包覆药剂的纳米载体的制备方法，步骤为：
取葡聚糖、Fmoc-NH-PHis-COOH、EDC以及DMAP溶于DMSO中（其中葡聚糖浓度为4~6mg/mL），室温下搅拌反应22~26h，然后向反应体系中加入大叶菜酸，搅拌反应22~26h；反应液在去离子水中透析2~3d，冷冻干燥，溶于DMSO中，加入二乙胺，室温反应1~3h，冰浴下在乙醚中放置沉淀，旋蒸得到胶束复合物；
杂化膜包覆处理，取胶束复合物，及药剂溶于DMSO中（其中胶束复合物与DMSO的固液比为3~5mg/mL），室温下搅拌20~40min，然后采用去离子水透析1~2d，过0.22μm微孔膜；之后与红细胞膜、小鼠4T1肿瘤细胞膜以0.4~0.6:1:1的质量比共混，并置于37℃条件下进行超声处理10~15min，经0.2μm微孔膜，制备得到包覆药剂（LLY-283或olaparib）的纳米载体。
需要说明的是，葡聚糖、Fmoc-NH-PHis-COOH、EDC以及DMAP的摩尔比为1:12~14:20:20；大叶菜酸与葡聚糖的摩尔比为6~8:1。
需要说明的是，二乙胺与Fmoc-NH-PHis-COOH的质量比为5~7:1。
需要说明的是，胶束复合物与药剂的质量比为1:0.05~0.15。
需要说明的是，PRMT5抑制剂的给药频次可以是一日一次、一日二次、一日三次、一周一次、二周一次、三周一次或一月一次；PARP抑制剂的给药频次可以是一日一次、一日二次、一日三次、一周一次、二周一次、三周一次或一月一次。
需要说明的是，本发明所述的药物组合物，可以单独给药，或者与一种或多种治疗剂联合使用。
本发明所述的“联合”是一种给药方式，是指一定时间期限内给予至少一种剂量的PRMT5抑制剂和至少一种剂量的PARP抑制剂，所述的时间期限可以是一个给药周期内，优选4周内，3周内，2周内，1周内，或24小时以内。这种期限包括这样的治疗，其中通过相同给药途径或不同给药途径给予PRMT5抑制剂、DNA损伤修复抑制剂。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了熊果酸衍生物和/或PARP抑制剂联合PRMT5的两药联合方案用于肿瘤治疗，通过生物学活性分析后发现PARP抑制剂预处理后PRMT5抑制剂对肿瘤细胞有更强的抑制作用，且效果显著优于单独用药；并通过Bliss模型量化实验验证药物组合为协同作用。同时，本发明采用大叶菜酸与葡聚糖、聚组氨酸等其它组分复配，制备得到胶束复合物，然后采用红细胞膜以及肿瘤细胞膜包覆在胶束复合物表面，获得纳米载体，其包封率明显增加，载药能力得到改善；将药剂负载于载体后，够有效增强药剂的疗效，进一步增强了药剂在对肿瘤细胞增殖的抑制效果。
因此，本发明提供了含DNA损伤修复抑制剂的药物混合物及混合方法、用途，并采用熊果酸衍生物联合PRMT5抑制剂联合治疗方案，对肿瘤细胞有更强的抑制作用，且效果显著优于单独用药，DNA损伤修复抑制剂和熊果酸衍生物均能够有效增加PRMT5抑制剂的药效。
附图说明
图1是PARP抑制剂olaparib预处理后PRMT5抑制剂LLY-283对三阴性乳腺癌细胞系Hs578t抑制效果；
图2是PARP抑制剂olaparib预处理后PRMT5抑制剂LLY-283对三阴性乳腺癌细胞系SUM159抑制效果；
图3是PARP抑制剂olaparib预处理后PRMT5抑制剂GSK3326595对三阴性乳腺癌细胞系Hs578T抑制效果；
图4是PARP抑制剂olaparib预处理后PRMT5抑制剂GSK3326595对三阴性乳腺癌细胞系SUM159抑制效果；
图5是皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中PARP抑制剂增加PRMT5抑制剂的效果；
图6是皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中熊果酸衍生物增加PRMT5抑制剂的效果；
图7是胶束复合物的核磁氢谱图；
图8是包覆药剂的纳米载体的TEM图；
图9是皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中包覆于载体中的药剂对肿瘤的抑制效果；
图10是包覆药剂的纳米载体细胞毒性测试结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
本发明实施例所用红细胞膜和4T1细胞膜的制备如下：
红细胞膜的提取：通过眼球取血的方法取C57BL/6小鼠全血，置于含有肝素钠的抗凝管中，4℃条件下、3000rpm离心5min，去除血浆，得到的沉淀物用0.9%生理盐水溶液洗涤3次；将去离子水加入沉淀物中，4℃条件下溶血1h，之后13000rpm离心5min，除去血红蛋白，用去离子水进一步冲洗红细胞膜，至上清液为无色，收集红细胞膜，置于-80℃下保存备用。
4T1细胞膜的提取：取4T1细胞置于含有1mM浓度的苯甲基磺酰氯的膜蛋白提取试剂中，冰浴条件下孵育15min，之后3000rpm离心10min，取上清液以13000rpm离心30min获得小鼠4T1细胞膜，置于-80℃下保存备用。
实施例1：
PARP抑制剂预处理后PRMT5抑制剂LLY-283对三阴性乳腺癌细胞系Hs578t以及SUM159体外药效作用研究：
1. 受试药物
药物名称：PRMT5抑制剂LLY-283，GSK3326595，PARP抑制剂olaparib。
2. 实验对象
细胞系：Hs578T，SUM159；
饲养环境：控制温度37℃、5% CO2培养箱；
培养基：
Hs578T：高糖DMEM，10%胎牛血清，1% P/S（PB180120）；
SUM159：RPMI1640，10%胎牛血清，1% P/S（PB180120）。
3. 实验步骤
Hs578T与SUM159细胞系铺六孔板，每孔30万细胞，3μM olaparib或DMSO处理3天后，胰酶消化后分为DMSO组与olaparib组重新铺板于96孔板，每孔3000个细胞，次日给药PRMT5抑制剂LLY-283或GSK3326595，浓度从10μM开始倍半，处理5天后，用CCK8检测细胞活性。
测试结果如图1-4所示。从图中分析可知，PARP抑制剂olaparib预处理后，PRMT5抑制剂LLY-283和GSK3326595分别对三阴性乳腺癌细胞系Hs578t以及SUM159的抑制效果明显好于对照组的，表明使用PARP抑制剂联合PRMT5抑制剂，能够有效提高PRMT5抑制剂对肿瘤细胞的抑制效果。
实施例2：
三阴性乳腺癌细胞系SUM159中PARP抑制剂olaparib与PRMT5抑制剂GSK3326595协同效果研究：
1. 受试药物
药物名称：PRMT5抑制剂GSK3326595，PARP抑制剂olaparib。
2. 实验动物
细胞系：SUM159；
饲养环境：控制温度37℃、5% CO2培养箱；
培养基：RPMI1640，10%胎牛血清，双抗。
3. 实验步骤
SUM159细胞系铺96孔板，每孔3000个细胞，待细胞贴壁后次日给药PRMT5抑制剂GSK3326595以及PARP抑制剂olaparib，浓度设置均从10μM开始倍半，处理5天后，用CCK8检测细胞活性。
收集实验数据，采用Bliss模型进行分析，预测癌细胞系药物组合的协同作用得分情况，对得分情况进行分析可知，Bliss模型量化实验结果表明使用的药物组合被验证为协同作用，即PARP抑制剂与PRMT5抑制剂组合在三阴性乳腺癌细胞系SUM159中具有优异的协同作用，更好地抑制肿瘤细胞的增殖。
实施例3：
PRMT5抑制剂及PARP抑制剂两药联合给药与各自单独给药对皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中的体内药效作用研究：
1. 受试药物
药物名称：PRMT5抑制剂LLY-283，PARP抑制剂olaparib。
2. 实验动物
裸鼠，5-6周龄，雌性，饲养环境：SPF级。
饲养环境：控制温度20~26℃；相对湿度：控制相对湿度40%~70%；光照：自动光照，每12h明暗交替。
3. 实验步骤
PDX模型小鼠取肿瘤分瘤块，用套管针皮下荷瘤于36只裸鼠左肋部皮下。待小鼠平均肿瘤体积达到100-150mm3时，随机分成4组，每组9只。分组后根据方案口服给予生理盐水（组1：0.5%羧甲基纤维素钠水/生理盐水）、LLY-283（组2： LL283单药组）、olaparib（组3：olaparib单药组）、LLY-283+olaparib（组4：LLY-283+olaparib联合组）；实验分组及给药方案如表1所示。每两天1次测量肿瘤体积，称体重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：
V＝0.52×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。
表1 实验分组及给药方案
Figure SMS_1
注：QDx12：3天给4天停，给药12次；QDx28：每天给药，给药28次；po：口服；i.p.：腹腔注射。
测试结果如图5所示。从图中分析可知，PRMT5抑制剂及PARP抑制剂两药联合给药组，肿瘤体积明显低于各自单独给药的，表明PARP抑制剂能够有效增加PRMT5抑制剂的疗效，两者联合使用在皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中的体内药效作用更佳。
4. 配伍计算方法
依据金氏公式计算q值，q=EA+B/(EA+EB-EA×EB)，用于判断两药物配伍使用后的效果是否优于单独给药。若q<0.55，两药作用为显著拮抗；0.55≤q<0.85，两药作用为拮抗；0.85≤q<1.15，两药作用为单纯相加；1.15≤q<20，两药作用为协同增强；q≥20，两药作用为显著增强。
从图5中的数据分析可知，给药28d后，与对照组相比，组2、组3、组4肿瘤体积减少率分别为50.87%、39.32%、81.14%，依据金氏公式，q=81.14%/(50.87%+39.32%-50.87%×39.32%)=1.16，符合1.15≤q<20，表明PRMT5抑制剂及PARP抑制剂两药的配伍对肿瘤的抑制效果为协同增强作用。
实施例4：
一种熊果酸衍生物的化学结构如式I所示：
Figure SMS_2
I。
上述熊果酸衍生物的制备方法，包括：采用5-(氯甲基)-1,2,4-二唑-3-羧酸乙酯对熊果酸结构中的羧酸基团进行化学修饰制备得到熊果酸衍生物。
具体的，上述熊果酸衍生物的制备方法，包括：
取熊果酸分散于丙酮中，加入碳酸钾和碘化钾，室温搅拌5~8h；之后加入5-(氯甲基)-1,2,4-二唑-3-羧酸乙酯，室温搅拌均匀后回流反应24~30h，试验过程中采用TLC检测反应进程，反应完全后减压蒸馏除去丙酮，加水稀释，调节pH至中性，抽滤、真空干燥，之后经硅胶柱层析纯化，减压蒸除溶剂得到熊果酸衍生物。
需要说明的是，熊果酸与丙酮的固液比为0.1~0.2g：1mL；碳酸钾与熊果酸的质量比为3~4:1；碘化钾与熊果酸的质量比为0.8~0.9:1；5-(氯甲基)-1,2,4-二唑-3-羧酸乙酯与熊果酸的质量比为1.2~1.5:1。
于本实施例中，熊果酸衍生物的制备：
按照固液比0.15g:1mL的比例取熊果酸分散于丙酮中，加入碳酸钾（与熊果酸的质量比为3.4:1）和碘化钾（与熊果酸的质量比为0.86:1），室温搅拌6h；之后加入5-(氯甲基)-1,2,4-二唑-3-羧酸乙酯（与熊果酸的质量比为1.36:1），室温搅拌均匀后回流反应25h，试验过程中采用TLC检测反应进程，反应完全后减压蒸馏除去丙酮，加水稀释，调节pH至中性，抽滤、真空干燥，之后经硅胶柱层析（洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚：三乙胺=25:75:1，v/v/v）纯化，减压蒸除溶剂得到熊果酸衍生物。
采用500M核磁共振氢谱仪对熊果酸以及待测样品结构进行表征，溶剂为氘代氯仿。相比于熊果酸的核磁氢谱图，制备得到的熊果酸衍生物的核磁氢谱中，在5.27ppm明显多出一个单峰，为与二唑环直接连接的-CH2的特征峰；在4.53ppm处明显多出一个四重峰，为5-(氯甲基)-1,2,4-二唑-3-羧酸乙酯结构中另一个-CH2的特征峰；以上结果表明熊果酸衍生物成功制备。
急性毒性实验：
按照一次大剂量给小白鼠灌胃熊果酸衍生物，连续观察小白鼠行为活动等指标和毒性反应程度，并在实验结束时处死小白鼠进行剖解，得到毒性资料。连续观察14d，并未发现小白鼠异常行为，并且也未出现死亡，实验设定的最高剂量2000mg/kg及其以下剂量，均对小白鼠无明显毒性。
PRMT5抑制剂及熊果酸衍生物两药联合给药与各自单独给药对皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中的体内药效作用研究：
1. 受试药物
药物名称：PRMT5抑制剂LLY-283，熊果酸衍生物。
2. 实验动物
裸鼠，5-6周龄，雌性，饲养环境：SPF级。
饲养环境：控制温度20~26℃；相对湿度：控制相对湿度40%~70%；光照：自动光照，每12h明暗交替。
3. 实验步骤
PDX模型小鼠取肿瘤分瘤块，用套管针皮下荷瘤于36只裸鼠左肋部皮下。待小鼠平均肿瘤体积达到100-150mm3时，随机分成4组，每组9只。分组后根据方案口服给予生理盐水（组1：0.5%羧甲基纤维素钠水/生理盐水）、LLY-283（组2： LLY-283单药组）、熊果酸衍生物（组3：熊果酸衍生物单药组）、LLY-283+熊果酸衍生物（组4：LLY-283+熊果酸衍生物联合组）；实验分组及给药方案如表2所示。每两天1次测量肿瘤体积，称体重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：
V＝0.52×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。
表2 实验分组及给药方案
Figure SMS_3
注：QDx12：3天给4天停，给药12次；QDx28：每天给药，给药28次；po：口服；i.p.：腹腔注射。
测试结果如图6所示。从图中分析可知，PRMT5抑制剂及熊果酸衍生物两药联合给药组，肿瘤体积明显低于各自单独给药的，表明熊果酸衍生物能够有效增加PRMT5抑制剂的疗效，两者联合使用在皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中的体内药效作用更佳。
4. 配伍计算方法
依据金氏公式计算q值，q=EA+B/(EA+EB-EA×EB)，用于判断两药物配伍使用后的效果是否优于单独给药。若q<0.55，两药作用为显著拮抗；0.55≤q<0.85，两药作用为拮抗；0.85≤q<1.15，两药作用为单纯相加；1.15≤q<20，两药作用为协同增强；q≥20，两药作用为显著增强。
从图6中的数据分析可知，给药28d后，与对照组相比，组2、组3、组4肿瘤体积减少率分别为50.87%、36.18%、81.80%，依据金氏公式，q=81.80%/(50.87%+36.18%-50.87%×36.18%)=1.19，符合1.15≤q<20，表明PRMT5抑制剂及PARP抑制剂两药的配伍对肿瘤的抑制效果为协同增强作用。
实施例5：
包覆药剂的纳米载体的制备方法，步骤为：
按照摩尔比为1:13:20:20的比例取葡聚糖、Fmoc-NH-PHis-COOH、EDC以及DMAP溶于DMSO中（其中葡聚糖浓度为5mg/mL），室温下搅拌反应24h，然后向反应体系中加入大叶菜酸（与葡聚糖的摩尔比为7:1），搅拌反应24h；反应液在去离子水中透析2d，冷冻干燥，溶于DMSO中，加入二乙胺（与Fmoc-NH-PHis-COOH的质量比为6.2:1），室温反应2.5h，冰浴下在乙醚中放置沉淀，旋蒸得到胶束复合物；
杂化膜包覆处理，取胶束复合物，及LLY-283（胶束复合物与LLY-283的质量比为1:0.11）溶于DMSO中（其中胶束复合物与DMSO的固液比为4.2mg/mL），室温下搅拌30min，然后采用去离子水透析1d，过0.22μm微孔膜；之后与红细胞膜、小鼠4T1肿瘤细胞膜以0.52:1:1的质量比共混，并置于37℃条件下进行超声处理12min，经0.2μm微孔膜，制备得到包覆药剂（LLY-283）的纳米载体。
包覆olaparib药剂的纳米载体的制备方法同上。
采用1H-NMR对胶束复合物进行结构表征，结果如图7所示。从图中分析可知，6.83ppm为大叶菜酸结构中-C=CH-基团的特征峰，5.96ppm和5.85ppm分别为聚组氨酸中咪唑环所携带的-N=CH-C-和-CH=NH-C-两个基团的特征峰，以上结果表明本实施例中胶束复合物成功制备。
采用透射电子显微镜对包覆药剂（LLY-283）的纳米载体形态进行表征，结果如图8所示。从图中分析可知，本发明制备的包覆药剂的纳米载体表现出明显的核壳结构，其核为胶束复合物，壳为红细胞-肿瘤细胞杂化膜，进一步说明杂化膜成功包覆胶束复合物，得到球形胶束粒子。
实施例6：
包覆药剂的纳米载体的制备方法与实施例5的区别在于：采用等摩尔量Fmoc-NH-PHis-COOH替代大叶菜酸。
实施例7：
包覆药剂的纳米载体对皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中的体内药效作用研究：
1. 受试药物
药物名称：PRMT5抑制剂LLY-283，PARP抑制剂olaparib。
2. 实验动物
裸鼠，5-6周龄，雌性，饲养环境：SPF级。
饲养环境：控制温度20~26℃；相对湿度：控制相对湿度40%~70%；光照：自动光照，每12h明暗交替。
3. 实验步骤
PDX模型小鼠取肿瘤分瘤块，用套管针皮下荷瘤于36只裸鼠左肋部皮下。待小鼠平均肿瘤体积达到100-150mm3时，随机分成4组，每组9只。分组后根据方案口服给予生理盐水（组1：0.5%羧甲基纤维素钠水/生理盐水）、LLY-283（组2：LLY-283单药组）、实施例5制备的包覆药剂的纳米载体（组3）、实施例6制备的包覆药剂的纳米载体（组4）；实验分组及给药方案如表3所示。每两天1次测量肿瘤体积，称体重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：
V＝0.52×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。
表3 实验分组及给药方案
Figure SMS_4
注：QDx12：3天给4天停，给药12次；QDx28：每天给药，给药28次；po：口服；i.p.：腹腔注射。
测试结果如图9所示。从图中分析可知，实施例5和实施例6制备的包覆药剂的纳米载体联合给药组，肿瘤体积明显低于PRMT5抑制剂及PARP抑制剂两药联合给药组，表明采用载体负载药剂后再联合给药，够有效增强药剂的疗效；且实施例5的效果好于实施例6的，表明采用大叶菜酸与其它组分复配使用，制备胶束复合物，杂化膜包覆后得到包覆药剂的纳米载体，能够进一步增强药剂在皮下荷瘤的三阴性乳腺癌PDX模型中的体内药效，增加对肿瘤细胞增殖的抑制效果。
试验例1：
包封率测定
取包覆药剂的纳米载体置于超滤离心管中，离心后滤液置于10mL容量瓶中，加入DMSO超声定容至刻度；另取包覆药剂的纳米载体置于5mL容量瓶中，加入DMSO超声定容至刻度，超声破乳后静置，取上清液，采用高效液相色谱测定LLY-283和olaparib含量。最后，包封率按照下列式子计算：
包封率/%=包覆进入的药剂质量/制备时加入药剂总量×100%
对实施例5-6制备的包覆药剂的纳米载体进行上述测试，结果如表4所示：
表4 包封率测试结果
Figure SMS_5
从表4中分析可知，实施例5制备的包覆药剂的纳米载体的包封率明显高于实施例6制备的，表明采用大叶菜酸与其它组分复配使用，制备胶束复合物，杂化膜包覆后得到包覆药剂的纳米载体，能够有效改善包覆药剂的纳米载体的包封率，具有更优的载药能力。
细胞毒性测试
采用MTT法考察不同浓度空白包覆药剂的纳米载体对4T1细胞株存活率的影响，然后通过测定光密度值计算存活细胞的比例，用酶标仪测定OD值，之后按照下列式子计算细胞存活率：
细胞存活率/%=OD实验组/OD对照组×100%
式中，OD实验组代表实验组细胞OD值，OD对照组代表对照组细胞OD值。
对实施例5制备的空白包覆药剂的纳米载体进行上述测试，结果如图10所示。从图中分析可知，空白载体浓度从低浓度到高浓度，在孵育48h后4T1细胞株的存活率均＞90%，表明本发明制备的载体安全性良好。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.熊果酸衍生物、PARP抑制剂联合PRMT5抑制剂在制备预防或治疗实体肿瘤的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PARP抑制剂选自Olaparib、Veliparib、Talazoparib、Niraparib、Rucaparib中的一种。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PRMT5抑制剂选自GSK3326595、AMG-193、MRTX1719、TNG-908、PF-069399999、PRT543、PRT811、SH-3765、Onametostat、SCR-6920、SKL27969、SYHX2001、AGX323、BRD0639、C220、DS-437、DW14800、GSK3203591、GSK3235025、JBI-778、LLY-283、MRTX9768、MS4322、MS4369、MS4370、PF-06855800中的一种。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述实体肿瘤包括良性实体瘤和恶性实体瘤。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述良性实体瘤包括错构瘤、平滑肌瘤、血管瘤、淋巴管瘤、腺瘤和腺瘤性息肉；恶性实体瘤包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、头颈部恶性肿瘤、泌尿系统恶性肿瘤、子宫内膜癌、子宫颈癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、甲状腺癌、肝母细胞瘤和肾母细胞瘤。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PRMT5抑制剂的剂量范围选自体内10~100mg。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PAPR抑制剂的剂量范围选自体内10~100mg。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述熊果酸衍生物的剂量范围选自体内10~100mg。
9.PARP抑制剂联合PRMT5抑制剂在制备预防或治疗三阴性乳腺癌的药物中的用途。
10.药物混合物，包含PRMT5抑制剂，还包含有PARP抑制剂和/或熊果酸衍生物，以及一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体；所述载体包括纳米载体。
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