CN103509833B - 一种利用赤红球菌制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用赤红球菌制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法，步骤为：（1）种子与发酵培养；（2）赤红球菌悬浮液的制备；（3）2,6-二氟苯甲腈的转化；（4）制备产物成品。本发明提供了一种利用赤红球菌水解2,6-二氟苯甲腈生成2,6-二氟苯甲酰胺的方法，本发明中微生物转化方法具有很高的催化效率，提高了底物转化率，在3.5mol/L的投料浓度下，2,6-二氟苯甲腈的转化率高达100%，2,6-二氟苯甲酰胺的选择性为100%，无副产物2,6-二氟苯甲酸的产生。简化了目标产物的分离纯化工艺，反应条件温和，对设备要求不高，易于生产。

Description

一种利用赤红球菌制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种利用赤红球菌制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法。

背景技术

2,6-二氟苯甲酰胺外观为白色针状结晶性粉末，是合成苯甲酰脲类杀虫剂的关键中间体，这类杀虫剂通过改变保幼激素、蜕皮激素或抑制几丁质的合成，来阻断昆虫的成长、发育和繁殖，其杀虫机理独特、高效、广谱、低毒、对人畜安全、与其他杀虫剂没有交互抗药性，是对环境友好的杀虫剂新品种。近十几年来，国际上苯甲酰脲类农药得到迅速发展，开发出除虫脲、氟铃脲、伏虫隆、定虫隆、氟虫脲、杀虫隆、啶蜱脲、氟酰脲等产品，而2,6-二氟苯甲酰胺是合成这些产品的关键中间体，同时2,6-二氟苯甲酰胺还是加工生产其它农药、医药、液晶材料的重要化工中间体。

目前工业上主要采用化学方法合成2,6-二氟苯甲酰胺，包括2,6-二氟苯甲腈的酸催化水解、强碱水解以及二氟苯甲酸及其衍生物的氨解，这几种工艺水解后的产物都需要中和，消耗大量的酸碱，产生大量的废盐，环境污染严重。中国专利ZL200610050626.9公开了一种近临界水介质中2,6-二氟苯腈无催化水解制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法，该方法在高压反应釜中加入去离子水和2,6-二氟苯腈，升温至200-350℃水解1-10h得到产品2,6-二氟苯甲酰胺。该方法虽然解决了酸碱催化对环境造成的污染，但是高温高压对设备的要求较高，需要耗费大量能源。某公司申请的专利CN101462980A公开了一种2,6-二氟苯甲酰胺的工业化生产方法，以2,6-二氟苯甲腈和过氧化氢为原料，氢氧化钠为催化剂，收率较高，但是水解完成后需要水洗至pH为7-8，产生大量废水。

国际壳牌公司申请的中国专利ZL87104545.1提供了一种利用红球菌CCTCC.87060或其突变体，在光照条件下水解2,6-二氟苄腈得到2,6-二氟苯甲酰胺的方法，该方法环保无污染，但是由于需要连续光照限制了该方法的工业应用。JacquesMauger等人1989年发表于期刊Tetrahedron上的文章“SynthesisofvariousaromaticamidederivativesusingnitrilehydrataseofRhodococcusrhodochrousJ1”报道了R.rhodochrousJ1催化苯甲腈、2,6-二氟苯甲腈、3-吲哚乙腈等生成相应酰胺的研究，对R.rhodochrousJ1菌体的培养，培养基用蒸馏水配制，加入0.01g/L的CoCl_2.6H₂O和2g/L的巴豆酰胺作为诱导剂，在发酵30h和60h是再补加2g/L的巴豆酰胺，80h后结束发酵收集菌体制备静息细胞；对于2,6-二氟苯甲腈的转化，底物分5次分批加入使最终浓度达到2.5mol/L，由于氟原子空间位阻的作用仅收集到306g/L的2,6-二氟苯甲酰胺。OttoMeth-Cohn等人1995年发表于期刊TetrahedronLetters上的文章“Apowerfulnewnitrilehydratasefororganicsynthesisaromaticandheteroaromaticnitrilehydrolyses-arationalisation”介绍了RhodococcusrhodocrousAJ270对邻间对位取代苯甲腈及芳香腈杂环腈的转化，对于2,6-二氟苯甲腈的转化，酰胺转化率达到80%，有副产物羧酸的生成，增加产物纯化的难度，不利于工业化生产。

综上所述，目前2,6-二氟苯甲酰胺的生产存在以下不足：1、部分生产工艺反应条件苛刻，对生产设备及生产条件要求较高，增加生产成本；2、部分方法转化率以及选择性较低，分离纯化步骤复杂，不适合工业生产。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用赤红球菌制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法，利用赤红球菌催化2,6-二氟苯甲腈水解生成2,6-二氟苯甲酰胺，本方法具有反应条件温和、目标产物产率高、分离纯化过程简单的优点。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种利用赤红球菌制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法，方法如下

⑴转化：在pH6-9的KH₂PO₄-NaOH缓冲液体系中，投入底物2,6-二氟苯甲腈，赤红球菌（Rhodococcusruber）CGMCC3090细胞浓度0.66-3.30g/L，转化条件为转速110-220r/min，转化温度为20-40℃，转化时间3-28h；

⑵制备产物成品：将转化结束后的料液过滤，得到产物晶体，水洗产物晶体再经重结晶即可得到产物纯品。

而且，在步骤⑴还加入终浓度为0.5wt%-10wt%的促溶剂。

而且，所述促溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙二醇、二甲基亚砜、丙酮或吐温80。

而且，所述2,6-二氟苯甲腈的投入浓度为：0.5-3.5mol/L。

而且，所述萃取处理的萃取溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸丁酯。

而且，所述重结晶溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷或正己烷。

而且，所述赤红球菌（Rhodococcusruber）CGMCC3090的发酵方法为：

⑴种子与发酵培养：取赤红球菌Rhodococcusruber（CGMCC3090）菌种接种于一级种子培养基中，140-220r/min、26-32℃、培养24-32h，得到种子培养液，以2%-5%的接种量转接于新鲜的发酵培养基，培养42-54h，得到菌体发酵液；

⑵赤红球菌悬浮液的制备：将上述发酵液离心，去上清，所得湿菌体细胞用pH6-9的KH2PO4-NaOH缓冲液洗涤2-3次并悬浮于等体积的缓冲液中，得到赤红球菌细胞悬浮液。

而且，步骤⑵过滤得滤液，滤液经过萃取获得产物晶体，然后重结晶即得2,6-二氟苯甲酰胺纯品。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明提供了一种利用赤红球菌所产腈水合酶选择性水解2,6-二氟苯甲腈生成2,6-二氟苯甲酰胺的方法，该方法催化效率高，2,6-二氟苯甲腈的转化率为100%，对2,6-二氟苯甲酰胺的选择性为100%，无副产物2,6-二氟苯甲酸的产生，简化了目标产物的分离纯化工艺，避免大量有机溶剂的使用，既符合环保要求，又降低生产成本。

2、本发明所采用的赤红球菌具有很高的底物耐受性，投料浓度可达3.5mol/L，细胞生长和催化2,6-二氟苯甲腈水解的过程可以单独优化，有效提高产物2,6-二氟苯甲酰胺的浓度。

3、本发明提供的生产方法与其他菌体的生物转化方法相比，具有反应速度快，反应条件温和，不需要光照，转化装置简单等优点，更加适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明产物2，6二氟苯甲酰胺电喷雾质谱图（ESI-MS）。

图2为本发明产物2，6二氟苯甲酰胺核磁共振氢谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明所用的赤红球菌Rhodococcusruber（CGMCC3090）已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为：2009年6月4日，保藏号为：CGMCCNo.3090。由公开号为CN101619299的专利文献于2010年01月06日公开。

实施例1：

一种利用赤红球菌制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法，制备的步骤是：

⑴种子与发酵培养：取赤红球菌Rhodococcusruber（CGMCC3090）菌种接种于种子培养基中，180r/min、30℃、培养28h，得到种子培养液，以3wt%的接种量转接于新鲜的发酵培养基，180r/min、28℃、培养48h，得到菌体发酵液：

种子培养基：甘油10g/L，蛋白胨5g/L，麦芽粉3g/L，酵母粉3g/L，NaCl1g/L，pH7.0；

发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、K₂HPO₄0.5g/L、尿素7g/L、NaCl2g/L、CoCl₂0.02g/L、谷氨酸钠1g/L，pH7.0。其中尿素和诱导剂CoCl2单独灭菌3-5min。

⑵赤红球菌悬浮液的制备：将上述菌体发酵液离心，去上清，所得湿菌体细胞用pH7.5的KH₂PO₄-NaOH缓冲液洗涤3次并悬浮于等体积的缓冲液中，得到赤红球菌悬浮液；

⑶2,6-二氟苯甲腈的转化：底物2,6-二氟苯甲腈浓度为1mol/L，反应体积为10ml，赤红球菌细胞终浓度为1.19g/L，转化体系为50mmol/LpH7.5KH₂PO₄-NaOH缓冲液，30℃、180r/min，18h后转化完成；

⑷制备产物成品：将转化结束后的料液过滤，所得滤饼水洗、60℃烘干，得到产物晶体，水洗产物晶体即可得到产物粗品。同时过滤得到的滤液经萃取处理获得产物粗品，然后两部分产物合并后经二氯甲烷和正己烷重结晶，得到产物纯品，总收率达96%。

产物2,6-二氟苯甲酰胺的鉴定：

⑴裂解电压为4.5kV，全扫描模式（扫描质核比范围为0～300m/z），产物的电喷雾质谱图（ESI-MS）如图1所示：产物裂解成质核比为158.0的分子离子[M+H]⁺，可判断产物的相对分子质量为157.0，底物2，6二氟苯甲腈的相对分子质量为139.11，产物比底物的相对分子质量增加了18，符合水合反应的特征。

⑵产物的核磁共振氢谱（¹H-NMR，300Hz，CDCl₃为溶剂）见图2：化学位移δ从8.0～1.0ppm区域共显示出四组质子峰，各峰分别与其分子中各质子相互对应，即：δ_H ¹H-NMR（400MHz,CDCl₃）δH7.40（1H，m，H-5），6.97（2H，t，J=8Hz，H-4，H-6），6.25（1H，s，NH），6.05（1H，s，NH）。由此可知，产物分子中共计五个氢，化学位移为6.25ppm和6.05ppm的质子峰对应为酰胺基团中的氢。

实施例2：

本实施例中步骤⑴、⑵和⑷均与实施例1相同，以下只叙述步骤⑶。

⑶2,6-二氟苯甲腈的转化：底物2,6-二氟苯甲腈浓度为1mol/L，反应体积为10ml，赤红球菌细胞终浓度为2.37g/L，加入终浓度为为1%的甲醇，转化体系为50mmol/LpH7.5KH₂PO₄-NaOH缓冲液，30℃、180r/min，转化转化3h后制备2,6-二氟苯甲酰胺纯品。

经检测本步骤中2,6-二氟苯甲腈的转化率达到100%，对2,6-二氟苯甲酰胺的选择性为100%。

实施例3：

本实施例中步骤⑴、⑵和⑷均与实施例1相同，以下只叙述步骤⑶。

⑶2,6-二氟苯甲腈的转化：底物2,6-二氟苯甲腈浓度为2.5mol/L，反应体积为10ml，赤红球菌细胞终浓度为2.37g/L，加入1%的吐温80，转化体系为50mmol/LpH7.5KH₂PO₄-NaOH缓冲液，30℃、180r/min，转化24h后制备2,6-二氟苯甲酰胺纯品。

经检测本步骤中2,6-二氟苯甲腈的转化率达到100%，对2,6-二氟苯甲酰胺的选择性为100%。

实施例4：

本实施例中步骤⑴和⑵均与实施例1相同，以下只叙述步骤⑶和⑷。

⑶2,6-二氟苯甲腈的转化：底物2,6-二氟苯甲腈浓度为1.5mol/L，反应体积为10mL，赤红球菌细胞终浓度为2.37g/L，加入1%的乙醇，转化体系为50mmol/LpH7.5KH₂PO₄-NaOH缓冲液，30℃、180r/min，5h后转化完成；

⑷制备产物成品：转化反应结束后，料液经过滤，所得滤饼水洗、60℃烘干得到2,6-二氟苯甲酰胺粗品，同时所得滤液用三氯甲烷萃取，真空浓缩得到2,6-二氟苯甲酰胺粗品，两部分产物合并后经丙酮和正己烷重结晶，得到产物晶体，总收率达96.8%。

经检测本步骤中2,6-二氟苯甲腈的转化率达到100%，对2,6-二氟苯甲酰胺的选择性为100%。

实施例5：

本实施例中步骤⑴和⑵均与实施例1相同，以下只叙述步骤⑶和⑷。

⑶2,6-二氟苯甲腈的转化：底物2,6-二氟苯甲腈浓度为2mol/L，反应体积为10mL，赤红球菌细胞终浓度为2.37g/L，加入2%的异丙醇，转化体系为50mmol/LpH7.5KH₂PO₄-NaOH缓冲液，30℃、180r/min，转化13h后完成；

⑷制备产物成品：转化反应结束后，料液经过滤，所得滤饼水洗、60℃烘干得到2,6-二氟苯甲酰胺粗品，同时所得滤液用乙酸丁酯萃取，真空浓缩得到2,6-二氟苯甲酰胺粗品，两部分产物合并后经甲醇和正己烷重结晶，得到产物晶体，总收率达97.2%。

经检测本步骤中2,6-二氟苯甲腈的转化率达到100%，对2,6-二氟苯甲酰胺的选择性为100%。

实施例6

本实施例中步骤⑴和⑵均与实施例1相同，以下只叙述步骤⑶和⑷。

⑶2,6-二氟苯甲腈的转化：底物2,6-二氟苯甲腈浓度为3.5mol/L，反应体积为10ml，赤红球菌细胞终浓度为2.37g/L，加入1%的吐温80，转化体系为50mmol/LpH7.5KH₂PO₄-NaOH缓冲液，30℃、180r/min，转化24h后完成；

⑷制备产物成品：转化反应结束后，料液经过滤，所得滤饼水洗、60℃烘干得到2,6-二氟苯甲酰胺粗品，同时所得滤液用二氯甲烷萃取，真空浓缩得到2,6-二氟苯甲酰胺粗品，两部分产物合并后经乙醇和正己烷重结晶，得到产物晶体，总收率达96.4%。

经检测本步骤中2,6-二氟苯甲腈的转化率达到97.4%，对2,6-二氟苯甲酰胺的选择性为100%。

实施例7：

本实施例中步骤⑴和⑵均与实施例1相同，以下只叙述步骤⑶和⑷。

⑶2,6-二氟苯甲腈的转化：底物2,6-二氟苯甲腈浓度为0.5mol/L，反应体积为10ml，赤红球菌细胞终浓度为0.66g/L，加入2%的异丙醇，转化体系为50mmol/LpH7.5KH₂PO₄-NaOH缓冲液，30℃、180r/min，转化3h后完成；

⑷制备产物成品：转化反应结束后，料液经过滤，所得滤饼水洗、60℃烘干得到2,6-二氟苯甲酰胺粗品，同时所得滤液用三氯甲烷萃取，真空浓缩得到2,6-二氟苯甲酰胺粗品，两部分产物合并后经三氯甲烷和正己烷重结晶，得到产物晶体，总收率达96.4%。

经检测本步骤中2,6-二氟苯甲腈的转化率达到100%，对2,6-二氟苯甲酰胺的选择性为100%。

Claims (2)

1.一种利用赤红球菌制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法，其特征在于：方法如下

⑴转化：在pH6-9的KH₂PO₄-NaOH缓冲液体系中，投入底物2,6-二氟苯甲腈，赤红球菌(Rhodococcusruber)CGMCC3090细胞浓度0.66-3.30g/L，转化条件为转速110-220r/min，转化温度为20-40℃，转化时间3-28h；

⑵制备产物成品：将转化结束后的料液过滤，得到产物晶体，水洗产物晶体再经重结晶即可得到产物纯品；步骤⑵过滤得滤液，滤液经过萃取获得产物晶体，然后重结晶即得2,6-二氟苯甲酰胺纯品；

在步骤⑴还加入终浓度为0.5wt％-10wt％的促溶剂，

所述促溶剂为吐温80，所述2,6-二氟苯甲腈的投入浓度为：0.5-3.5mol/L；

所述萃取处理的萃取溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸丁酯；

所述重结晶溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷或正己烷。

2.根据权利要求1所述的利用赤红球菌制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法，其特征在于：所述赤红球菌CGMCC3090的发酵方法为：

⑴种子与发酵培养：取赤红球菌CGMCC3090菌种接种于一级种子培养基中，140-220r/min、26-32℃、培养24-32h，得到种子培养液，以2％-5％的接种量转接于新鲜的发酵培养基，培养42-54h，得到菌体发酵液；

⑵赤红球菌悬浮液的制备：将上述发酵液离心，去上清，所得湿菌体细胞用pH6-9的KH2PO4-NaOH缓冲液洗涤2-3次并悬浮于等体积的缓冲液中，得到赤红球菌细胞悬浮液。