CN101575630A

CN101575630A - 生物转化法生产脱氧腺苷的方法

Info

Publication number: CN101575630A
Application number: CNA2009100858609A
Authority: CN
Inventors: 王大然; 乔瑞颖; 王雅婷
Original assignee: BEIJING BOERLAI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shandong Jianwei Bioengineering Co., Ltd.
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2009-06-03
Publication date: 2009-11-11

Abstract

本发明公开了一种生物转化法生产脱氧腺苷的方法。该方法是将瑞士乳杆菌种子液接入发酵培养基中发酵培养，得到粗菌体，将所述粗菌体破碎，制成细胞破碎液，向所述细胞破碎液中加入脱氧胸苷和腺嘌呤进行酶促反应，获得脱氧腺苷；所述发酵培养基由下列重量份的物质组成：葡萄糖10－20、蛋白胨1－5、麸质粉10－25、柠檬酸胺1－2、磷酸氢二钾1－2、硫酸钠5－10、硫酸锰0.02－0.4和水1000；所述腺嘌呤的粒度小于等于10μm。本发明是生物转化法生产脱氧腺苷，充分利用酶的高效性、专一性和温和性，与传统化学合成方法相比，具有选择性高、条件温和、工艺简单、成本低和污染小等特点。

Description

生物转化法生产脱氧腺苷的方法

技术领域

本发明涉及生物转化法生产脱氧腺苷的方法。

背景技术

蒋忠良等报道了2’-脱氧腺苷全合成研究(同济大学学报：自然科学版，2007，35(9)：1264-1268)，路有昌等报道了2’-脱氧腺苷的合成(应用化工，2006，35(7)：564-565)，王晓萌等报道了2’-脱氧腺苷相关中间体的合成路线研究(学位论文)，河南师范大学和新乡拓新生化科技有限公司等申请了化学合成法生产2′-脱氧腺苷的工艺专利(中国专利200710053920.X)。以上文献都是采用化学法制备脱氧腺苷。如将6-氯腺嘌呤与1-乙酰基-3，5-二(对甲基苯甲酰基)-2-脱氧核糖和含有磷酸酚酯类化合物催化剂的有机溶剂放入反应釜中，在催化剂催化作用下缩合反应制备3’5’-二(对甲基苯甲酰基)-2’-脱氧-6-氯嘌呤核苷；再将化合物和氨甲醇放入反应釜中氨解得到2’-脱氧腺苷。由于化学法生产脱氧腺苷条件苛刻，大量使用有机溶剂，环境污染较严重，且生产成本高，工艺复杂。

目前，国内外对于生物转化法生产脱氧腺苷的文献报道较少。洪云海等报道了应用乙酰短杆菌酶法合成2’-脱氧腺苷的方法(工业微生物，2006，36(1)：30-33)，他们以乙酰短杆菌为转化菌，底物浓度为40mmol/L(10g/L)，转化率约66％。该方法中的底物腺嘌呤水溶性很低，使得底物与生物酶的有效接触十分困难，严重影响转化反应的速率和产率；起催化作用的脱氧核糖转移酶等为胞内酶，微生物细胞膜的脂质双层结构使底物进出微生物细胞很困难，反应速度和转化率较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物转化法生产脱氧腺苷的方法。

本发明所提供的生产脱氧腺苷的方法，是将瑞士乳杆菌种子液接入发酵培养基中发酵培养，得到粗菌体，将所述粗菌体破碎，制成细胞破碎液，向所述细胞破碎液中加入脱氧胸苷和腺嘌呤进行酶促反应，获得脱氧腺苷；所述腺嘌呤的粒度小于等于10μm。

其中，所述发酵培养基由下列重量份的物质组成：葡萄糖10-20、蛋白胨1-5、麸质粉10-25、柠檬酸胺1-2、磷酸氢二钾1-2、硫酸钠5-10、硫酸锰0.02-0.4和水1000；所述酶促反应的温度为35-50℃，优选为40-50℃。

所述发酵培养基优选由下列重量份的物质组成：葡萄糖15-20、蛋白胨4-5、麸质粉20-25、柠檬酸胺2、磷酸氢二钾2、硫酸钠9、硫酸锰0.02和水1000。

所述发酵培养的温度为30-42℃，优选为37-40℃；搅拌转速为120-160转/分钟，优选140-160转/分钟；pH值为6.0-7.5，优选6.0-6.5；发酵时间为24-36小时。

所述瑞士乳杆菌种子液与所述发酵培养基的体积比为10％-15％。

所述瑞士乳杆菌种子液是按照如下方法获得：将瑞士乳杆菌接种到斜面培养基培养制成斜面菌种，将所述斜面菌种接入发酵培养基中培养获得种子液；所述斜面培养基由下列重量份的物质组成：葡萄糖10-20、蛋白胨10-20、酵母膏3-8、柠檬酸胺1-2、磷酸氢二钾1-2、硫酸钠5-10、硫酸锰0.02-0.4，琼脂15-20和水1000。

所述斜面培养基优选由下列重量份的物质组成：葡萄糖15-18、蛋白胨18、酵母膏6-8、柠檬酸胺2、磷酸氢二钾2、硫酸钠8-9、硫酸锰0.02，琼脂20和水1000。

所述瑞士乳杆菌接种到斜面培养基培养的温度为30-42℃，优选37-40℃；pH为6.5-8.0，培养24-48小时。

所述细胞破碎液按照如下方法制备：将所述粗菌体用柠檬酸缓冲液洗涤，然后用pH6.0-7.0磷酸缓冲液悬浮，获得细胞悬浮液，超声破碎所述细胞悬浮液，获得细胞破碎液。

所述柠檬酸缓冲液的pH6.0-7.0，优选为pH6.5-7.0。所述磷酸缓冲液的pH值优选为6.0。所述细胞悬浮液中菌体的质量百分含量为15％-35％，优选为15％。

所述超声条件为功率为300-400瓦，频率为3-5次/10秒，时间为5-15分钟。

本发明是生物转化法生产脱氧腺苷，充分利用酶的高效性、专一性和温和性，与传统化学合成方法相比，具有选择性高、条件温和、工艺简单、成本低和污染小等特点。

本发明的生物转化法生产脱氧腺苷，所用菌株为瑞士乳杆菌，瑞士乳杆菌转化产物简单，95％以上为脱氧腺苷，副产物极小；并采用气流粉碎技术，将难溶于水的腺嘌呤粉碎成粒度小于10μm粒子，产品转化率达到82％。通过大孔吸附树脂分离纯化，纯度可达到98％以上；同时通过细胞破碎技术，消除了瑞士乳杆菌壁膜的阻碍作用，既提高转化速率，又可以增加底物浓度。本发明的生物转化法生产脱氧腺苷，产量可达42g/L，脱氧胸苷转化率可达82％。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1、生物转化法生产脱氧腺苷

(1)菌种斜面培养

将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CGMCC 1.1877(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)接种到斜面培养基，37℃、pH值6.5，培养24小时制成斜面菌种；斜面培养基由下列重量份的组分组成：

葡萄糖18份、蛋白胨18份、酵母膏8份、柠檬酸胺2份、磷酸氢二钾2份、硫酸钠9份、硫酸锰0.02份，琼脂20份和水1000份。

(2)接种发酵

将斜面菌株接入发酵培养基中扩大培养作为种子液；将种子液按10％(体积百分比)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中37℃，160转/分钟，pH值为6.0，发酵36小时；发酵培养基由下列重量份的组分组成：

葡萄糖20份、蛋白胨4份、麸质粉25份、柠檬酸胺2份、磷酸氢二钾2份、硫酸钠9份、硫酸锰0.02份和水1000份。

(3)生产脱氧腺苷

a)发酵液在4℃、8000转/分钟、离心20分钟，收集湿菌体；

b)柠檬酸缓冲液(PH6.5)洗涤步骤a)菌体，4℃离心10分钟，收集湿菌体，称重，用磷酸缓冲液(PH6.0)重悬菌体，制成15％(湿菌体重量和缓冲液的体积比)的细胞悬浮液；

c)步骤b)的细胞悬浮液置于冰浴中，超声波破碎10分钟，超声波功率为400瓦，频率为3次/10秒；

d)向步骤c)的破碎液中加入底物混合后40℃反应24小时，底物含有50g/L脱氧胸苷和30g/L腺嘌呤，腺嘌呤为通过气流粉碎后的粉末，粒度小于10μm；

HPLC检测(色谱柱：Diamonsil C₁₈，5um，250x 4.6mm；流动相：甲醇∶0.01mol磷酸缓冲盐＝30∶70；流速：0.9ml/min；检测波长：254nm)脱氧胸苷转化为脱氧腺苷的转化率达82％，每升发酵液中含有脱氧腺苷42g/L。

(4)脱氧腺苷的分离纯化

发酵液用1N NaOH调节pH到中性，高速离心机离心20分钟得上清液，上清液过AB-8大孔吸附树脂，用去离子水洗柱到流出液为近无色，然后用20％乙醇洗3个柱体积，30％乙醇洗2个柱体积，最后用50％乙醇从树脂上解吸出含脱氧腺苷解吸液，HPLC检测，收集脱氧腺苷含量在50％以上的解吸液，然后浓缩得脱氧腺苷，收率为92％，纯度为98.2％。

实施例2、生物转化法生产脱氧腺苷

(1)将瑞士乳杆菌CGMCC 1.1877接种到斜面培养基，40℃，pH6.5，培养24小时制成斜面菌种；斜面培养基由下列重量份的组分组成：

葡萄糖15份、蛋白胨18份、酵母膏6份、柠檬酸胺2份、磷酸氢二钾2份、硫酸钠8份、硫酸锰0.02份，琼脂20份和水1000份。

(2)接种发酵

将斜面菌株接入发酵培养基中扩大培养作为种子液；将种子液按20％(体积百分比)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中37℃，140转/分钟，pH值为6.5，发酵36小时；发酵培养基由下列重量份的组分组成：

葡萄糖15份、蛋白胨5份、麸质粉20、柠檬酸胺2份、磷酸氢二钾2份、硫酸钠9份、硫酸锰0.02份水1000份。

(3)生产脱氧腺苷

e)发酵液在4℃、10000转/分钟、离心10分钟，收集湿菌体；

f)柠檬酸缓冲液(PH6.0)洗涤步骤a)菌体，4℃离心10分钟，收集湿菌体，称重，用磷酸缓冲液(PH6.0)重悬菌体，制成15％(湿菌体重量和缓冲液的体积比)的细胞悬浮液；

g)步骤b)的细胞悬浮液置于冰浴中，超声波破碎10分钟，超声波功率为340瓦，频率为4次/10秒；

h)向步骤c)的破碎液中加入底物混合后50℃反应24小时，底物含有50g/L脱氧胸苷和30g/L腺嘌呤，腺嘌呤为通过气流粉碎后的粉末，粒度小于10μm；

HPLC检测(色谱柱：Diamonsil C₁₈，5um，250x 4.6mm；流动相：甲醇∶0.01mol磷酸缓冲盐＝30∶70；流速：0.9ml/min；检测波长：254nm)脱氧胸苷转化为脱氧腺苷的转化率达80％，每升发酵液中含有脱氧腺苷41g/L。

(4)脱氧腺苷的分离纯化

发酵液用1N NaOH调节pH到中性，高速离心机离心20分钟得上清液，上清液过D-101大孔吸附树脂，用去离子水洗柱到流出液为近无色，然后用20％乙醇洗3个柱体积，用55％乙醇从树脂上解吸出含脱氧腺苷解吸液，HPLC检测，收集脱氧腺苷含量在50％以上的解吸液，然后浓缩得脱氧腺苷，收率为90％，纯度为98.7％。

Claims

1、一种生产脱氧腺苷的方法，是将瑞士乳杆菌种子液接入发酵培养基中发酵培养，得到粗菌体，将所述粗菌体破碎，制成细胞破碎液，向所述细胞破碎液中加入脱氧胸苷和腺嘌呤进行酶促反应，获得脱氧腺苷；所述腺嘌呤的粒度小于等于10μm。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基由下列重量份的物质组成：葡萄糖10-20、蛋白胨1-5、麸质粉10-25、柠檬酸胺1-2、磷酸氢二钾1-2、硫酸钠5-10、硫酸锰0.02-0.4和水1000；所述发酵培养的温度为30-42℃，搅拌转速为120-160转/分钟，pH值为6.0-7.5，发酵时间为24-36小时。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述瑞士乳杆菌种子液与所述发酵培养基的体积比为10％-15％。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述瑞士乳杆菌种子液是按照如下方法获得：将瑞士乳杆菌接种到斜面培养基培养制成斜面菌种，将所述斜面菌种接入发酵培养基中培养获得种子液；所述斜面培养基由下列重量份的物质组成：葡萄糖10-20、蛋白胨10-20、酵母膏3-8、柠檬酸胺1-2、磷酸氢二钾1-2、硫酸钠5-10、硫酸锰0.02-0.4，琼脂15-20和水1000。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述瑞士乳杆菌接种到斜面培养基培养的温度为30-42℃，pH为6.5-8.0，培养24-48小时。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述细胞破碎液按照如下方法制备：将所述粗菌体用柠檬酸缓冲液洗涤，然后用pH6.0-7.0磷酸缓冲液悬浮，获得细胞悬浮液，超声破碎所述细胞悬浮液，获得细胞破碎液。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述柠檬酸缓冲液的pH6.0-7.0；所述磷酸缓冲液的pH6.0。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述超声条件为功率为300-400瓦，频率为3-5次/10秒，时间为5-15分钟。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述细胞悬浮液中菌体的质量百分含量为15％-35％。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述酶促反应的温度为35-50℃。