CN103352062B - 一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的方法，属于食品添加剂领域。本发明向含有甘草酸(或其盐)的培养基中添加促进剂甘草总提物、或甘草总多糖和/或甘草总黄酮，促进Penicillium purpurogenum Li-3(保藏号:CGMCCNo.5446)诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，对比不加促进剂产酶提前5～48小时，酶活提高0.5～5倍。用产酶后菌体或含菌体发酵液制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂，转化甘草总提物或甘草总三萜中甘草酸及其类似物生成GAMG，分离纯化发酵液中GAMG。本发明不仅提高了酶活,而且避免以甘草酸(或其盐)为碳源甘草酸(或其盐)复杂提取分离过程，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法,属于食品添加剂（甜味剂）领域。
背景技术
甘草是豆科甘草属灌木状多年生草本植物，是重要的食品添加剂和传统中药。甘草酸（GL）属于五环三萜类化合物，在甘草中含量最高（3-11%），是甘草中的主要活性成分之一，但是过多摄入甘草酸会导致人体内钠排出减少而钾排出增加，产生一定的副作用。GL水解掉一个葡萄糖醛酸基后生成产物——单葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG），结构见图1。GAMG甜度是甘草酸的5倍，是蔗糖的近1000倍，是一种高甜度、低热量的新型甜味剂。动物实验表明GAMG的LD50为5000mg/kg，远远大于甘草酸的LD50805mg/kg，说明GAMG比GL更安全。GAMG极性介于GL和甘草次酸（GA）之间为中等极性，在体内同时具有良好的溶解度和跨膜转运的能力，比GL和GA具有更好的生物利用度。作为食品添加剂GAMG比GL具有更多的优点。因此生产和开发GAMG具有很重要的应用价值和现实意义。
由于甘草酸分子中的两个糖苷键的键能是相似的，化学水解法对这两个糖苷键的选择性很低，不能将甘草酸定向水解生成GAMG。利用生物转化生产GAMG，可以克服化学方法的低选择性、高耗能、高污染的缺点。生物转化是利用微生物、动植物的培养体系或其产生的酶制剂对外源化合物进行结构修饰的生物化学反应过程，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应，亦称酶促反应。该技术自20世纪50年代兴起，近10年迅速发展起来。酶催化的优点：高度的立体选择性、催化效率高和反应条件温和等，可以完成一些化学方法难以实现的反应。目前生物转化技术已广泛应用到食品、药品以及化工产品等领域中。
目前已发现的能够转化甘草酸为GAMG的β-葡萄糖醛酸苷酶存在于肠道细菌、动物组织和土壤中，但是来源于肠道细菌和动物组织的酶普遍存在化学键选择性偏低的缺点，不仅产生GAMG，还产生大量的副产物甘草次酸（GA），见图1。来源于动物组织的酶成本高，制备较麻烦。发明人所在的李春教授课题组从新疆主要甘草产区中的土样中分离筛选出来的菌株——产紫青霉Penicillium purpurogenumLi-3，其诱导产生的β-葡萄糖醛酸苷酶能将商品甘草酸单铵盐水解生成GAMG，定向性好，甘草酸转化率可达88.45%(冯世江、李春等,高校化学工程学报,2007,21：977-982)。利用该菌定向生物合成GAMG的方法已申请了国家专利（CN101603067），菌种PenicilliumpurpurogenumLi-3已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏号：CGMCC No5446，保藏日期2011年11月04日。
然而，甘草酸单铵盐是由甘草经多步分离纯化制得，原料价格限制了GAMG生产成本的降低。如果直接以甘草总提取物为碳源可以减少很多提取分离步骤，大大降低生产成本,而且,文献报道，甘草属植物中除甘草酸外，还有4种含GAMG骨架结构的化合物，只是糖连接的位置不同，见图2。若以甘草为原料通过适当的生物转化过程，可能使这4种化合物也转化生成GAMG，从而提高GAMG产量。但是,尽管甘草酸在甘草中含量最高,以甘草总提取物或甘草三萜粗品为碳源直接利用菌体进行生物转化生产GAMG却不能实现。
本发明专利的方法不仅能够使以甘草总提物或甘草三萜粗品为碳源生物转化生成GAMG得以实现，而且在制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂过程中，以甘草酸单铵盐为碳源并添加促进剂，比以甘草酸单氨盐为碳源不添加促进剂产生的β-葡萄糖醛酸苷酶酶活提高，GAMG产率提高，时间提前（见实施例2）。产率提高一直是工业化生产追求的目标，时间提前可以节省很多能源，降低成本。该工艺研究可为未来工业化生产GAMG提供有力的技术支持。
发明内容
本发明提供一种以甘草酸或甘草酸盐为碳源，添加一定量的促进剂（甘草总提取物、或甘草总多糖、或甘草总黄酮），促进菌株Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，获得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂；以甘草总提取物或甘草总三萜为碳源，用该粗酶制剂生物转化甘草总提取物或甘草总三萜中的甘草酸及其类似物，生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法。本发明是通过以下技术方案实现的。
第一项.β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的制备，包括以下步骤：
步骤1、先将菌株Penicillium purpurogenum Li-3接入到斜面培养基上，经培养后得斜面种子，其中Penicillium purpurogenum Li-3的保藏号为CGMCCNo.5446。
步骤2、将步骤1所得的斜面种子接入种子培养基中，经培养后得到种子液；
步骤3、将步骤2所得的种子液接入到含有甘草酸或甘草酸盐的产酶培养基中，其中产酶培养基中含有外源促进剂，促进Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，促进剂为从甘草中提出的甘草总提取物、甘草总黄酮和/或总甘草多糖；
经过发明人的多次试验研究发现，甘草总提物对于Penicillium purpurogenum Li-3产酶具有出乎意料的促进作用，不仅能够使产酶提前5～48小时，而且酶活提高0.5～5倍，甘草酸转化率提高10～200%，GAMG产率提高10～200%。经过发明人进一步研究发现，对酶活起很大促进作用的是甘草中的总黄酮和总多糖，尽管甘草酸在甘草总三萜中含量达到10-30%，但甘草总三萜对于Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活无明显促进作用。目前发明人对甘草总提物刺激产紫青霉Li-3的产酶机理尚不清楚，但可以肯定的是，一定是甘草总提物中的除甘草酸及其无机盐之外的某些(或某种)多糖类和/或某些（或某种）黄酮类成分，更加有利于刺激Penicillium purpurogenum Li-3的产酶；
步骤4、从步骤3中获得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂。
所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：所述步骤1中的能诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶的微生物，优选Penicillium purpurogenum Li-3；
所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤1中的斜面培养基浓度（g/L）为：葡萄糖0.01～10，NH4NO30.01～10，KH2PO40.01～5，KCl0.01～3，MgSO4·7H2O0.01～3，FeSO4·7H2O0.0001～1，琼脂0.01～30，控制pH2.0～10.0、温度115～125℃，15～30min灭菌后，冷却至室温。
所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤1斜面种子为在恒温培养箱中培养1～5天，温度20～50℃。
所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤2中的种子培养基浓度（g/L）为：葡萄糖0.01～10，NH4NO30.01～10，KH2PO40.01～5， KCl0.01～3，MgSO4·7H2O0.01～3，FeSO4·7H2O0.0001～1，控制pH2.0～10.0，温度115～125℃，15～30min灭菌后，冷却至室温。
所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤2中种子液为在摇瓶或发酵罐中培养，摇床转速100～400r/min，温度15～50℃，培养时间12～120小时，发酵罐发酵过程中控制转速为100～400r/min，通气比为0.1～10vvm，发酵温度15～65℃，溶氧为10～100％，pH为2.0～10.0，发酵时间12～120小时。再将活化的种子培养液按照1～30%（v/v）的接种量，接入种子培养基中进行二次活化，培养时间12～48小时。
所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤3中产酶培养基的碳源为甘草酸或甘草酸盐，加入一定量的外源促进剂，其中促进剂为甘草总提取物、或甘草总多糖、或甘草总黄酮，产酶培养基浓度（g/L）为：甘草酸或其盐0.1～20，外源促进剂0.1～20，其它培养基为NH4NO30.01～10，KH2PO40.01～5，KCl0.01～3，MgSO4·7H2O0.01～3，FeSO4·7H2O0.0001～1，控制pH2.0～10.0，温度115～125℃，15～30min灭菌后，冷却至室温。
所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤3中产酶培养为在摇瓶或发酵罐中培养，将二级种子液按照体积比1～30％的接种量接入到产酶培养基中，摇床培养过程中控制转速为100～400r/min，温度15～65℃，培养时间12～120h，发酵罐发酵过程中控制转速为100～400r/min，通气比为0.1～10vvm，发酵温度15～65℃，溶氧为10～100％，pH为2.0～10.0，发酵时间24～240小时。
所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤3中外源促进剂甘草总提取物制备方法为：将含有甘草酸、甘草黄酮和甘草多糖的甘草属植物，包括根、根茎、茎、花和/或果实，采用温浸、渗漉、煎煮、回流、连续回流、超声、微波或超临界流体提取法中的一种或几种提取；所用溶剂为以下溶剂中的任一种：A.水、B.甲醇与水的混合液、C.乙醇与水的混合液、D.丙酮与水的混合液、E.碱性水混合液、F.碱性甲醇混合液、G.碱性乙醇混合液；优选料液比w/v（g/ml）为1:5～1:15；优选提取次数1～3次；优选提取时间每次0.5～1.5小时；优选多次提取时将提取液合并；若为购买的甘草提取物，此步骤可省略。
所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：外源促进剂甘 草总黄酮和甘草总多糖以及转化底物甘草总三萜的制备方法为：将甘草总提取物浓缩液，或经干燥后制得甘草总提取物粉末加水溶解后，加有机试剂，优选正丁醇、乙酸乙酯，再用酸碱调节体系pH5-8，摇匀萃取，体系静置分层，有机相为含甘草总黄酮类成分，分出有机相，干燥后得甘草总黄酮粗品，水相为含甘草总三萜和甘草总多糖类成分，分出水相，加有机试剂，调节体系pH2.5-4.5，摇匀萃取，体系静置分层，有机相为含甘草总三萜类成分，水相为含有甘草总多糖类成分，分出有机相，干燥后得甘草总三萜粗品，由于水相中含有的成分较杂，先将水相所含蛋白质除掉，优选的方法是用sevag法除蛋白质，再通过加95%乙醇或无水乙醇至乙醇浓度达到60～80%沉淀得甘草多糖，干燥后得甘草总多糖粗品。
所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤4中产酶终点的发酵液为含有已经产β-葡萄糖醛酸苷酶的菌体发酵液，将含有β-葡萄糖醛酸苷酶的菌体及其发酵液制备成β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂,包括以下一种或几种：(a)含有已经产酶菌体的发酵液组分、（b）已经产酶的菌体发酵液离心后获得的全细胞菌体、（c）已经产酶的全细胞菌体破碎细胞后制得的粗酶液、（d）已经产酶的全细胞菌体冷冻干燥后制得的菌体冻干粉、（e）含有固体培养和/或半固体培养所产生的β-葡萄糖醛酸苷酶的组分。
第二项.制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸，包括以下步骤：
步骤1、配制转化反应体系，其中转化体系的底物为甘草总提取物和/或甘草总三萜；
步骤2、向转化体系中加入中β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂，转化甘草总提取物或甘草总三萜中的甘草酸及其类似物生成GAMG，至产物浓度基本恒定；
步骤3、将步骤2中所得的转化液，经过分离纯化得到产品GAMG；
所述制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：转化反应体系底物甘草总提取物和/或甘草总三萜粗品浓度为0.01～100g/L，缓冲液pH2～10；
所述制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：转化反应体系为在摇瓶或发酵罐中发酵培养，摇瓶培养过程中控制摇床转速为100～400r/min，温度15～65℃，培养时间12～120小时，发酵罐发酵过程中控制转速为100～400r/min，发酵温度15～65℃，pH为2.0～10.0，发酵时间24～240小时。
所述制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：步骤2转化结束 后的转化液，用高效液相色谱测甘草酸含量、GAMG含量，计算甘草酸转化率，GAMG产率，β-葡萄糖醛酸苷酶酶活；
酶活定义：每小时生成1μmol GAMG所需要的酶量为一个酶活力单位(U)，比酶活定义：每毫升酶液所具有的酶活力单位称为比酶活，单位U/ml。
所述制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：步骤3中转化结束后得到含GAMG的发酵液，采用酸沉、溶剂萃取，大孔吸附树脂、硅胶、聚酰胺、C18、葡聚糖凝胶方法中的一种或几种方法联合使用分离纯化得到GAMG。
有益效果
1、本发明应用能够高度定向转化生成GAMG的产紫青霉Li-3，以甘草酸（或其盐）为碳源，并加入一定量的促进剂，促进产紫青霉Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶后，不仅能够使酶活提高了0.5～5，而且产酶提前了5～48小时，甘草酸转化率提高了20～200%，GAMG产率提高了20～200%。
2、用产生β-葡萄糖醛酸苷酶菌体的发酵液，或收集已经产酶的菌体制得全细胞菌体、或已经产酶的菌体超声破碎细胞制得的粗酶液，或已经产酶的菌体冷冻干燥研碎后的粗酶冻干粉，或含有固体培养和/或半固体培养所产生的β-葡萄糖醛酸苷酶菌体的组分制备的β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂，转化甘草总提取物或甘草总三萜中的甘草酸及其类似物生成GAMG，克服了以甘草总提取物为碳源，直接加菌体后，菌体（未产酶）优先利用甘草提取物中的黄酮类和/或多糖类碳源所存在的碳代谢阻遏现象，导致不能实现诱导Penicillium purpurogenum Li-3产生β-葡萄糖醛酸苷酶水解甘草酸及其类似物生成GAMG。
3、目前报道GAMG的生产方法均是以甘草酸或甘草酸单铵盐为底物生物转化制得，由于甘草酸或其盐是由甘草经多步分离纯化制得，原料价格限制了GAMG生产成本的降低。本发明以甘草总提物或甘草总三萜为碳源，生物转化生产GAMG，有效地避免了甘草酸复杂的提取分离过程，降低了生产成本。
4、整个发酵过程工艺条件简单，操作方便，成本低、环境污染少。
附图说明
图1.β-葡萄糖醛酸苷酶水解甘草酸反应原理
图2.甘草中含GAMG骨架结构化合物
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1，仅以甘草酸单铵盐为诱导剂产酶实施方法:
将产紫青霉Li-3菌种接入斜面培养基上，于30℃恒温培养3天，斜面培养基的组成为：葡萄糖0.5g，NH4NO30.3g，KH2PO40.1g，KCl0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，FeSO4·7H2O0.001g，蒸馏水100mL，琼脂1.5g，调节pH5.5，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
取斜面培养基上的孢子，接种至种子培养基中，30℃，170r/min摇床培养72h，然后以5%的接种量转入二级种子培养基中，30℃，170r/min摇床培养24h，得到二级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖0.5g，NH4NO30.3g，KH2PO40.1g，KCl0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，FeSO4·7H2O0.001g，蒸馏水100mL，调节pH5.5，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到产酶培养基中，30℃，170r/min摇床培养84小时发酵液达最大比酶活22.4U/ml(全细胞酶活),其中GL的转化率达到83.9%，GAMG的产率达到80.1%。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐0.6g，NH4NO30.3g，KH2PO40.1g，KCl0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，FeSO4·7H2O0.001g，蒸馏水100mL，调节pH5.5，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
实施例2，甘草酸单铵盐添加外源促进剂产酶实施方法：
斜面培养和种子培养同实施例1。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到产酶培养基中，30℃，170r/min摇床培养72小时发酵液达最大比酶活82.3U/ml(全细胞酶活),其中GL的转化率达到93.6%，GAMG的产率达到92.7%。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐0.6g，甘草总提取物0.4g，NH4NO30.3g，KH2PO40.1g，KCl0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，FeSO4·7H2O0.001g，蒸馏水100mL，调节pH5.5，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
实施例3：
斜面培养和种子培养同实施例1。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到产酶培养基中，30℃，170r/min摇床培养72小时，发酵液离心收集菌体,菌体超声破碎细胞后制得粗酶液100mL，比酶活为141477U/ml（破碎细胞粗酶液酶活）。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐1.2g，甘草总提取物0.8g，NH4NO30.6g，KH2PO40.2g，KCl0.1g，MgSO4·7H2O0.1g，FeSO4·7H2O0.002g，蒸馏水200mL，pH4.8，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
取1000mL三角瓶，内装400mL底物溶液，向转化体系中加入菌体破碎细胞的粗酶液100mL，30℃，摇床培养转化6个小时后，离心，取上清液用高效液相色谱检测，计算甘草酸转化率为95.2%，GAMG产率为94.2%。转化反应体系组成为：甘草三萜粗品8.45g，醋酸缓冲液（pH=5.5）400mL。
发酵终点的发酵液，经大孔吸附树脂、C18分离纯化得到GAMG1.20g，纯度98%。
实施例4：
斜面培养、种子培养、产酶培养同实施例1。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到产酶培养基中，30℃，170r/min摇床培养60小时，发酵液离心收集菌体,酶活为42.2U/ml（全细胞酶活），菌体冷冻干燥研碎后制得粗酶冻干粉166.6mg。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐3.0g，甘草总多糖1.29g,NH4NO31.5g，KH2PO40.5g，KCl0.25g，MgSO4·7H2O02.5g，FeSO4·7H2O0.005g，蒸馏水500mL，调节pH5.5，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
取1000mL三角瓶，内装400mL反应底物溶液，向转化体系中加入粗酶冻干粉166.3mg，30℃，170r/min摇床培养，培养3天，甘草酸转化率达94.3%，GAMG产率91.1%。转化培养基组成为：甘草总总提取物44.35g，醋酸缓冲液（pH=5.5）400mL，
转化终点的发酵液，经大孔吸附树脂、硅胶、聚酰胺、C18分离纯化得到GAMG1.2mg，纯度96%。
实施例5
斜面培养、种子培养同实施例1。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到产酶培养基中，30℃，170r/min摇床培养60h，发酵液离心，收集菌体制得全细胞粗酶制剂9.5g，酶活 42.3U/ml（全细胞酶活）。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐3g，甘草总黄酮0.24g，NaNO31.5g，KH2PO40.5g，KCl0.25g，MgSO4·7H2O0.25g，FeSO4·7H2O0.005g，蒸馏水500mL，调节pH5.5，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
取1000mL三角瓶，内装400mL反应底物溶液，向转化体系中加入全细胞菌体4.15g（加湿重的菌体，400ml加400毫升的湿重菌体），30℃，170r/min摇床培养，培养3天，甘草酸转化率达94.7%，GAMG产率91.3%。转化体系组成为：甘草总三萜粗品8.06g，醋酸缓冲液（pH=5.5）400mL
转化终点的发酵液，经酸沉、有机溶剂萃取、C18分离纯化得到GAMG1.25g，纯度95%。
实施例6
将产紫青霉Li-3菌种接入斜面培养基上，于30℃恒温培养3天，斜面培养基的组成为：葡萄糖0.5g，NH4NO30.3g，KH2PO40.1g，KCl0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，FeSO4·7H2O0.001g，蒸馏水100mL，琼脂1.5g，调节pH5.5，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
取斜面培养基上的孢子，接种至种子培养基中，30℃，170r/min摇床培养72h，然后以5%的接种量转入二级种子培养基中，30℃，170r/min摇床培养24h，得到二级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖1.5g，NH4NO30.9g，KH2PO40.3g，KCl0.15g，MgSO4·7H2O0.15g，FeSO4·7H2O0.003g，蒸馏水300mL，调节pH5.5，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入发酵罐中内含2.5L到产酶培养基中，发酵过程中控制转速为100rpm，通气比为1,0vvm，温度32℃，pH5.5，培养30h，获得产酶发酵液，酶活85.4U/ml（发酵液酶活）。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐16.1g，甘草总提取物10.6g，NH4NO37.5g，KH2PO42.5g，KCl1.25g，MgSO4·7H2O1.25g，FeSO4·7H2O0.025g，蒸馏水2.5L，调节pH5.5，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
将甘草总三萜粗品50.25g加入上述产酶终点的发酵液于发酵罐中转化培养，发酵过程中控制转速为100rpm，通气比为1,0vvm，温度32℃，pH5.5，转化48小时甘草酸转化率达93.81%，GAMG产率91.09%。
转化终点的发酵液，经酸沉、有机溶剂萃取、C18分离纯化得到GAMG12.81g,纯度95%。
实施例补充说明
1、通过实施例1、2比较可以看出，以甘草酸单铵盐加甘草总提取物促进产酶，比仅以甘草酸单铵盐诱导产酶的酶活有很大提高，产酶时间大幅度地提前。实施例2比实施例1产酶提前12小时，酶活提高了2.6倍多。尽管发明人对甘草总提物刺激产紫青霉Li-3的产酶机理尚不清楚，但可以肯定的是，一定是甘草总提物中的某些除甘草酸及其无机盐之外的成分，更加有利于刺激产紫青霉Li-3的产酶。
2、以产酶后的菌体，破碎细胞后制得的粗酶液作为酶催化剂，转化甘草总提取物里的甘草酸及其类似物生成GAMG，其催化效率最快，转化6个小时可使GL的转化率达95%以上，GAMG产率94%以上，见实施例3。
3、诱导产酶后的菌体，不论是含菌体发酵液，还是全细胞菌体，还是破碎细胞后的粗酶液，还是菌体冷冻干燥后的冻干粉，对甘草三萜粗品和甘草总提取物均能转化生成GAMG，见实施例3、实施例4、实施例5、实施例6。这样可以简化以甘草酸单铵盐作为底物的提取分离过程，降低了生产成本。
Claims (3)
1.一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于包含以下步骤：
步骤1、配制转化反应体系，其中底物为甘草总提取物和/或甘草总三萜；
步骤2、向转化反应体系中加入β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂，转化甘草总提取物和/或甘草总三萜中的甘草酸及其类似物生成GAMG，至产物浓度基本恒定；
步骤3、将步骤2中所得的转化发酵液，经过分离纯化得到产品GAMG；
其中步骤2中β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的制备方法为：
步骤（1）、先将能诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶的菌种Penicilliumpurpurogenum Li-3接入到斜面培养基上，经培养后得斜面种子，其中Penicillium purpurogenum Li-3的保藏号为CGMCCNo.5446；
步骤（2）、将步骤（1）所得的斜面种子接入种子培养基中，经培养后得到种子液；
步骤（3）、将步骤（2）所得的种子液接入到含有甘草酸或甘草酸盐的产酶培养基中发酵培养，其中产酶培养基中含有外源促进剂，促进Penicilliumpurpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，其中产酶培养基诱导剂为甘草酸或甘草酸盐，外源促进剂为从甘草中提出的甘草总黄酮，产酶培养基浓度为：甘草酸或其盐0.1～20g/L，外源促进剂0.001～2g/L；
步骤（4）、从步骤（3）中获得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂，包括以下一种或几种：(a)含有已经产酶菌体的发酵液组分、（b）已经产酶的菌体发酵液离心后获得的全细胞菌体、（c）已经产酶的菌体破碎细胞后制得的粗酶液、（d）已经产酶的菌体冷冻干燥后制得的冻干粉、（e）含有固体培养和/或半固体培养所产生的β-葡萄糖醛酸苷酶的组分。
2.如权利要求1中所述的一种生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：步骤1中的转化反应体系中转化底物甘草总提取物和/或甘草总三萜粗品浓度为0.01～100g/L，缓冲液pH2～10。
3.如权利要求1中所述的一种生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：步骤2中转化为在摇瓶或发酵罐中发酵培养，摇瓶培养过程中控制摇床转速为100～400r/min，温度15～65℃，pH为2.0～10.0，培养时间12～120小时，发酵罐发酵过程中控制转速为100～400r/min，发酵温度15～65℃，pH为2.0～10.0，发酵时间24～240小时。
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