CN108261360A - 从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，包括以下步骤：1)低碳醇提取：称取甘草原料，加入低碳醇，在60～90℃下提取2～3次，合并甘草提取液并进行浓缩，得到浓缩液；2)向浓缩液中加入无机酸调节pH值至2～4，再过滤得到滤液；3)向滤液中加入碱调节pH值至6～9；4)大孔树脂纯化：将滤液经过大孔树脂吸附、洗脱、洗脱液浓缩、干燥处理后，制得水溶性总黄酮。本发明分离纯化得到的甘草黄酮是一种水溶性总黄酮，解决了甘草黄酮难溶于水的问题；本发明分离纯化得到的水溶性甘草黄酮的纯度大于50％；本发明产品收率高，工艺路线简单，适合工业化生产，且生产成本低。

Description

从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法

技术领域

本发明涉及甘草中黄酮的分离纯化技术领域，特别涉及一种从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法。

背景技术

甘草是豆科甘草属植物的根和根状茎，是最常见的中草药和经济植物。甘草黄酮是甘草中最重要的活性成分之一，已发现黄酮类化合物150多种，它们分别属于黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类、二氢黄酮类、二氢查尔酮类等十几大类。黄酮类化合物具有抗癌、防治病毒性肝炎、抗艾滋病、增强机体免疫、抗肿瘤、抗氧化、保肝功能等广泛的药理作用之外,是食品工业中理想的抗氧化剂、防腐剂，有良好的生物活性。甘草黄酮是现有化学防腐剂的优良替代品，我国食品添加剂使用卫生标准(GB2760)规定：甘草抗氧化剂可用于油脂、油炸食品、腌制鱼、肉制品、饼干、方便面、含油食品。

甘草黄酮还广泛应用于医药、保健及美容等行业，在化妆品应用中，甘草黄酮有很好的抗氧化性，能深入皮肤内部并保持高活性，有效抑制黑色素生成过程中多种酶的活性，其美白祛斑效果显著。另外甘草黄酮还具有防止皮肤粗糙和抗炎作用，甘草黄酮在美容化妆品中有多种功效。甘草黄酮有抑制酪氨酸酶活性、清除氧自由基的功效，能抑制多巴色素互变酶和DHICA氧化酶的活性。其抗氧化能力与维生素E比较接近。有与过氧化物歧化酶(SOD)相似的清除氧自由基的能力，具有快速、高效、安全的美白、祛斑功能。其美白功能优于熊果苷等其它合成的美白化合物。甘草黄酮在医药上还具有抗肿瘤、抗HIV、保肝、抗溃疡和抗心律失常的作用。

通常将甘草黄酮加入复方美白褪斑液中，临床治疗下列皮肤问题：1.黄褐斑(黎黑斑)；2.使用各种化学制剂化妆品导致的接触性皮炎；3.由身体血热偏盛，加之饮食不节、外邪侵袭、血郁痰结所导致的寻常性座疮；4.日光性及药物性皮炎；5.由肾水不足外搏而致的雀斑；甘草黄酮优异的美自功效和安全性、使其在美白化妆品中得到广泛的应用，但因为黄酮类成分一般而言大多数是油溶性物质，在水溶液中溶解度极小，而多数化妆品的基料是水性的，脂溶性黄酮的油溶性特性使其在化妆品中的配伍和应用仍然受到了较大的局限。如能通过特定的分离纯化技术从甘草中分离纯化出水溶性黄酮，就能大大增加甘草黄酮在美白化妆品中的应用。

目前所涉及甘草黄酮的分离纯化主要包括下述几种方法：

(1)溶剂萃取法：论文“溶剂萃取法分离水溶性甘草黄酮”(《过程工程学报》，1997，7(3)：4496-500)公开了采用溶剂萃取法实现了甘草浸提液中水溶性黄酮和甘草酸的分离，但此法萃取不完全，所得甘草黄酮的纯度不高，萃取率只有35％，因而不利于工业化生产。

(2)色谱联用技术：论文Flavonoids from Glycyrrhiza pallidiflora hairyroot cultures(J PH值ytochemistry，2001，58(4)：592-598)涉及的色谱联用技术多用于中草药单体成分的分离及结构鉴定。日本学者就应用色谱技术从甘草浸膏、甘草毛根培养物中提取分离得到多种甘草黄酮类化合物，操作复杂。

(3)大孔树脂法：论文“大孔吸附树脂分离纯化甘草总黄酮工艺研究”(中国药房，2006，17(1)：1355-1357)涉及的树脂吸附法是将中药水提液、醇提液直接或经浓缩得浸膏后溶解于溶剂中，再上大孔树脂柱，以适当溶剂洗脱并收集，从而对中药有效成分达到提取分离，近年来广泛应用于天然产物的提取分离，根据孔径、比表面及构成类型分为多种类型。应雪等人经试验筛选得出AB-8型大孔吸附树脂对甘草总黄酮具有良好的分离纯化效果，纯度为50％左右。

甘草黄酮分离纯化方法直接相关的授权发明专利或申请专利主要有如下：

(1)中国专利102140144A：“水溶性甘草黄酮的生产方法”，该发明涉及一种水溶性甘草黄酮的制备方法，进一步说是一种将环糊精包接甘草黄酮的新方法。通过该发明的方法，增加了甘草黄酮在水中的溶解度，扩大了甘草黄酮在美白、祛斑功能性化妆品中的应用。该方法是采用一种包接技术来增加甘草脂溶性黄酮在水中的溶解度，其甘草黄酮本身并不是水溶性黄酮，其包接率往往较低、包接产物水溶性不稳定等缺点。

(2)中国专利201310645298.7：“大孔树脂对甘草提取液中黄酮分离纯化方法”，该发明涉及一种大孔树脂对甘草提取液中黄酮分离纯化方法，选取具有不同类型的大孔树脂若干种，利用不同大孔树脂性能参数之间的协同作用，通过对吸附质在不同大孔树脂中的进行多次吸附/解吸附平衡分配，实现底物的分离纯化。该方法采用混合床技术法使用多种类型大孔树脂对甘草黄酮进行分离和纯化，该方法涉及同时使用多种大孔树脂相对于单一大孔树脂分离纯化而言，实际生产过程中质量控制较复杂，影响产品质量的稳定均一性，且该方法分离纯化并不是针对溶解性进行筛选，其甘草黄酮中同时包含水溶性和脂溶性黄酮。

(3)中国专利201410595491.9：“一种甘草黄酮的提取方法及其在制备治疗糖尿病引起的肝肾损伤药物中的应用”，本发明公开了从甘草中分离得到的甘草黄酮的方法及在治疗糖尿病引起的肝肾损伤的应用，属于中草药的提取应用领域。本发明将甘草饮片浸入95％乙醇回流提取3次，每次1.5～2.5h，合并滤液，回收溶剂，得浸膏；再将所得浸膏通过30～60目聚酰胺柱层析，依次用水、95％乙醇洗脱；层析液以盐酸-镁粉反应检测，合并鉴别反应显红色或橙红色的层析液，经浓缩和冷冻干燥，得甘草黄酮。该方法采用95％高浓度乙醇，提取次数多，乙醇重复利用率低，不满足绿色化学要求；浓缩后浸膏水溶性差，直接过柱则上样困难，处理量低及得率低。

(4)中国专利97115712.X：“甘草总黄酮提取方法”，本发明涉及甘草总黄酮提取方法，该方法以甘草或甘草粗提物为原料，经稀氨水提取，酸化沉淀，醇提取、氨化、去甜素，回收乙醇后浓缩物溶于水，调pH值，用大孔吸附树脂吸附，经水洗后，用稀氨水或氨改性稀乙醇液洗脱总黄酮粗品，经中和、浓缩、酸析、水洗、脱水，用有机溶剂提取，回收溶剂，干燥后即得甘草总黄酮，采用该方法工序复杂，有机溶剂耗量大，不满足绿色化学要求，得到总黄酮水溶性差。

(5)中国专利200510051225.0：“溶剂萃取法从甘草中分离甘草黄酮”，本发明涉及一种溶剂萃取法从甘草中分离甘草黄酮的方法。以碱性水为溶剂浸取甘草得浸取液；萃取前用酸、碱水溶液调节甘草浸取液的pH值至5～9，然后用有机溶剂萃取，静置或离心分相后，甘草黄酮被萃入有机相；以pH值为9～14的水为反萃溶剂，对负载有机相进行反萃，最后得到富集甘草黄酮的水溶液；对水溶液进行蒸发得粗甘草黄酮。萃取用有机溶剂包括醇类、酯类、中性磷类、酮类以及胺类等或它们之间的混合物，或它们(或它们之间的混合物)溶于惰性稀释剂。该方法工序繁琐，存在萃取损失，使用有机相污染水环境，违背绿色化学理念。

(6)中国专利201410338944.X：“一种室温快速提取甘草黄酮的方法”，本发明公开了一种室温快速提取甘草黄酮的方法，所述方法包括对原料进行闪式提取得到含有所述甘草黄酮的提取液的步骤。本发明的方法采用闪式提取，仪器转速比较高，设备要求高；该方法还采用了萃取-反萃取-萃取的方法，有机溶剂耗量大，操作繁琐，所得产品水溶性差，且有溶剂残留。

所以现在需要一种甘草黄酮分离纯化的新方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法。

本发明为从甘草中分离纯化水溶性甘草总黄酮的方法，且所得甘草水溶性总黄酮纯度＞50％。

甘草黄酮分离纯化方法主要有溶剂提取、超临界液体萃取法、乙酸乙酯萃取、大孔树脂分离法、聚酰胺柱色谱法、硅胶柱色谱分离法等方法。本发明人对甘草黄酮分离纯化的进行多年研究，一直寻找一种从甘草中分离纯化出水溶性好、且甘草黄酮含量高的方法，解决甘草黄酮在实际使用过程中由于水溶性差而受到极大限制的问题。

本发明采用的技术方案是：一种从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，包括以下步骤：

1)低碳醇提取：称取甘草原料，加入5～10倍量(重量/体积比)的低碳醇，在60～90℃下进行甘草药材的提取，提取2～3次，合并甘草提取液并进行浓缩，得到浓缩液；

2)加酸调pH值：向浓缩液中加入无机酸调节pH值至2～4，再过滤得到滤液；

3)加碱调pH值：向滤液中加入碱调节pH值至6～9；

4)大孔树脂纯化：将步骤3)得到的滤液经过大孔树脂吸附、洗脱、洗脱液浓缩、干燥处理后，制得水溶性总黄酮。

优选的是，所述低碳醇为甲醇或乙醇或两者的混合物。

优选的是，所述低碳醇的浓度为40％～70％。

优选的是，所述步骤2)中的酸为盐酸或硫酸或两者的混合物。

优选的是，所述步骤3)中的碱为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或多种的混合物。

优选的是，所述大孔树脂为AB-8、D101或HPD500。

优选的是，所述步骤4)中洗脱时先用水洗脱2个柱体积，再用乙醇溶液洗脱3～6个柱体积。

优选的是，所述步骤4)中用于洗脱的乙醇溶液的浓度为30％～90％。

本发明的有益效果是：

1.本发明的从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，分离纯化得到的甘草黄酮是一种水溶性总黄酮，解决了甘草黄酮难溶于水的问题；

2.本发明分离纯化得到的水溶性甘草黄酮的纯度大于50％，纯度高；

3.本发明产品收率高，工艺路线简单，适合工业化生产，且生产成本低。

附图说明

图1为本发明的实施例所制得的水溶性黄酮的液相色谱峰标定图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当指出，本发明旨在提供一种从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法。下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1：

取甘草原料200g，加入10BV的70％乙醇水溶液，加热回流1h，回流结束后放液；药渣继续加8BV的70％乙醇水溶液，加热回流1h，回流结束后放液；合并两次提取液，减压浓缩；浓缩液加硫酸调节pH值至4。酸沉液静置6h后过滤得上清液，沉淀加水洗至pH值为4，合并水洗液与上清液；用20％NaOH溶液调合并液的pH值为9，上样置径高比为1：10的AB-8树脂柱，用水洗脱2BV、70％乙醇洗脱3BV，醇洗脱液单独浓缩干燥，得到约6.42g。甘草水溶性总黄酮含量分别为52.4％，收率为3.21％，总黄酮溶解性满足要求。

实施例2：

取甘草原料200g，加入8BV的40％乙醇水溶液，加热回流1h，回流结束后放液；药渣继续加6BV的40％乙醇水溶液，加热回流1h，回流结束后放液；合并两次提取液，减压浓缩；浓缩液加硫酸调节pH值至2。酸沉液静置7h后过滤得上清液，沉淀加水洗至pH值为4，合并水洗液与上清液；用20％NaOH溶液调合并液的pH值为6.0，上样置径高比为1：10的D101树脂柱，用水洗脱2BV、30％乙醇洗脱5BV，醇洗脱液单独浓缩干燥，得到约5.52g。甘草水溶性总黄酮含量为56.38％，收率为2.76％，总黄酮溶解性满足要求。

实施例3：

取甘草药材200g，加入5BV的50％乙醇水溶液，加热回流1h，回流结束后放液；药渣继续加5BV的50％乙醇水溶液，加热回流1h，回流结束后放液；合并两次提取液，减压浓缩；浓缩液加硫酸调节pH值至3。酸沉液静置4h后过滤得上清液，沉淀加水洗至pH值为4，合并水洗液与上清液；用20％NaOH溶液调合并液的pH值为7，上样置径高比为1：10的HPD500树脂柱，用水洗脱2BV、90％乙醇洗脱3BV，醇洗脱液单独浓缩干燥，分别得到约5.35g。甘草水溶性总黄酮含量分别为57.7％，收率为2.68％，总黄酮溶解性满足要求。

实施例4：

取甘草药材2kg，加入9BV的50％乙醇水溶液，加热回流1h，回流结束后放液；药渣继续加7BV的50％乙醇水溶液，加热回流1h，回流结束后放液；合并两次提取液，减压浓缩；浓缩液加硫酸调节pH值至3。酸沉液静置7h后过滤得上清液，沉淀加水洗至pH值为4，合并水洗液与上清液；用20％NaOH溶液调合并液的pH值为9，上样置径高比为1：10的HPD500树脂柱，用水洗脱2BV、60％乙醇洗脱3BV，醇洗脱液单独浓缩干燥，分别得到约4.82g。甘草水溶性总黄酮含量分别为56.7％，收率为2.41％，总黄酮溶解性满足要求。

实施例5：

取甘草药材2kg，加入9BV的50％乙醇水溶液，加热回流1h，回流结束后放液；药渣继续加6BV的50％乙醇水溶液，加热回流1h，回流结束后放液；合并两次提取液，减压浓缩；浓缩液加硫酸调节pH值至3。酸沉液静置7h后过滤得上清液，沉淀加水洗至pH值为4，合并水洗液与上清液；用20％NaOH溶液调合并液的pH值为8，上样置径高比为1：10的HPD500树脂柱，用水洗脱2BV、60％乙醇洗脱3BV，醇洗脱液单独浓缩干燥，分别得到约4.49g。甘草水溶性总黄酮含量分别为55.2％，收率为2.24％，总黄酮溶解性满足要求。

检测方法：采用方法紫外可见分光光度法，用甘草苷作为对照品，10％氢氧化钾为显色试剂，样品处理选用水做溶剂。

样品溶解度：实验参考《中国药典》凡例项下，满足溶解要求，即溶质1g(mL)能在溶剂10～不到30mL中溶解。实施例中所得黄酮提取物均满足溶解要求。

图1给出了实施例1-5所制得的水溶性黄酮的液相色谱峰标定图，其中，S1、S2、S3、S4为标定液，S9、S8、S7、S6、S5分别为实施例1、2、3、4、5所制得的水溶性黄酮。

从上述实施例1-5可以看出，本发明分离纯化得到的水溶性甘草黄酮的纯度分别为：52.4％、56.38％、57.7％、56.7％、55.2％，均大于50％，纯度高，且黄酮溶解性满足要求。

本发明中，进行甘草药材提取的低碳醇浓度为40％～70％，能大大减少低碳醇的用量，降低生产成本。本发明通过先用酸将甘草提取液的浓缩液的pH值调节至2～4并过滤掉沉淀，沉淀可以作为甘草酸及甘草甜素的原料，实现甘草药材的多级利用；滤液再利用碱调节pH值至6～9，通过在不同工艺阶段调节合适的pH值范围，能显著提高大孔树脂对水溶性总黄酮的吸附力；最后通过大孔树脂进行纯化，制得水溶性总黄酮。制得的水溶性总黄酮的纯度高于现有普通技术，溶解性能满足要求，解决了甘草黄酮难溶于水的问题。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (8)

1.一种从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)低碳醇提取：称取甘草原料，加入5～10倍量的低碳醇，在60～90℃下进行甘草药材的提取，提取2～3次，合并甘草提取液并进行浓缩，得到浓缩液；

2)加酸调pH值：向浓缩液中加入无机酸调节pH值至2～4，再过滤得到滤液；

3)加碱调pH值：向滤液中加入碱调节pH值至6～9；

4)大孔树脂纯化：将步骤3)得到的滤液经过大孔树脂吸附、洗脱、洗脱液浓缩、干燥处理后，制得水溶性总黄酮。

2.根据权利要求1所述的从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，其特征在于，所述低碳醇为甲醇或乙醇或两者的混合物。

3.根据权利要求2所述的从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，其特征在于，所述低碳醇的浓度为40％～70％。

4.根据权利要求3所述的从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，其特征在于，所述步骤2)中的酸为盐酸或硫酸或两者的混合物。

5.根据权利要求4所述的从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，其特征在于，所述步骤3)中的碱的为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或多种的混合物。

6.根据权利要求5所述的从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，其特征在于，所述步骤4)中大孔树脂为AB-8、D101或HPD500。

7.根据权利要求6所述的从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，其特征在于，所述步骤4)中洗脱时先用水洗脱2个柱体积，再用乙醇溶液洗脱3～6个柱体积。

8.根据权利要求7所述的从甘草中分离纯化水溶性总黄酮的方法，其特征在于，所述步骤4)中用于洗脱的乙醇溶液的浓度为30％～90％。