CN105232669B - 一种酸枣叶黄酮提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酸枣叶黄酮提取物的制备方法，步骤包括：1)取酸枣叶粉碎，加乙醇浸泡，加热回流提取，滤过，收集提取液；2)将步骤1)的提取液进行浓缩，浓缩至无醇味，浓缩液通过预处理好的大孔树脂层析柱进行吸附；3)将步骤2)吸附后的大孔树脂层析柱，先用水、10％～20％乙醇溶液依次洗脱除杂，再用20％～70％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；4)将步骤3)的洗脱液浓缩，喷雾干燥，得到酸枣叶黄酮提取物。本发明采用优选的提取工艺及大孔树脂梯度洗脱工艺，成功获得了总黄酮纯度大于80％的成品。提取物对H2O2和O2 ·‑自由基清除能力强，抗氧化活性好，可在制备抗氧化药物、保健食品中应用，还可用作新食品原料。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物的制备，特别涉及酸枣叶提取物，具体属于一种酸枣叶黄酮提取物及其制备方法和应用。
背景技术
酸枣叶为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Spinosa(Bunge)Huex H.F.Chow的叶子。我国民间广泛将其加工成茶叶，具有利尿、促进胆酸合成、消炎等多种保健功能，且用酸枣叶泡水代茶饮有一定镇静作用之说。酸枣叶中含有丰富的黄酮类和三萜酸类化合物等药用成分。现代药理研究表明酸枣叶中黄酮类化合物对防治高血压、动脉粥样硬化、冠心病及脑溢血等疾病都有较好的疗效，对治疗神经衰弱也有很好的作用。
黄酮类化合物广泛分布于植物界，其主要类型有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、双黄酮和异黄酮等，具有广泛的生物活性，包括抗氧化，抗衰老，抗菌，抗肿瘤等。尤其是此类化合物结构中含有大量的酚羟基，具有较强的抗氧化作用。
国内对酸枣叶的研究多集中在酸枣叶茶的加工技术及营养保健茶的研制方面。关于工艺方面的研究鲜见报道。李凤英等(酸枣叶黄酮的提取及其抗氧化作用的研究,中国食品科学技术学会第四届年会论文摘要集)探讨了酸枣叶乙醇浸提最佳提取工艺，黄酮得率为21.1mg/g。王迎进(超声提取酸枣叶中总黄酮，食品与发酵工业，2012,38(2):229-232)采用响应曲面法优化超声辅助提取酸枣叶中总黄酮工艺(总黄酮得率5.382％)。现有技术中，酸枣叶黄酮的提取方法属于粗制的方式，存在溶剂用量大，能耗高，效价低等缺点，粗制酸枣叶黄酮难于开发成高品质的抗氧化保健食品，药品或新食品原料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度、工艺简单、绿色安全的酸枣叶黄酮提取物的制备方法；本发明的另一目的是提供酸枣叶黄酮提取物在制备抗氧化保健食品，药品或新食品原料中的应用。
为实现上述目的，本发明提供的一种酸枣叶黄酮提取物制备方法，包括以下步骤：
1)取酸枣叶粉碎，加乙醇浸泡，加热回流提取，滤过，收集提取液；
2)将步骤1)的提取液进行浓缩，浓缩至无醇味，浓缩液通过预处理好的大孔树脂层析柱进行吸附；
3)将步骤2)吸附后的大孔树脂层析柱，先用水、10％～20％乙醇溶液依次洗脱除杂，再用20％～70％乙醇溶液洗脱(优选50％乙醇溶液)，收集洗脱液；
4)将步骤3)的洗脱液浓缩，喷雾干燥，得到酸枣叶黄酮提取物。
步骤1)中所述酸枣叶粉碎的粒度为10目～65目；所述乙醇的浓度为10％～90％乙醇溶液；所述乙醇的用量按料液比计为酸枣叶质量的10～20倍；所述浸泡的时间为1h～10h；所述回流提取时间为0.5h～2h，所述提取次数为1～3次。
步骤2)中所述大孔树脂为非极性或弱极性苯乙烯系大孔树脂，弱极性大孔树脂优选为AB-8型，非极性大孔树脂优选为D101型。
步骤2)中所述浓缩液的浓度控制为0.2～1.25g/mL，浓缩液PH值为3～8(优选PH4.5～6.5)，吸附流速为0.3～3BV/h(优选0.5～1.5BV/h)。
步骤3)中所述洗脱流速为0.5～5BV/h(优选1～2BV/h)，用量为1-8BV(优选3～6BV)。
步骤4)中所述喷雾干燥的条件：进风口温度120-160℃，出风口温度80-110℃。
所述树脂的使用次数为1～5次(优选4次)。
本发明同时对各工序提取物抗氧化作用进行了考察。结果表明，各提取物样品对H2O2和O2 ·-自由基均有一定程度清除能力。其中50％乙醇精制提取物的抗氧化活性强于其它提取物，表明精制提取物是其抗氧化活性的主要部位，可以根据使用需要应用于不同的保健食品，药品或新食品原料中。
本发明所述的酸枣叶黄酮精制提取物可以被制成各种剂型，如胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸、软胶囊剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、分散片、袋茶、口服液、保健饮料等。
本发明制备的酸枣叶提取物具有如下优点和效果：
(1)本发明选用酸枣地上叶片为药材原料，该部分为酸枣生物量最大部分，扩大和丰富了酸枣植物资源应用范围，实现了药用资源的有效综合利用。
(2)本发明对影响浸膏得率及总黄酮含量的各个提取工艺参数进行优化。对大孔树脂静态、动态吸附纯化工艺各参数、抗氧化作用各条件进行了考察。采用优选的提取工艺及大孔树脂梯度洗脱工艺，成功获得了总黄酮纯度大于80％的成品。
(3)本发明采用HPLC-DAD-CL在线抗氧化方法评价了酸枣叶黄酮提取物的抗氧化活性，结果表明，精制提取物对H2O2和O2 ·-自由基清除能力最强，抗氧化活性最好。
附图说明
图1酸枣叶中黄酮类化合物在300nm检测波长处清除H2O2和O2 ·-的HPLC色谱图和生物色谱图，图中：(A)紫外色谱图(B)H2O2在线清除效果图(C)O2 ·-在线清除效果图。
图2酸枣叶20％乙醇提取物中化合物在300nm检测波长处清除H2O2和O2 ·-的HPLC色谱图和生物色谱图，图中：(A)紫外色谱图(B)H2O2在线清除效果图(C)O2 ·-在线清除效果图。
图3酸枣叶50％乙醇精制提取物中化合物在300nm检测波长处清除H2O2和O2 ·-的HPLC色谱图和生物色谱图，图中：(A)紫外色谱图(B)H2O2在线清除效果图(C)O2 ·-在线清除效果图。
具体实施方式
实施例1：
大孔吸附树脂纯化工艺的优化
(1)静态吸附与解吸附实验筛选树脂：
选取AB-8、D301、D750、D101、HPD417和DM301型大孔树脂，将酸枣叶提取液75mL加入锥形瓶中，于恒温振荡箱内振荡24h，使其达到饱和吸附。然后抽滤出酸枣叶提取液，滤液待测。将饱和吸附后的树脂水洗三次，抽滤除去水分，放入锥形瓶中，加入90％乙醇50mL，置恒温震荡器振摇24h，使之充分解吸，抽滤出解吸液，溶液待测。分光光度法测定总黄酮含量，比较不同树脂的吸附与解吸附能力。
分别通过计算吸附量与解吸率来评价树脂。吸附量(1.1)和解吸率计算公式(1.2)为：
(1.1)qe＝(C0-Ce)Vi
(1.2)D＝CdVd/(C0-Ce)Vi×100％
式(1.1)中，qe为饱和吸附量(mg)，C0溶液初始浓度，Ce吸附饱和后溶液浓度，Vi为样品体积。式(1.2)中D为解吸率，Cd为解吸附后洗脱液待测成分的浓度，Vd为洗脱液体积，C0、Ce、Vi与上同。
结果：六种树脂对酸枣叶黄酮有不同程度的吸附与解吸附作用。综合比较，弱极性树脂AB-8和非极性树脂D101的吸附和解吸率较好。实验结果参见表1。
表1各型号树脂对酸枣叶总黄酮的最大吸附量和解吸率
(2)动态法优化最佳纯化工艺：
根据静态法实验结果，取预处理好的AB-8或D101型大孔树脂5mL装柱，加入酸枣叶提取液(0.5g生药/mL)20mL进行动态吸附后，用蒸馏水洗脱至α-萘酚反应为阴性，依次用10％、20％、30％、50％、60、70％、90％的乙醇进行梯度洗脱5BV，收集洗脱液，分光光度法测定并计算总黄酮在各洗脱部位的含量。
结果：当乙醇浓度为50％时，大部分总黄酮可被洗脱。综合考虑，选用水-10％乙醇除杂，选用30-50％乙醇洗脱总黄酮组分。
实施例2：
取酸枣叶300g，粉碎至24目，加入50％乙醇溶液3000mL，浸泡6h，加热回流提取3次，保持微沸，每次1h，滤过，合并3次提取液，减压浓缩(浓度为1g/mL)，测定和计算酸枣叶黄酮提取物收率为4.7％。精密量取预处理过的D101型大孔树脂600ml，湿法装入大孔树脂柱中。将酸枣叶浓缩液300mL(PH5.5)以1BV/h的速度进行动态吸附，吸附完成后，先用水以4BV/h流速洗脱4BV至α-萘酚反应为阴性，20％乙醇以4BV/h流速洗脱4BV除杂，再用70％乙醇以4BV/h流速洗脱4BV，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液喷雾干燥(进风口温度160℃，出风口温度100℃)，即得酸枣叶总黄酮产品35g，纯度达81％。
实施例3：
取酸枣叶300g，粉碎至50目，加入70％乙醇溶液1000mL，浸泡1h，加热回流提取2次，保持微沸，每次2h，滤过，合并2次提取液，减压浓缩(浓度为0.2g/mL)，测定和计算酸枣叶黄酮提取物收率为4.2％。精密量取预处理过的AB-8型大孔树脂2000ml，湿法装入大树脂柱中。酸枣叶浓缩液1500mL(PH6.0)以3BV/h的速度进行动态吸附，吸附完成后，先用水以2BV/h流速洗脱5BV至α-萘酚反应为阴性，20％乙醇以2BV/h流速洗脱5BV除杂，再用60％乙醇以2BV/h流速洗脱5BV，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液喷雾干燥(进风口温度150℃，出风口温度90℃)，即得酸枣叶总黄酮产品30g，纯度达82％。
实施例4：
取酸枣叶300g，粉碎至10目，加入60％乙醇溶液3600mL，浸泡3h，加热回流提取2次，保持微沸，每次0.5h，滤过，合并2次提取液，减压浓缩(浓度为0.5g/mL)，测定和计算酸枣叶黄酮提取物收率为5.2％。精密量取预处理过的AB-8型大孔树脂300ml，湿法装入大树脂柱中。酸枣叶浓缩液600mL(PH5.5)以0.5BV/h的速度进行动态吸附，吸附完成后，先用水以1BV/h流速洗脱5BV至α-萘酚反应为阴性，10％乙醇以1BV/h流速洗脱5BV除杂，再用50％乙醇以1BV/h流速洗脱5BV，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液喷雾干燥(进风口温度130℃，出风口温度90℃)，即得酸枣叶总黄酮产品37g，纯度达87％。其抗氧化活性见图3。
实施例5：
取酸枣叶300g，粉碎至50目，加入60％乙醇溶液2400mL，浸泡1h，加热回流提取1次，保持微沸，提取2h，滤过，减压浓缩(浓度为0.25g/mL)，测定和计算药材中酸枣叶总黄酮提取物收率为4.7％。精密量取预处理过的D101型大孔树脂800ml，湿法装入大树脂柱中。酸枣叶浓缩液1200mL(PH5.0)以2BV/h的速度进行动态吸附，吸附完成后，先用水以3BV/h流速洗脱4BV至α-萘酚反应为阴性，10％乙醇以3BV/h流速洗脱4BV除杂，再用70％乙醇以3BV/h流速洗脱4BV，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液喷雾干燥(进风口温度140℃，出风口温度110℃)，即得酸枣叶总黄酮产品28g，纯度达80％。
实施例6：
取酸枣叶黄酮提取物100g，微粉硅胶适量，混合均匀，采用胶囊制备工艺制备，即得酸枣叶黄酮提取物胶囊。
实施例7：
取酸枣叶黄酮提取物100g，加到200g熔融的聚乙二醇6000中，采用滴丸制备工艺制备，即得酸枣叶黄酮提取物滴丸。
实施例8：
取酸枣叶黄酮提取物100g，糊精200g，混合均匀，制粒，过筛，干燥，即得酸枣叶黄酮提取物颗粒剂；或将制得的颗粒经进一步压片，干燥，即得酸枣叶黄酮提取物片剂。
实施例9：
取酸枣叶黄酮提取物100g，微晶纤维素120g，羧甲基纤维素钠30g，微粉硅胶1g，混合均匀，压片，即得酸枣叶总黄酮提取物分散片。
实施例10：
取酸枣叶黄酮提取物100g，植物油250g，混匀，用明胶作囊壳材料，压制成软胶囊，即得酸枣叶黄酮提取物软胶囊。
实施例11：酸枣叶黄酮保健饮料的制备
(1)按实施例4制备得到酸枣叶黄酮提取物。
(2)调配：为了使口感更为甘甜可口，进行调配，配方为：取酸枣叶总黄酮溶液(浓度为0.5g/ml)为1000ml，再以其总体积计，加入白砂糖：4.5％；柠檬酸：0.05％；木糖醇：2.0％；β-环状糊精：2.0％；麦芽糊精：1.5％；蜂蜜：1.5％；混合均匀后经过灌装，杀菌，即得酸枣叶黄酮保健饮料。
测定酸枣叶黄酮保健饮料中总黄酮含量为35.8％。
实施例12:酸枣叶黄酮提取物抗氧化活性研究
(1)HPLC-DAD-CL在线清除过氧化氢H2O2
在发光杯中加入50μL样品溶液(以相同量的DMSO为空白对照)和50μL 0.15％H2O2溶液，再加入鲁米诺-碳酸缓冲液(pH9.5)(1:17)混合溶液900μL启动反应，记录发光强度(Chemical Luminescence,CL)。CL值以曲线下面积计算，根据CL大小可以判断物质清除自由基的能力。
H2O2自由基清除率用以下公式计算：
自由基清除率(％)＝(CL空白对照-CL样品)/CL空白对照×100％
(2)HPLC-DAD-CL在线清除超氧阴离子O2 ·-
在发光杯中加入10μL样品溶液(以相同量的DMSO作空白对照)和20μL邻苯三酚溶液，再加入鲁米诺-碳酸缓冲液(pH10.2)(1:2)混合溶液970μL启动反应，记录发光强度(Chemical Luminescence,CL)。CL值以峰高计算，根据CL大小可以判断物质清除自由基的能力。
自由基清除率(％)＝(CL空白对照-CL样品)/CL空白对照×100％
(3)采用槲皮素为阳性对照，计算总抗氧化活性。以清除率(％)为横坐标(x)，样品浓度(y)为纵坐标，制得标准曲线，H2O2的方程式为y＝8E-06x3-0.0016x2+0.1664x-5.8425(R2＝0.9915)，O2 ·-的方程式为y＝1E-06x3-0.0003x2+0.0085x-0.2631(R2＝0.9969)。根据方程计算酸枣叶、20％乙醇提取物和50％乙醇精制提取物的总活性，假设槲皮素(1μg/mL)为一个活性单位(1u)，相对活性即为各峰的活性单位之和。
实验结果：根据清除率计算公式，计算提取物各样品对H2O2和O2 ·-的清除率。结果见表2，表3，图1，图2，图3。各提取物样品中主要色谱峰对H2O2和O2 ·-的清除能力不同。根据总活性公式，计算酸枣叶、20％乙醇提取物和50％乙醇精制提取物各样品对H2O2和O2 ·-各主要峰的总活力，结果见表2，表3。结果表明，酸枣叶50％乙醇精制提取物对H2O2和O2·-清除力最强，抗氧化总活性最强。
表2 酸枣叶提取物中18个黄酮类化合物清除H2O2的总活力和清除率(n＝3)
表3酸枣叶提取物中18个黄酮类化合物清除O2 ·-的总活力和清除率(n＝3)
Claims (4)
1.一种酸枣叶黄酮提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取酸枣叶粉碎，加乙醇浸泡，加热回流提取，滤过，收集提取液；
2)将步骤1)的提取液进行浓缩，浓缩至无醇味，浓缩液通过预处理好的AB-8型大孔树脂层析柱进行吸附；
3)将步骤2)吸附后的大孔树脂层析柱，先用水、10％～20％乙醇溶液依次洗脱除杂，再用50％或60％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；
4)将步骤3)的洗脱液浓缩，喷雾干燥，得到酸枣叶黄酮提取物；
步骤1)中所述酸枣叶粉碎的粒度为10目～65目；所述乙醇的浓度为10％～90％乙醇溶液；所述乙醇的用量按料液比计为酸枣叶质量的10～20倍；所述浸泡的时间为1h～10h；所述回流提取时间为0.5h～2h，所述提取次数为1～3次；
步骤2)中所述浓缩液的浓度控制为0.2～1.25g/mL，浓缩液pH值为3～8，吸附流速为0.3～3BV/h；
步骤3)中所述洗脱流速为0.5～5BV/h，用量为1-8BV；
步骤4)中所述喷雾干燥的条件：进风口温度120-160℃，出风口温度80-110℃。
2.如权利要求1所述方法制备的酸枣叶黄酮提取物在制备抗氧化类药物中的应用。
3.如权利要求1所述方法制备的酸枣叶黄酮提取物在制备保健食品中的应用。
4.如权利要求1所述方法制备的酸枣叶黄酮提取物在制备食品原料中的应用。
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
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Effective date of registration: 20200818 Address after: Room 301, building 7, 503 Xingguo Road, Yuhang Economic and Technological Development Zone, Hangzhou City, Zhejiang Province Patentee after: Hangzhou LvXiang Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 030006 Taiyuan, Xiaodian District, Shanxi City Road, No. 92 Co-patentee before: SHANXI University OF CHINESE MEDICINE Patentee before: Shanxi University |
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