CN101603067A - 一种定向生物合成gamg的方法 - Google Patents

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李春
王小艳
邹树平
冯世江
戴大章
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Abstract

本发明为一种定向生物合成GAMG的方法，属于生物合成与生物转化技术领域。本发明的方法是利用产紫青霉菌在发酵培养基中生产相应的β－D－葡萄糖醛酸苷酶，然后将所获的β－D－葡萄糖醛酸苷酶加入含有甘草酸底物的转化液中，在酶的作用下定向水解甘草酸，获得GAMG粗品，再经有机溶剂萃取、树脂吸附、纯化得到GAMG产品。本发明用微生物酶做催化剂，反应效率高，且无污染；步骤简单，成本低；产物单一，纯度高。

Description

一种定向生物合成GAMG的方法
技术领域
本发明涉及单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的生物合成方法，特别是在微生物酶的作用下定向催化甘草酸合成GAMG的方法，属于生物合成与生物转化技术领域。
背景技术
甘草是豆科甘草属植物，甘草酸是甘草中主要的有效成分之一，具有抗炎症、抗病毒、抗肿瘤、抗消化道溃疡等作用。此外，甘草酸还是重要的天然甜味剂，甜度约为蔗糖的200倍，且热量低，因而作为食品添加剂被广泛应用。
甘草酸(Glycyrrhizin，GL)是中药甘草的主要有效成分之一。由五环三萜皂甙通过β-1，2糖苷键和β-1，3糖苷键相连接的两个葡萄糖醛酸组成，其中五环三萜皂甙是主要的生物活性部分。甘草酸分子经水解去除末端的葡萄糖醛酸基，转化为单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid mono-glucuronide，GAMG)，可有效提高其生物活性和生物利用度。主要表现在：第一，GAMG极性介于甘草酸和甘草次酸之间，在体液中具有较好的溶解度和跨膜转运的能力，更容易为机体吸收，药物作用起效快。第二，GAMG的甜度是甘草酸的5倍多，是一种高甜度低热量的功能性甜味剂，可作为天然食品甜味剂广泛应用于各类食品基质中。第三，安全性好，动物实验研究表明，GAMG的LD50为5000mg/kg，远远大于甘草酸的LD50(805mg/kg)。由于GAMG优点突出，目前，已在国际上引起较高的重视，被列为重要的精细化工产品。
由于甘草酸分子中的两个糖苷键的键能是相似的，传统的化学水解法对这两个糖苷键的选择性很低，将甘草酸水解后可以生成GAMG和甘草次酸两种物质，无法将甘草酸定向水解生成GAMG。生物催化法具有高选择性和反应条件温和等优点，可有效地弥补传统化学改性法所固有的缺点，最大限度地抑制副反应的发生，较好地控制产品质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种定向生物合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的方法，以克服现有GAMG的化学合成选择性低、催化定向性差且对环境易造成污染的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的一种定向生物合成GAMG的方法，其具体合成步骤如下：
1)将产紫青霉菌(冯世江等，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic.2006，43：63-67)接入种子培养基中，20～45℃，120～250r/min摇床培养18～45小时，再将种子液加入到发酵培养基，20～60℃，100～300r/min发酵72～120小时；其中种子液与发酵培养基的体积比为1～15∶100；
所述的种子培养基为：每升培养基含有甘草酸0.01～10g，葡萄糖0.1～5g，NH4NO3 0.1～10g，KH2PO4 0.03～3g，MgSO4·7H2O 0.015～1.5g，KCl 0.015～1.5g，FeSO4·7H2O 0.001g，调pH3.0～8.0，种子培养基需在高压灭菌锅中110～125℃灭菌10～30min；
所述的发酵培养基为：每升培养基含有甘草酸0.01～10g，NH4NO3 0.1～10g，KH2PO4 0.03～3g，MgSO4·7H2O 0.015～1.5g，KCl 0.015～1.5g，FeSO4·7H2O0.001g，调pH3.0～8.0，发酵培养基在在高压灭菌锅中110～125℃灭菌10～30min；
2)将发酵后的发酵液加入到转化液中，25～45℃下搅拌1～25小时，用高效液相色谱(HPLC)测甘草酸含量，当甘草酸量保持1～5小时不变时终止反应；发酵液与转化液的体积比为1～50∶100；
3)将上步反应后的转化液3000-10000r/min离心5-20分钟，除去菌体，取上清液进行减压浓缩，然后用非极性大孔树脂进行吸附，用浓度为40-80％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液经减压浓缩，即可得到GAMG样品。
所述的转化液可以是以下任意一种：
①每500ml浓度为0.05～0.2M pH为3.6～5.8的醋酸钠缓冲液加入1～50g甘草酸；
②每500ml浓度为0.05～0.2M pH为5.7～8.0的磷酸钠缓冲液加入1～50g甘草酸；
③每500ml蒸馏水加入1～50g甘草酸。
本发明所述的GAMG合成方法的有益效果主要体现在：(1)用微生物酶做催化剂，反应效率高，且无污染；(2)步骤简单，成本低；(3)产物单一，纯度高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：
实例1：GAMG的生物合成
种子培养基：每升培养基含有甘草酸5g，葡萄糖3g，NH4NO3 3g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.001g，121℃灭菌20min；
发酵培养：每升培养基含有甘草酸5g，NH4NO3 3g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.001g，121℃灭菌20min；
转化液：甘草酸10g，0.05M pH 7.0磷酸缓冲液定容500ml。
产紫青霉斜面菌种接入种子培养基，180r/min，30℃摇床培养24h。种子液以体积比为1∶10的接种量转入发酵培养基，28℃，180r/min摇床培养96小时得发酵液，发酵液按50％的比例加入转化液，转化液中甘草酸浓度为2％，转化液的pH为7.5，30℃条件下搅拌3小时，反应后转化液3000r/min 20分钟，离心除去菌体，上清液减压浓缩，然后用NKA大孔树脂进行吸附，用浓度为70％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液经减压浓缩，得到90％的GAMG，转化率达85％。
实例2：GAMG的生物合成
种子培养基：甘草酸0.5g，葡萄糖1g，NH4NO3 3g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.001g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min；
发酵培养基：甘草酸0.5g，NH4NO33g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.001g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min；
转化液：甘草酸8g，0.05M pH 7.0磷酸缓冲液定容500ml。
产紫青霉斜面菌种接入种子培养基，100r/min，25℃摇床培养20h。种子液以体积比为1∶10的接种量转入发酵培养基，25℃，100r/min摇床培养72小时得发酵液，发酵液按30％的比例加入转化液，转化液中甘草酸浓度为1.6％，转化液的pH为4.5，25℃条件下搅拌6小时，反应后转化液3000r/min 20分钟，离心除去菌体，上清液减压浓缩，然后用NKA大孔树脂进行吸附，用浓度为70％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液经减压浓缩，得到95％的GAMG，转化率达65％。
实例3：GAMG的生物合成
种子培养基：甘草酸8g，葡萄糖5g，NH4NO3 3g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL 121℃灭菌20min；
发酵培养基：甘草酸8g，NH4NO3 3g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL 121℃灭菌20min；
转化液：甘草酸40g，0.05M pH 7.0磷酸缓冲液定容500ml。
产紫青霉斜面菌种接入种子培养基，300r/min，40℃摇床培养24h。种子液以体积比为1∶10的接种量转入发酵培养基，40℃，150r/min摇床培养96小时得发酵液，发酵液按50％的比例加入转化液，转化液中甘草酸浓度为8％，转化液的pH为4.5，30℃条件下搅拌3小时，反应后转化液3000r/min 20分钟，离心除去菌体，上清液减压浓缩，然后用NKA大孔树脂进行吸附，用浓度为70％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液经减压浓缩，得到85％的GAMG，转化率达50％。
实例4：GAMG的生物合成
种子培养基：甘草酸3g，葡萄糖2g，NH4NO3 3g，KH2PO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL 121℃灭菌20min；
发酵培养基：甘草酸3g，NH4NO3 3g，KH2PO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL 121℃灭菌20min；
转化液：甘草酸20g，0.05M pH 7.0磷酸缓冲液定容500ml。
产紫青霉斜面菌种接入种子培养基，250r/min，40℃摇床培养20h。种子液以体积比为1∶10的接种量转入发酵培养基，40℃，250r/min摇床培养72小时得发酵液，发酵液按30％的比例加入转化液，转化液中甘草酸浓度为4％，转化液的pH为7.0，30℃条件下搅拌3小时，反应后转化液3000r/min 20分钟，离心除去菌体，上清液减压浓缩，然后用NKA大孔树脂进行吸附，用浓度为70％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液经减压浓缩，得到95％的GAMG，转化率达68％。

Claims (1)

1、一种定向生物合成GAMG的方法，其特征在于具体合成步骤如下：
1)将产紫青霉菌接入种子培养基中，20～45℃，120～250r/min摇床培养18～45小时；再将种子液加入到发酵培养基，20～60℃，100～300r/min发酵72～120小时；其中种子液与发酵培养基的体积比为1～15∶100；
所述的种子培养基为：每升培养基含有甘草酸0.01～10g，葡萄糖0.1～5g，NH4NO30.1～10g，KH2PO40.03～3g，MgSO4·7H2O 0.015～1.5g，KCl 0.015～1.5g，FeSO4·7H2O 0.001g，调pH3.0～8.0；种子培养基需在高压灭菌锅中110～125℃灭菌10～30min；
所述的发酵培养基为：每升培养基含有甘草酸0.01～10g，NH4NO30.1～10g，KH2PO40.03～3g，MgSO4·7H2O 0.015～1.5g，KCl 0.015～1.5g，FeSO4·7H2O0.001g，调pH3.0～8.0，发酵培养基需在高压灭菌锅中110～125℃灭菌10～30min；
2)将发酵后的发酵液加入到转化液中，25～45℃下搅拌1～25小时，用高效液相色谱(HPLC)测甘草酸含量，当甘草酸量保持1～5小时不变时终止反应；发酵液与转化液的体积比为1～50∶100；
3)将上步反应后的转化液3000-10000r/min离心5-20分钟，除去菌体，取上清液进行减压浓缩，然后用非极性大孔树脂进行吸附，用浓度为40-80％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液经减压浓缩，即可得到GAMG样品；
所述的转化液可以是以下任意一种：
①每500ml浓度为0.05～0.2M pH为3.6～5.8的醋酸钠缓冲液加入1～50g甘草酸；
②每500ml浓度为0.05～0.2M pH为5.7～8.0的磷酸钠缓冲液加入1～50g甘草酸；
③每500ml蒸馏水加入1～50g甘草酸。
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