CN102367463B - 一种间歇补料发酵生产单葡萄醛酸基甘草次酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种间歇补料发酵生产单葡萄醛酸基甘草次酸(GAMG)的方法，属于生物转化技术领域。具体方法为：首先用可诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶的微生物分别在种子培养基和含有甘草酸的发酵培养基中培养诱导出相应的β-葡萄糖醛酸苷酶，然后微生物利用其诱导产生的酶特异性地裂解甘草酸分子结构中的末端糖苷键，生成GAMG，并分泌到发酵液中，再多次间歇补加底物甘草酸以及无机盐。该方法通过补加底物甘草酸及无机盐，既补充了营养物质，使得菌体能够在适宜的环境下生长，又促进了目的产物的合成；发酵结束后，GAMG产量达到13～24g/L，该方法可有效提高GAMG发酵产量，延长转化周期，提高设备利用率，降低产品生产成本。

Description

一种间歇补料发酵生产单葡萄醛酸基甘草次酸的方法
技术领域
本发明涉及一种间歇补料发酵生产单葡萄醛酸基甘草次酸(GAMG)的方法，属于生物转化技术领域。
背景技术
近年来中药材因资源急剧减少，产量逐年下降，供应紧张；而天然的药材活性成分往往含量低、结构复杂、合成困难。在现实生活中，许多药物都是通过肠胃中的各种酶类进行转化而发挥药效的，转化非常有限，而且大量的药物没有被吸收就直接被排泄到体外，不能发挥作用。如果在体外直接将药物转化为药效成分，则可大大提高中药材的利用率。现代生物转化可充分缓解药用植物资源的压力，并且可以开发出拥有自主知识产权的新药，对民族医药产业的振兴有着重要意义。
利用微生物进行药物生物转化是近几年发展起来的一项新兴技术。微生物能提供廉价和多样的酶，催化多种天然或非天然的有机物发生转化反应。以微生物作为酶的载体进行生物转化可以免去酶的分离纯化等多步复杂的前期处理手段，并且在微生物细胞的保护下，酶能够持久地发挥效力。微生物生物转化具有一般酶催化的优点：高度的立体选择性；反应条件温和；催化效率高；可以顺利完成一些化学方法难以实现的反应。除此以外，微生物生物转化还具有处理工艺简单，产物浓度高，转化率高的优点，因此，已经广泛应用到有机酸、氨基酸等的生产当中。在甘草酸医药行业领域中生物转化也有相应的应用。
甘草酸是中国传统药材甘草中的主要药理活性成分。甘草酸可以通过水解掉其分子结构上一个末端的葡萄糖醛酸基转化为单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)。与甘草酸相比，GAMG更加安全，生物利用度更高，对于某些疾病具有更强的药理作用。利用生物转化来生产GAMG，可以克服化学方法生产的低选择性、高耗能、高污染的缺点。
目前生物转化甘草酸为GAMG主要方法是利用β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸分子结构中的末端糖苷键裂解，水解去一分子葡萄糖醛酸而得到GAMG。已发现的能够转化甘草酸为GAMG的β-葡萄糖醛酸苷酶存在于肠道细菌、真菌和动物组织等，但是这些酶普遍存在选择性低的缺点，产生大量的副产物甘草次酸(GA)；另外来源于动物组织的酶，提取成本过高，不利于工业化生产。
目前生物转化甘草酸为GAMG的方法普遍存在定向性差，产量较低，成本过高的缺点，限制了GAMG的大规模应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的不足，提出了一种间歇补料发酵生产单葡萄醛酸基甘草次酸(GAMG)的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的一种间歇补料发酵生产单葡萄醛酸基甘草次酸(GAMG)的方法，具体步骤如下：
步骤1、先将可诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶的微生物，接入到斜面培养基上，经培养后制得孢子悬液；
步骤2、将步骤1所得的孢子悬液接入种子培养基中，经培养后得到种子液；
步骤3、将步骤2所得的种子液接入到含有甘草酸的发酵培养基的发酵罐中，发酵培养，直到微生物被诱导出相应的β-葡萄糖醛酸苷酶，并开始特异性地裂解甘草酸分子结构中的末端糖苷键生成GAMG时，再多次间歇补加甘草酸以及无机盐；
步骤4、发酵结束后可得到含GAMG的发酵液；经提取、纯化后得到GAMG。
所述步骤1中的可诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶的微生物，优选为产紫青霉菌(冯世江等，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic.2006，43：63-67)。
所述步骤1中的斜面培养基优选为：终浓度百分含量(g/mL)0.01～10％葡萄糖，0.01～5％NaNO3，0.01～5％K2HPO4，0.01～3％KCl，0.01～2％MgSO4·7H2O，0.001～2％FeSO4·7H2O，0.1～10％琼脂，控制pH3.0～10.0、温度115～125℃，15～25min灭菌后，冷却至室温。
所述步骤2中的种子培养基优选为：终浓度百分含量(g/mL)0.01～10％葡萄糖，0.01～5％NaNO3，0.01～5％K2HPO4，0.01～3％KCl，0.01～2％MgSO4·7H2O，0.001～2％FeSO4·7H2O，控制pH3.0～10.0、温度115～125℃，15～25min灭菌后，冷却至室温。
所述步骤3中的含有甘草酸的发酵培养基优选为：终浓度百分含量(g/mL)0.01～10％甘草酸，0.01～5％NaNO3，0.01～5％K2HPO4，0.01～3％KCl，0.01～2％MgSO4·7H2O，0.001～2％FeSO4·7H2O，控制pH3.0～10.0、温度115～130℃，15～30min灭菌后，冷却至室温。
有益效果
1、本发明采用能够高度定向合成GAMG的产紫青霉为出发菌株，有效克服了其他同类酶的选择性低的缺点，而且产物定向行性好，副产物GA产量低；
2、本发明采用微生物个体作为转化载体，有效地避免了复杂的酶分离、提取过程，降低了生产成本；
3、本发明通过控制发酵过程，并且间歇的补加底物甘草酸以及无机盐，有效提高底物利用率，延长转化周期，提高发酵产量，产物GAMG产量达到13～24g/L，浓度显著提高；
4、整个发酵过程生产效率和设备使用率高，工艺条件简单，操作方便，成本低、环境污染少。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
将产紫青霉菌种接入培养基斜面上中，于25℃恒温培养9天，加入质量浓度为0.75％生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子含量为4.1×106的孢子悬液。斜面培养基的组成为：葡萄糖6g，NaNO3 3g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，调节pH 5.0，在118℃灭菌15min后，冷却至室温。
将产紫青霉的孢子悬液以体积比5％的接种量接入种子培养基中，30℃，170r/min培养84h，然后以1％的接种量转入二级种子培养基，30℃，170r/min培养24h，得到二级种子液。种子培养基的组成为：葡萄糖6g，NaNO3 3g，K2HPO41g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL，调节pH 5.0，在118℃灭菌15min后，冷却至室温。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到2.5L发酵罐中，发酵过程中控制转速为100rpm，通气比为1.0vvm，发酵温度30℃，溶氧为60～90％，pH为4.5～5.0，发酵时间60h。发酵培养基组成为：甘草酸6g，NaNO3 3g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL，调节pH 5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。
发酵60h后，每隔24h补加终浓度6g/L无菌底物甘草酸，发酵过程中，控制溶氧为50～90％，pH为4.5～6.0，补料四次。
发酵培养9天结束后，用HPLC检测发酵液中得GAMG含量为15.64g/L，底物甘草酸转化率92.31％，得率为70.46％。经大孔树脂分离、纯化得到GAMG。
实施例2：
将产紫青霉菌种接入培养基斜面上中，于32℃恒温培养7天，加入质量浓度为0.75％生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子含量为5.8×106的孢子悬液。斜面培养基的组成为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂18克，蒸馏水1000mL，自然pH，在118℃灭菌15min后，冷却至室温。
将产紫青霉的孢子悬液以体积比5％的接种量接入种子培养基中，32℃，170r/min培养72h，然后以1％的接种量转入二级种子培养基，32℃，170r/min培养24h，得到二级种子液。种子培养基的组成同实施例1。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到2.5L发酵罐中，发酵过程中控制转速为200rpm，通气比为0.5vvm，发酵温度32℃，溶氧为60～90％，pH为4.5～5.0，发酵时间54h。发酵培养基组成同实施例1。
发酵54h后，每隔20h补加终浓度6g/L无菌底物甘草酸，发酵过程中，控制通气比为1.0vvm，溶氧在50～90％，pH为4.5～6.0，补料四次。
发酵培养10天结束后，用HPLC检测发酵液中得GAMG含量为15.97g/L，底物甘草酸转化率92.11％，得率为71.46％。经大孔树脂分离、纯化得到GAMG。
实施例3
将产紫青霉菌种接入培养基斜面上中，于30℃恒温培养7天，加入质量浓度为0.75％生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子含量为6.4×106的孢子悬液。斜面培养基的组成同实施例1。
将产紫青霉的孢子悬液以体积比5％的接种量接入种子培养基中，30℃，170r/min培养72h，然后以3％的接种量转入二级种子培养基，30℃，170r/min培养24h，得到二级种子液。种子培养基的组成同实施例1。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到2.5L发酵罐中，发酵过程中控制转速为100rpm，通气比为1.5vvm，发酵温度32℃，溶氧为60～90％，pH为4.5～5.0，发酵时间48h。发酵培养基组成同实施例1。
发酵48h后，每隔18h补加终浓度6g/L无菌底物甘草酸，发酵过程中，通气比为1.0vvm，控制溶氧为50～90％，pH为4.5～6.0，补料四次。
发酵培养8天结束后，用HPLC检测发酵液中得GAMG含量为16.62g/L，底物甘草酸转化率95.34％，得率为74.17％。经大孔树脂分离、纯化得到甘草酸。
实施例4
将产紫青霉菌种接入培养基斜面上中，于30℃恒温培养7天，加入质量浓度为0.75％生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子含量为6.7×106的孢子悬液。斜面培养基的组成同实施例1。
将产紫青霉的孢子悬液以体积比5％的接种量接入种子培养基中，32℃，170r/min培养72h，然后以3％的接种量转入二级种子培养基，30℃，170r/min培养24h，得到二级种子液。种子培养基的组成同实施例1。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到2.5L发酵罐中，发酵过程中控制转速为100rpm，通气比为1.5vvm，发酵温度32℃，溶氧为60～90％，pH为4.5～5.0，发酵时间48h。发酵培养基组成同实施例1。
发酵48h后，每隔24h补加终浓度6g/L无菌底物甘草酸，发酵过程中，通气比为1.0vvm，控制溶氧为50～90％，pH为4.5～6.0，补料6次。
发酵培养11天结束后，用HPLC检测发酵液中得GAMG含量为22.36g/L，底物甘草酸转化率95.34％，得率为70.14％。经大孔树脂分离、纯化得到甘草酸。
实施例5
将产紫青霉菌种接入培养基斜面上中，于34℃恒温培养7天，加入质量浓度为0.75％生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子含量为5.2×106的孢子悬液。斜面培养基的组成同实施例1。
将产紫青霉的孢子悬液以体积比5％的接种量接入种子培养基中，32℃，170r/min培养84h，然后以1％的接种量转入二级种子培养基，32℃，170r/min培养24h，得到二级种子液。种子培养基的组成同实施例1。
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到5L发酵罐中，发酵过程中控制转速为400rpm，通气比为1.0vvm，发酵温度32℃，溶氧为60～90％，pH为4.5～5.0，发酵时间54h。发酵培养基组成同实施例1。
发酵54h后，每隔24h补加终浓度6g/L无菌底物甘草酸，发酵过程中，控制溶氧在50～90％，pH为4.5～6.0，补料四次。
发酵培养9天结束后，用HPLC检测发酵液中得GAMG含量为16.44g/L，底物甘草酸转化率95.23％，得率为73.46％。经大孔树脂分离、纯化得到GAMG。
实施例6
将产紫青霉菌种接入培养基斜面上中，于32℃恒温培养7天，加入质量浓度为0.75％生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子含量为5.5×106的孢子悬液。斜面培养基的组成同实施例1。
将产紫青霉的孢子悬液以体积比5％的接种量接入种子培养基中，32℃，170r/min培养60h，然后以1％的接种量转入二级种子培养基，32℃，170r/min培养20h，得到二级种子液。种子培养基的组成同实施例1。
将二级种子液按照体积比5％的接种量接入到5L发酵罐中，发酵过程中控制转速为300rpm，通气比为1.0vvm，发酵温度32℃，溶氧为60～90％，pH为4.5～5.0，发酵时间60h。发酵培养基组成同实施例1。
发酵60h后，每隔24h补加终浓度6g/L无菌底物甘草酸，发酵过程中，控制溶氧在50～90％，pH为4.5～6.0，补料四次。
发酵培养9天结束后，用HPLC检测发酵液中得GAMG含量为16.21g/L，底物甘草酸转化率95.23％，得率为73.46％。经大孔树脂分离、纯化得到GAMG。

Claims (2)

1.一种间歇补料发酵生产单葡萄醛酸基甘草次酸方法，其特征在于：
将产紫青霉菌种接入培养基斜面上中，于34℃恒温培养7天，加入质量浓度为0.75%生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子含量为5.2×106的孢子悬液；
将产紫青霉的孢子悬液以体积比5%的接种量接入种子培养基中，32℃，170r/min培养84h，然后以1%的接种量转入二级种子培养基，32℃，170r/min培养24h，得到二级种子液；
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到5L发酵罐中，发酵过程中控制转速为400rpm，通气比为1.0vvm，发酵温度32℃，溶氧为60～90％，pH为4.5～5.0，发酵时间54h；
发酵54h后，每隔24h补加终浓度6g/L无菌底物甘草酸，发酵过程中，控制溶氧在50～90％，pH为4.5～6.0，补料四次；
发酵培养9天结束后，用HPLC检测发酵液中得GAMG含量为16.44g/L，底物甘草酸转化率95.23%，得率为73.46%；经大孔树脂分离、纯化得到GAMG；所述的产紫青霉菌种为产紫青霉Li-3。
2.一种间歇补料发酵生产单葡萄醛酸基甘草次酸方法，其特征在于：
将产紫青霉菌种接入培养基斜面上中，于30℃恒温培养7天，加入质量浓度为0.75%生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子含量为6.7×106的孢子悬液。
将产紫青霉的孢子悬液以体积比5%的接种量接入种子培养基中，32℃，170r/min培养72h，然后以3%的接种量转入二级种子培养基，30℃，170r/min培养24h，得到二级种子液；
将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到2.5L发酵罐中，发酵过程中控制转速为100rpm，通气比为1.5vvm，发酵温度32℃，溶氧为60～90％，pH为4.5～5.0，发酵时间48h；
发酵48h后，每隔24h补加终浓度6g/L无菌底物甘草酸，发酵过程中，通气比为1.0vvm，控制溶氧为50～90％，pH为4.5～6.0，补料6次；
发酵培养11天结束后，用HPLC检测发酵液中得GAMG含量为22.36g/L，底物甘草酸转化率95.34%，得率为70.14%；经大孔树脂分离、纯化得到甘草酸；所述的产紫青霉菌种为产紫青霉Li-3。
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