CN1854304A

CN1854304A - 一种制备硫腺苷甲硫氨酸的改进方法

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Publication number: CN1854304A
Application number: CN 200510025183
Authority: CN
Inventors: 张嗣良; 储炬; 胡晓清; 朱志钢; 朱闪; 庄英萍; 王永红; 杭海峰; 袁中一; 黄文华
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2005-04-19
Filing date: 2005-04-19
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2025-04-19
Also published as: CN100365129C

Abstract

本发明涉及一种采用生物转化法制备硫腺苷甲硫氨酸的方法，其主要由甲醇营养型重组酵母(或称嗜甲醇重组酵母)发酵获得的SAM合成酶，并在该合成酶存在下由三磷酸腺苷与L－甲硫氨酸反应生成SAM，其特征在于，在甲醇营养型重组酵母诱导表达阶段，甲醇和非甲醇碳源采用交替流加方式，甲醇流加速率为0.033～0.67g/L.min，每次持续时间为8～15h，共计3～7次，非甲醇碳源流加速率为0.013～0.47g/L.min，每次持续诱间为4～8h，共计3～7次。本发明通过改变甲醇营养型重组酵母诱导表达阶段混合碳源补加的方式，提高了SAM的产率(提高约30％)，为工业化生产SAM奠定了基础。

Description

一种制备硫腺苷甲硫氨酸的改进方法

技术领域

本发明涉及一种硫腺苷甲硫氨酸的制备方法，特别涉及一种采用生物转化法制备硫腺苷甲硫氨酸的方法。

背景技术

硫腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)是甲硫氨酸(methionine，Met)的活性形式，参与生物体内多种生化反应，是一种重要的中间代谢物，也是重要的多疗效药物。在生物学上，SAM是1碳、3碳和5碳基团的供体，具有转甲基、转氨丙基和转硫等多种生理作用，SAM广泛参与机体的甲基化，并与基因调控、荷尔蒙活性、神经传导发育和解毒在内的众多关键的身体机能关系密切。此外，SAM还可作为抗氧化剂，以及作为原料合成生物素、亚精胺和精胺等。

SAM的生产方法主要有化学合成法，酶促反应法和生物转化法。化学合成法由于底物高半胱氨酸比较贵，产率也相对较低，所以此法用的较少；酶促反应法是利用SAM合成酶的酶促反应，在该酶催化下，由三磷酸腺苷(ATP)与L-甲硫氨酸反应生成SAM，由于是体外酶促反应，因此需要添加外源ATP，生产成本高，产物易降解，而且酶的提取纯化比较困难；而生物转化法是直接在细胞体内进行转化，合成酶不需提纯，L-甲硫氨酸通过外源添加，ATP可以由细胞自身代谢提供，而且工业微生物的代谢调控与放大技术比较成熟，因此是生物转化法生产SAM的一种高效方法，目前也是生产SAM的主要方法。

现有的利用甲醇营养型重组酵母(或称嗜甲醇重组酵母)发酵制备硫腺苷甲硫氨酸(SAM)的方法中，在诱导表达阶段补加甲醇和非甲醇碳源时采用同时流加方式。实践表明：该补加方式影响了SAM的产率。因此现有技术中尚存改进余地。

发明内容

本发明所说的硫腺苷甲硫氨酸(SAM)的制备方法，其主要由甲醇营养型重组酵母(或称嗜甲醇重组酵母)发酵获得的SAM合成酶，并在该合成酶存在下由三磷酸腺苷(ATP)与L-甲硫氨酸反应生成SAM，其特征在于，在甲醇营养型重组酵母诱导表达阶段，甲醇和非甲醇碳源采用交替流加方式，甲醇流加速率为0.033～0.67g/L.min，每次持续时间为8～15h，共计3～7次，非甲醇碳源流加速率为0.013～0.47g/L.min，每次持续时间为4～8h，共计3～7次。

其中：所说的非甲醇碳源是现有用于嗜甲醇重组酵母发酵诱导表达阶段的除甲醇以外的碳源，如(但不限于)：甘油、葡萄糖、蛋白胨、各种多肽、氨基酸、黄豆饼粉和/或脂肪族有机酸，流加速率是指：单位时间内向单位体积的发酵液所流加碳源的重量。

本发明适用的菌株为采用醇氧化酶启动子P_AOX1、P_AOX2、通过表达SAM合成酶2来转化SAM的基因工程酵母，如毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)或球拟酵母(Torulopsis)等，该重组酵母构建时可采用不同的表达载体(如pPIC9K等)，而且载体在酵母内可有不同存在方式(如附加型、整合型等)，该菌可具备不同的表型(Mut⁺，Mut^s等)。

此外，为更好提高SAM的产率，在甲醇营养型重组酵母诱导表达阶段加入谷氨酸钠，其加入量为每升发酵液中3～10g。

本发明通过改变甲醇营养型重组酵母诱导表达阶段混合碳源补加的方式，提高了SAM的产率(提高约30％)，为工业化生产SAM奠定了基础。

附图说明

图1为在不同的混合碳源补料方式下SAM产率的比较曲线。

图中：■——诱导表达阶段采用交替流加碳源方式的SAM产率曲线，

▲——诱导表达阶段采用同时流加碳源方式的SAM产率曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步阐明，其目的仅在于更好理解本发明的内容，而非限制本发明的保护范围：

试验材料和方法简要说明

1菌株：本实验使用的菌种保藏号为CGMCC，NO.0648，由中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所提供，其构建过程参见CN1357630A。

2生物反应器：本实验使用的发酵罐为上海国强生化工程装备有限公司生产的FUS-15L发酵罐。

3培养基：

种子培养基：酵母抽提物0.5g，酵母基本氮源1g，蛋白胨0.375g，生物素适量，甘油0.5g，蒸馏水溶解，定容至50ml，121℃，灭菌30min。

发酵罐培养基：85％磷酸200.25ml，无水硫酸钙6.975g，硫酸钾136.5g，七水硫酸镁111.75g，氢氧化钾30.975g，甘油300g，消泡剂7.5ml，蒸馏水溶解，定容至7.5L，121℃，灭菌30min。

实施例1

在种子培养平板上挑取单菌落，接入种子培养基，培养1天，OD₆₀₀达24～30时，接入发酵罐培养基，接种量5％(v/v)。发酵罐的参数设置为：pH维持在6.0，温度为30℃，通气量为7L/min(VVM：0.9)，罐压为0.03MP，氨水补加量根据pH反馈调节，初始搅拌转速300rpm，初始溶氧为100％。分批发酵和甘油流加发酵阶段的调控策略同Pichia protocols或其它现有控制方法。

甘油流加发酵阶段结束后，停止补加甘油1h，使碳源耗完，溶氧上升至70-80％，此时进入诱导期，此阶段溶氧控制在25％，甲醇流加速率通过溶氧反馈控制，平均速率为0.25g/min，诱导8h后，停止补加甲醇，待溶氧反弹后，以一定速率流加甘油，流加速率通过溶氧反馈控制，平均流加速率为1.5g/min，培养4h后，停止补加甘油，待溶氧反弹半小时后，再补加甲醇，培养8h后，再换作甘油培养4h，如此交替至发酵结束。其中甲醇先后补加6次，每次8h，共计48h，甘油先后补加6次，每次4h，共计24h。

此外，仍以甲醇和甘油为混合碳源，在保证无甘油过量的前提下，在诱导阶段采用同时流加两种碳源的策略。

重复以上两种策略各三次，并对两种方式进行比较，结果显示：在诱导阶段补加混合碳源时，多次交替补加方式较好，能显著提高SAM的产率，较之同时补料方式，SAM产率提高22％，达到18.1g/l，结果见图1。

SAM产率的HPLC测定方法：

在毕赤酵母发酵过程中，胞内合成的SAM大部分留在胞内，但是仍有少量SAM会分泌到胞外发酵液中，特别是随着细胞的裂解，SAM会逐步释放到胞外，因此必须对胞内外的SAM同时进行抽提。

取2ml发酵液，用25％的三氯乙酸定容至10ml，4℃，抽提3h，12000rpm，离心3min，上清液过20μm微孔滤膜，滤液低温保存备用。

本发明对发酵液中的SAM进行了HPLC测定，得到了SAM产率(非分离纯化后的SAM产率)。离子对液相色谱方法：ODS C18色谱柱，流动相：a十二烷基磺酸钠，b甲醇梯度洗脱。流速1ml/min，梯度洗脱：0min，a100％；2min，a100％；4min，a30％，b70％；10min，a20％，b80％；15min，b100％.检测波长254nm，柱温25℃，线性范围为1～5g/l，保留时间10.5～11min。

实施例2

诱导阶段甲醇蛋白胨交替补料转化生产SAM：

接种、批发酵和甘油流加发酵阶段操作同实施例1，进入诱导期后，溶氧控制在5％，甲醇流加速率通过溶氧反馈控制，平均速率为0.5g/min，诱导15h后，停止补加甲醇，待溶氧反弹后，以一定速率流加蛋白胨，流加速率通过溶氧反馈控制，平均流加速率为0.1g/min，培养8h后，停止补加蛋白胨，待溶氧反弹半小时后，再补加甲醇，培养15h后，再换作蛋白胨培养8h，如此交替至发酵结束。其中甲醇先后补加3次，每次15h，共计45h，蛋白胨先后补加3次，每次8h，共计24h。较之同时补料方式，SAM产率提高14％，达到16.9g/l。

实施例3

采用上述诱导阶段混合碳源交替补料方式，SAM的产率得到了提高，为进一步提高底物L-甲硫氨酸转化生成SAM的有效转化率(转化为SAM的甲硫氨酸在消耗的甲硫氨酸中的比例)，在实施例1或实施例2的条件下，在诱导阶段添加谷氨酸钠24g，底物(L-甲硫氨酸)的有效转化率由30％提高到42％。

Claims

1、一种采用生物转化法制备硫腺苷甲硫氨酸的方法，其主要由甲醇营养型重组酵母发酵获得的SAM合成酶，并在该合成酶存在下由三磷酸腺苷与L-甲硫氨酸反应生成硫腺苷甲硫氨酸，其特征在于，在甲醇营养型重组酵母诱导表达阶段，甲醇和甘油、葡萄糖、蛋白胨、各种多肽、氨基酸、黄豆饼粉和/或脂肪族有机酸碳源采用交替流加方式，甲醇流加速率为0.033～0.67g/L.min，每次持续时间为8～15h，共计3～7次；甘油、葡萄糖、蛋白胨、各种多肽、氨基酸、黄豆饼粉和/或脂肪族有机酸碳源流加速率为0.013～0.47g/L.min，每次持续诱间为4～8h，共计3～7次。

2、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所说的甲醇营养型重组酵母为重组毕赤酵母(Pichia)、重组汉逊酵母(Hansenula)、重组假丝酵母(Candida)或重组球拟酵母(Torulopsis)。

3、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中所说的甲醇营养型重组酵母为重组毕赤酵母(Pichia)。

4、如权利要求1～3所述的任意一种制备方法，其特征在于，在甲醇营养型重组酵母诱导表达阶段加入谷氨酸钠，其加入量为每升发酵液中3～10g。