CN109402039B - 一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，属于发酵工程技术领域。本发明的方法为以不同的周期长度将MutS型毕赤酵母甲醇诱导过程中的甲醇浓度和溶解氧浓度(DO)在“高/低水平”和“低/高水平”来回切换，以提高MutS型毕赤酵母的代谢活性和甲醇比消耗速度，降低胞内甲醇的积累，大幅提高异源蛋白的浓度和活性；利用本发明的方法，可使得MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的水平较传统高甲醇浓度/低DO诱导策略和较低甲醇浓度/高DO诱导策略提高约1.5倍。

Description

一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
将状态变量(如温度、溶氧浓度、细胞比生长速度、底物比消耗速度等)定值控制在恒定水平，是实现微生物发酵过程优化的最常见的控制方法，被广泛应用于毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌等菌的发酵生产过程中。
而甲醇营养型毕赤酵母(Methylotrophic Pichiapastoris)由于被广泛应用于异源蛋白的表达，在食品、药品等的生产中均占有重要地位，因此，已经有许多研究尝试对甲醇营养型毕赤酵母的培养/诱导过程进行定值控制，以提高其异源蛋白表达量。
目前，已有部分研究取得了一定的成果。例如：在利用毕赤酵母表达生产异源蛋白的过程中，常需将细胞培养至高密度(120～150g-DCW/L，DCW：细胞干重)后再启动甲醇诱导，在整个甲醇诱导的阶段，也需持续将发酵液中的甲醇浓度控制在恒定的高水平，这些均会导致发酵液中的溶解氧浓度DO基本处在接近于0的水平，但是，毕赤酵母是高度好氧系统，长期的极低DO环境会使得其代谢活性将会下降，进而导致异源蛋白表达量表达低下，因此，毕赤酵母细胞在甲醇诱导阶段的供氧一直是一个大问题。
而部分研究通过在甲醇诱导正式启动后，将MutS型毕赤酵母表达异源蛋白过程的甲醇浓度定值控制在5～10g/L左右，一定程度的解决了此问题，如利用MutS型毕赤酵母表达生产猪α干扰素(pIFN-α)和人源溶菌酶(Ding J,Gao M J,Hou G L,et al.Stabilizingporcine interferon-αproduction by Pichia pastoris with an ethanol on‐linemeasurement based DO-Stat glycerol feeding strategy.Journal of ChemicalTechnology&Biotechnology,2014,89(12): 1948-1953；陈珊珊，丁健，李鑫，等，整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达，江苏农业学报，2018,34(1):20-28)等，不过，上述操作效果有限。
金虎等人(毕赤酵母高效发酵生产猪α干扰素过程的优化与代谢调控.无锡：江南大学博士论文，2011：42-46.)则发现，将温度定值控制在低温20℃下进行诱导时，MutS型毕赤酵母中催化甲醇代谢的第1个酶：醇氧化酶AOX的活性高，目标蛋白产量大，胞外蛋白酶分泌量小，目标蛋白不易降解，毕赤酵母发酵性能明显改善。
但是，金虎等人的操作会使得MutS型毕赤酵母中AOX活性大幅度提升，进而导致MutS型毕赤酵母耗氧更加剧烈，极低的DO水平使得毕赤酵母中催化甲醇代谢的第一个反应、甲醇→甲醛氧化反应难以高效进行，同时，当甲醇控制浓度处于高水平时，甲醇在胞外与胞内存在浓度梯度，外部甲醇会不断进入胞内，导致胞内甲醇的严重积累，两者共同造成毕赤酵母细胞的“甲醇中毒”现象，导致目标蛋白诱导表达性能下降(Zhao H L,Xue C,WangY,et al. Increasing the cell viability and heterologous proteinexpression ofPichiapastoris mutant deficient in PMR1gene by culture conditionoptimization.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,81(2):235； Jahic M,Wallberg F,Bollok M,et al.Temperature limited fed-batch technique for control ofproteolysis in Pichia pastoris bioreactor cultures.Microbial.Cell.Factories.,2003,2(1):6； Dragosits M,Stadlmann J,Albiol J,et al.The effect oftemperatureon the proteome ofrecombinant Pichiapastoris.J.Proteome.Res.,2009,8(3):1380-1392.)。
针对上述问题，可通过直接向发酵液中通入纯氧以将DO控制在较高水平，使得甲醇→甲醛的氧化反应得以高效进行，同时，甲醇代谢异化产能途径中的FLD(甲醛脱氢酶)和FDH (甲酸脱氢酶)的酶活又高于AOX的酶活，得到一定的解决，并且，理论上，此操作也会使得毕赤酵母代谢甲醇过程中的(中间)毒性物质甲醇、甲醛和甲酸等可以全部被氧化和利用，积累量大大降低，目标蛋白诱导表达性能可以进一步提高(Jin H,Liu G Q,Ye X F,etal. Enhanced porcine interferon-αproduction by recombinant Pichia pastoriswith a combinational control strategy of low induction temperature and highdissolved oxygen concentration.Biochem. Eng.J.,2010,52(1):91-98.)。
然而，同时利用纯O2和甲醇虽然可以提高目标异源蛋白的表达水平，却存在操作成本高、安全隐患大(同时使用纯O2和甲醇存在巨大安全隐患)等诸多问题。
因此，急需找到一种新的控制方法代替传统MutS型毕赤酵母诱导培养过程中的定值控制，以进一步低成本并高效安全的提升MutS型毕赤酵母在诱导培养过程中的活性以及目标蛋白产量。
发明内容
毕赤酵母中的甲醇代谢有两条途径：甲醛异化产能途径和目的蛋白合成途径(见图1)。毕赤酵母诱导培养过程中，外添的甲醇首先进入到毕赤酵母细胞质中，然后在过氧化物酶体中、通过醇氧化酶AOX的催化，氧化生成甲醛，其中，部分中间产物甲醛从过氧化物酶体脱离后，进入异化产能途径(PathwayA)，甲醛由甲醛脱氢酶(FLD)转化为甲酸，甲酸再由甲酸脱氢酶(FDH)彻底氧化为CO2、向胞外释放；另一部分甲醛则进入蛋白合成途径(Pathway B)，合成目标异源蛋白；异化产能途径(PathwayA)在氧化甲醇的同时，产生了大量的能量物质NADH，为蛋白合成途径(Pathway B)提供能量支撑。
为进一步提升MutS型毕赤酵母在诱导培养过程中的活性以及目标蛋白产量，本发明提供了一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法。此方法为以不同的时间长度将MutS型毕赤酵母甲醇诱导过程中的甲醇浓度和溶解氧浓度DO在“高/低水平”和“低/高水平”来回切换，以提高MutS型毕赤酵母的代谢活性和甲醇比消耗速度，降低胞内甲醇的积累，提高异源蛋白的浓度或活性；利用此方法，可使得MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的水平较传统高甲醇浓度/低DO诱导策略和较低甲醇浓度/高DO诱导策略提高约1.5倍。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，所述方法为当MutS型毕赤酵母的发酵生产进入甲醇诱导阶段时，先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持6～8h，再控制发酵液的溶氧浓度(DO)在15～25％，维持3～5h，先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作5～7次，甲醇诱导阶段结束；
所述溶氧浓度(DO)以溶解氧饱和浓度为100％。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为当MutS型毕赤酵母的发酵生产进入甲醇诱导阶段时，先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持7h，再控制发酵液的溶氧浓度(DO)在 20％，维持4h，重复上述先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作6次，甲醇诱导阶段结束。
在本发明的一种实施方式中，所述甲醇浓度是通过基于甲醇电极的ON-OFF在线甲醇浓度控制方法进行调控的。
所述基于甲醇电极的ON-OFF(开关)在线甲醇浓度控制方法为利用甲醇电极在线测量甲醇浓度，当测定浓度高于设定的控制浓度时，停止甲醇流加；当测定浓度低于设定的控制浓度时，启动甲醇流加，此方法记载于文献“重组毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白过程的代谢特性，食品与发酵工业，2008年第34卷第8期”中。
在本发明的一种实施方式中，所述溶氧浓度(DO)的控制方法为以一定的速度在发酵液中流加甲醇；
所述甲醇的流加速度如下：
F＝F*+Kc×(DO-DOset)，F≥0；
其中，F是甲醇流加速度，F*是基准流加速度，DO是发酵液中溶解氧的实际浓度，DOset是发酵液中溶解氧的控制浓度(％)，Kc是控制参数，F*＝0.7mL/min，DOset＝20％，控制参数Kc＝0.05。
在本发明的一种实施方式中，所述溶氧浓度(DO)的控制方法为利用工控机和其内置的 AD-DA数据接口/转化卡，驱动程序可调式蠕动泵，以一定的速度在发酵液中流加甲醇。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将MutS型毕赤酵母接种于含有甘油的初始发酵培养基中，并在初始发酵培养基中通入空气或氧气控制其溶氧浓度(DO)在10％以上进行培养，直至初始发酵培养基中的甘油消耗殆尽；初始发酵培养基中的甘油消耗殆尽后，采用改进型DO-Stat控制策略在发酵液中进行甘油流加，同时，用氨水控制发酵液pH为6.0、温度在30℃，直至发酵液中细胞密度达到125g/L；发酵液中细胞密度达到125g/L后，停止甘油流加，继续培养1～2h，直至完全耗尽发酵液中残留的甘油；完全耗尽发酵液中残留的甘油后，发酵液中DO会急剧上升，此时，控制发酵液中温度为20℃、pH为5.5，并在发酵液中添加甲醇，待DO开始下降、耗氧速率(OUR)开始上升，细胞开始适应甲醇存在的环境后，流加含有甲醇的诱导培养基启动甲醇诱导培养，甲醇诱导培养结束后，MutS型毕赤酵母的发酵结束；
所述甲醇诱导培养为先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持6～8h，再控制发酵液的溶氧浓度(DO)在15～25％，维持3～5h，重复上述先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作 5～7次，甲醇诱导阶段结束。
所述改进型DO-Stat控制策略为同时监控发酵液中的溶解氧浓度(DO，使用DO电极) 和乙醇浓度(使用甲醇电极在线测定)，当DO超过其设定(控制)值时，立即启动甘油流加，即便DO下降到设定值以下，仍然以一定的时间间隔(T)继续流加甘油，当乙醇浓度低于其控制值时，加大T确保细胞高速生长；而当乙醇浓度高于其控制值时，减小T、以乙醇为替代碳源生长细胞，并确保乙醇被消耗和不过量积累、消除其对后续的甲醇诱导性能的负面影响，此策略记载于文献“Ding J,Gao M J,Hou G L,et al.Stabilizingporcineinterferon- production byPichiapastoris with an ethanol on‐line measurementbased DO-Stat glycerol feeding strategy[J].Journal ofChemical Technology&Biotechnology,2014,89(12):1948-1953.”中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将MutS型毕赤酵母接种于含有甘油的初始发酵培养基中，并在初始发酵培养基中通入空气或氧气控制其溶氧浓度(DO)在10％以上进行培养，直至初始发酵培养基中的甘油消耗殆尽；初始发酵培养基中的甘油消耗殆尽后，采用改进型DO-Stat控制策略在发酵液中进行甘油流加，同时，用氨水控制发酵液pH为6.0、温度在30℃，直至发酵液中细胞密度达到125g/L；发酵液中细胞密度达到125g/L后，停止甘油流加，继续培养1～2h，直至完全耗尽发酵液中残留的甘油；完全耗尽发酵液中残留的甘油后，发酵液中DO会急剧上升，此时，控制发酵液中温度为20℃、pH为5.5，并在发酵液中添加甲醇，待DO开始下降、耗氧速率(OUR)开始上升，细胞开始适应甲醇存在的环境后，流加含有甲醇的诱导培养基启动甲醇诱导培养，甲醇诱导培养结束后，MutS型毕赤酵母的发酵结束；
所述甲醇诱导培养为先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持7h，再控制发酵液的溶氧浓度(DO)在20％，维持4h，重复上述先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作6次，甲醇诱导阶段结束。
在本发明的一种实施方式中，所述甲醇浓度是通过基于甲醇电极的ON-OFF在线甲醇浓度控制方法进行调控的。
所述基于甲醇电极的ON-OFF在线甲醇浓度控制方法记载于文献“重组毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白过程的代谢特性，食品与发酵工业，2008年第34卷第8期”中。
在本发明的一种实施方式中，所述溶氧浓度(DO)的控制方法为以一定的速度在发酵液中流加甲醇；
所述甲醇的流加速度如下：
F＝F*+Kc×(DO-DOset)，F≥0；
其中，F是甲醇流加速度，F*是基准流加速度(F*＝0.7mL/min)，控制参数Kc设定在0.05。
在本发明的一种实施方式中，所述溶氧浓度(DO)的控制方法为利用工控机和其内置的 AD-DA数据接口/转化卡，驱动程序可调式蠕动泵，以一定的速度在发酵液中流加甲醇。
在本发明的一种实施方式中，所述MutS型毕赤酵母在初始发酵培养基中的接种量占初始发酵培养基中总体积的13％。
在本发明的一种实施方式中，所述氨水的体积百分浓度为5％。
本发明提供了上述一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法在提升毕赤酵母异源蛋白产量方面的应用。
有益效果：
(1)本发明的方法为以不同的周期长度将MutS型毕赤酵母甲醇诱导过程中的甲醇浓度和溶解氧浓度(DO)在“高/低水平”和“低/高水平”来回切换，其中，短期的高DO环境可使得毕赤酵母代谢活性得以恢复/强化、胞内积累的甲醇可以快速利用、甲醇毒性效应大幅缓解，而相对较长的高甲醇环境可以使得甲醇诱导强度和甲醇比消耗速度得以提高、异源蛋白的浓度和活性也得以大幅提高；
(2)利用本发明的方法，可使得MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的水平较传统高甲醇浓度/低DO诱导策略和较低甲醇浓度/高DO诱导策略提高约1.5倍；
(3)利用本发明的方法可大幅度降低MutS型毕赤酵母发酵过程中氧气以及甲醇的用量，使得本发明在发酵生产过程中可使用空气代替纯氧，同时，本发明在不利用纯氧的情况下，也可以将目标异源蛋白(pIFN-α)的表达水平提升到使用纯氧的相同或更高水平，此优势大大降低了本发明的操作成本、也一定程度上消除了本发明的许多操作安全隐患。
附图说明
图1MutS型毕赤酵母甲醇代谢途径；
图2对比例1中利用MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程的甲醇浓度以及DO变化情况；
其中，─：在线甲醇浓度；-：DO；●：离线甲醇浓度；
图3对比例1中利用MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程中猪α干扰素产量和细胞浓度曲线；
其中，●：猪α干扰素浓度；〇：细胞浓度；
图4对比例2中利用MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程的甲醇浓度以及DO变化情况；
其中，─：在线甲醇浓度；-：DO；●：离线甲醇浓度；
图5对比例2中利用MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程中猪α干扰素产量和细胞浓度曲线；
其中，●：猪α干扰素浓度；〇：细胞浓度；
图6实施例1中利用MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程的甲醇浓度以及DO变化情况；
其中，─：在线甲醇浓度；-：DO；●：离线甲醇浓度；
图7实施例1中利用MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程中猪α干扰素产量和细胞浓度曲线；
其中，●：猪α干扰素浓度；〇：细胞浓度；
图8对比例1、对比例2以及实施例1中MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程发酵液样品SDS-PAGE检测结果；
图9MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程胞内AOX比活性变化曲线；
其中，○：对比例1；□：对比例2；●：实施例1。
图10MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程胞内FLD比活性变化曲线；
其中，○：对比例1；□：对比例2；●：实施例1。
图11MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程胞内FDH比活性变化曲线；
其中，○：对比例1；□：对比例2；●：实施例1。
图12MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程胞内甲醇浓度变化曲线；
其中，○：对比例1；□：对比例2；●：实施例1。
图13MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程的甲醇比消耗速率变化情况；
其中，○：对比例1；□：对比例2；●：实施例1。
图14MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程的平均甲醇比消耗速率；
图15MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程的OUR变化情况；
其中，─：实施例1；--：对比例1；
图16MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素过程的CER变化情况；
其中，─：实施例1；--：对比例1。
具体实施方式
下面结合具体实施例和对比例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的菌株如下：
携带外源猪α干扰素基因的甲醇利用慢型重组Pichiapastoris KM71菌株，由上海农业科学院畜牧兽医研究所构建，构建方法见参考文献：葛丽，李震，于瑞嵩等.猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达.中国兽医学报，2005，25(3)：289-292。
携带外源溶菌酶(human lysozyme，hLZY)基因的甲醇利用慢型重组Pichiapastoris KM71 菌株由武汉轻工大学构建，构建方法见参考文献：陈珊珊，丁健，李鑫等.整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达.江苏农业学报，2018，34：20-28。
下述实施例中涉及的培养基如下：
平板活化培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，琼脂20，pH自然。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母抽提物10，pH自然。
初始发酵培养基：甘油流加培养基(参见参考文献：Jin H,Liu G Q,Ye X F,etal.Enhanced porcine interferon-αproduction by recombinant Pichia pastoriswith a combinational control strategy of low induction temperature and highdissolved oxygen concentration.Biochemical Engineering Journal,2010,52(1):91-98.)
诱导培养基：甲醇(分析纯，纯度为≥99.5％)。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
细胞浓度、离线乙醇/甲醇浓度、蛋白浓度以及猪α干扰素抗病毒活性测定：参见参考文献：Yu R S,Dong S J,ZhuY M,et al.(2010)Effective and stable porcineinterferon-αproduction by Pichia pastoris fed-batch cultivation with multi-variables clustering and analysis.Bioprocess and Biosystems Engineering,2010,33:473-483
AOX、FLD、FDH比酶活测定：参见参考文献：Gao M J,Li Z,Yu R S,etal.Methanol/sorbitol co-feeding induction enhanced porcine interferon-αproduction by P.pastoris associated with energy metabolism shift.BioprocessandBiosystems Engineering,2012；35:1125-1136
比甲醇消耗速度测定：参见参考文献：Jia L Q,Tu TY,Huai Q Q,etal.Enhancing monellin production by Pichia pastoris at low cell inductionconcentration via effectively regulating methanol metabolism patterns andenergy utilization efficiency.PLoS ONE,2017,12(10): e0184602
人源溶菌酶活性测定：参见参考文献：赵玉萍，张灏，杨严俊.溶菌酶测定方法的改进. 食品科学，2002，23：116-119
对比例1：“传统高甲醇浓度/低DO”诱导策略下猪干扰素的表达性能
具体步骤如下：当细胞浓度达到～125g-DCW/L，启动甲醇定值控制策略(批次#1)，将甲醇浓度控制在8～10g/L，DO在诱导开始3～5h降低到0％水平(图2)。pIFN-α浓度逐渐上升、但在诱导60h后开始下降，最终的细胞浓度、pIFN-α蛋白浓度和抗病毒活性分别为150g-DCW/L、0.79g/L和2.10×107IU/mL(图3)。
毕赤酵母中的甲醇代谢有两条途径：甲醛异化产能途径和目的蛋白合成途径(图1)。外添的甲醇首先进入到细胞质中，然后在过氧化物酶体中、通过醇氧化酶AOX的催化，氧化生成甲醛，其中，部分中间产物甲醛从过氧化物酶体脱离后，进入异化产能途径(PathwayA)，由甲醛脱氢酶(FLD)转化为甲酸，甲酸再由甲酸脱氢酶(FDH)彻底氧化为CO2、向胞外释放；另一部分甲醛则进入蛋白合成途径(Pathway B)，合成目标异源蛋白。
有研究报道表明：在低温20℃进行甲醇诱导，毕赤酵母胞内AOX活性高，有利于外源蛋白的高产。但是，(1)如图2所示，AOX活性在20℃低温诱导下大幅提高，导致耗氧更加剧烈，极低的DO水平使得甲醇→甲醛的氧化反应难以高效进行；(2)甲醇在胞外/胞内存在浓度梯度，因此，当甲醇控制浓度处于高水平(8～10g/L)时，外部甲醇会不断进入胞内，而甲醇→甲醛的氧化反应又难以高效进行、导致胞内甲醇的严重积累，造成“甲醇中毒”现象，pIFN-α诱导表达性能下降，此时、胞内甲醇浓度高达0.01387g/g-DCW(图12)；(3)如果利用通纯O2的方式、能将DO控制在较高水平，则甲醇→甲醛的氧化反应得以高效进行，且异化产能途径中的FLD和FDH的酶活又远远高于AOX的酶活(图9-11)，因此，毕赤酵母中的(中间)毒性物质甲醇、甲醛和甲酸可以全部氧化/利用、其积累可以大大缓解，pIFN-α诱导表达性能可以进一步提高；(4)同时利用纯O2和甲醇虽然可以提高目标异源蛋白的表达水平，但它存在操作成本高、存在安全隐患(同时使用危险原料甲醇和氧气)等诸多问题。因此，需要开发低成本、更高效、无安全隐患的新型甲醇诱导控制系统。
对比例2：“低甲醇浓度/高DO”诱导策略下猪干扰素的表达性能
具体步骤如下：以极低速度F流加甲醇(F＝F*+Kc×(DO-DOset)，F≥0)，将发酵液中的DO大致控制在20％左右。使用该策略(诱导策略II，批次#2，对比例2)可将DO维持在 10％～35％，甲醇浓度几乎全程停留在＜1g/L的低水平。诱导75.5h，最终细胞浓度、pIFN-α浓度仅有120.3g-DCW/L和0.34g/L(图1)。目标蛋白pIFN-α的条带几乎没有加深(图8)， pIFN-α无法正常表达。
根据甲醇代谢图，(1)较高的DO控制水平，理论上可以使甲醇→甲醛的氧化反应正常进行，但由于发酵液中的甲醇浓度太低，胞外与胞内间的浓度梯度小、胞外甲醇难以进入胞内、胞内甲醇匮乏，甲醇→甲醛的氧化反应难以正常进行；(2)与诱导策略I一样，FLD和FDH的酶活也高于AOX的酶活，毒性物质甲醇(图12)、甲醛和甲酸基本上可以全部氧化/ 利用，但它们的胞内浓度太低，pIFN-α诱导表达性能远低于使用“诱导策略I(对比例1)”时的水平。
实施例1：甲醇周期诱导控制策略下猪干扰素的表达性能
具体步骤如下：
(1)毕赤酵母分批补料培养在5L发酵罐中进行，初始发酵培养基的装液量为2.3L，携带外源猪α干扰素基因的甲醇利用慢型重组Pichiapastoris KM71菌株在初始发酵培养基中接种量为13％(V/V)；
(2)培养开始后，通气量控制在3vvm(空气)，提高搅拌转速将发酵液中的DO始终维持在10％以上，进行培养；
(3)当初始培养基中的甘油消耗殆尽后，采用改进型DO-Stat控制策略(Ding J,Gao M J,Hou G L,et al.Stabilizing porcine interferon-αproductionbyPichiapastoris with an ethanol on ‐line measurement based DO‐Stat glycerolfeeding strategy[J].Journal ofChemical Technology &Biotechnology,2014,89(12):1948-1953.)在发酵液中进行甘油流加，同时，控制通气量、搅拌转速将发酵液中的DO维持在10％以上，用5％(V/V)的氨水将pH维持在6.0，培养温度控制在30℃，进行培养；
(4)在细胞达到高密度～125g-DCW/L(OD600≈500)后，停止甘油流加，再经过1～2h的“饥饿培养”，完全耗尽发酵液中残留的甘油；
(5)“饥饿培养”结束时，DO急剧上升，此时将温度和pH分别在控制20℃(利用低温加热循环槽控制诱导温度)和5.5，在发酵液中添入甲醇(甲醇添加量先添加到2-3g/L左右，再慢慢提升到8-10g/L左右，防止诱导初始阶段的“甲醇中毒”)，待DO开始下降、OUR(O2消耗速度)开始上升，细胞开始适应甲醇存在的环境后，正式流加诱导培养基、启动甲醇诱导培养；
其中，甲醇诱导控制策略为：先利用甲醇电极在线检测系统、以ON-OFF的方式全程在线控制甲醇浓度在8～10g/L的范围内，维持7h，再利用工控机和内置的AD-DA数据接口/转化卡，驱动程序可调式蠕动泵，以极低的速度流加甲醇(F＝F*+Kc×(DO-DOset)，F≥0)，全程将DO控制在其设定值(DOset＝20％)附近，维持4h，其中，F是甲醇流加速度，F*是“基准”流加速度(F*＝0.7mL/min)，控制参数Kc设定在0.05；
(6)重复实施上述策略，6个循环后，诱导时间为79h(包含操作变量变化的时间)，结束发酵(发酵液中甲醇浓度以及DO变化情况见图6、发酵液中猪α干扰素产量曲线见图7、发酵液中猪α干扰素SDS-PAGE检测结果见图8、MutS型毕赤酵母胞内AOX比活性见图9、 MutS型毕赤酵母胞内FLD比活性见图10、MutS型毕赤酵母胞内FDH比活性见图11、MutS型毕赤酵母胞内甲醇浓度变化曲线见图12、发酵液中甲醇比消耗速率变化情况见图13、发酵液中平均甲醇比消耗速率变化情况见图14、发酵液中OUR变化情况见图15、发酵液中CER 变化情况见图16、发酵性能及主要参数见表1)。
毕赤酵母是高度好氧系统，如果细胞长期处于恒定/高水平甲醇浓度的环境，会造成细胞代谢活性下降。在低温20℃下进行诱导，虽然催化甲醇代谢的第1个酶：醇氧化酶AOX的活性高，目标蛋白产量大，胞外蛋白酶分泌量小、目标蛋白不易降解，发酵性能改善明显，但此时O2的需求量更大、整个诱导期，DO基本上在接近于0的极低水平下徘徊；另外，甲醇代谢异化产能途径中的解毒酶FLD和FDH的绝对活性普遍高于AOX的活性，此条件下，高AOX酶活性使得较多的甲醇可以进入胞内，但AOX活性又低于后续解毒酶FLD和FDH 的绝对活性，无法得到有效降解/利用，使得胞内甲醇越聚越多、积累严重，最终甚至引起“甲醇中毒”现象。
周期甲醇诱导控制有解决上述问题的可能：(1)将甲醇浓度迅速降低到～0g/L水平后， DO可以迅速上升、使得细胞代谢活性得以恢复；(2)此时胞外甲醇的匮乏、可使胞内大量聚集的甲醇被快速得到利用(氧化产能/目标蛋白合成)，缓解“甲醇中毒”效应、降低胞内甲醇浓度，维持实质性的甲醇诱导；(3)待胞内甲醇消耗殆尽、迅速将甲醇浓度提高到高水平，继续维持高强度的甲醇诱导。
甲醇比消耗速率大小可以反映甲醇在胞内的代谢情况。一般情况下、甲醇比消耗速率高，目标蛋白的产量也高。图13-14比较了三个不同发酵批次的甲醇比消耗速率的变化情况。使用甲醇周期诱导控制策略(批次#3，实施例1)时的甲醇比消耗速率是最高的，而DO定值控制条件诱导策略条件下的甲醇比消耗速率最低，不到其他两个批次的一半。图15-16比较了批次#1(甲醇浓度定值控制，对比例1)和批次#3(甲醇诱导周期控制)的OUR和CER 水平(批次#2-对比例2的呼吸活性太低，数据未显示)；对比例1的OUR和CER在诱导15h 后达到稳定值，之后呈现出逐渐下降的趋势；实施例3的OUR和CER随着发酵环境条件的不断切换、呈现出周期性变化的趋势，但两者的水平总体明显高于批次#1的相应水平；与甲醇浓度定值控制(对比例1)相比，使用甲醇周期诱导控制策略(实施例1)显著提高了甲醇的比消耗速率和代谢活性(OUR和CER)，这也是pIFN-α浓度和抗病毒活性得以提高的另一个重要原因。
周期甲醇诱导控制策略的最终结果是：发酵液中最终的pIFN-α浓度为2.01g/L，猪α干扰素的抗病毒活性为3.90×107IU/mL；诱导期内的平均甲醇比消耗速率为0.0245/h；随着诱导的进行，目标蛋白pIFN-α的SDS-PAGE条带(16KDa)大幅加深(图8)，间接支持了pIFN-α浓度大幅提升的结论。
该周期控制策略(实施例1)可以：(1)提高并维持重组毕赤酵母的代谢活性和甲醇比消耗速度于高水平；(2)降低胞内甲醇浓度到极低水平(≤0.003g/g-DCW)、消除了“甲醇中毒”效应、胞内甲醇得到了充分利用；(3)最终pIFN-α活性达到3.90×107IU/mL的最高水平，是使用“次优”控制策略-甲醇浓度定值控制策略(对比例1)时，最终pIFN-α活性的 1.86倍。
对比例3：“传统高甲醇浓度/低DO”诱导策略下人源溶菌酶的表达性能
将对比例1中的携带外源猪α干扰素基因的甲醇利用慢型重组PichiapastorisKM71菌株替换成携带外源溶菌酶(human lysozyme，hLZY)基因的甲醇利用慢型重组Pichiapastoris KM71菌株，诱导时间为68h(发酵性能及主要参数见表1)。
从表1可知，发酵液中最终的人源溶菌酶浓度为0.63g/L，酶活为1.27×105IU/mL。
对比例4：“低甲醇浓度/高DO”诱导策略下人源溶菌酶的表达性能
将对比例2中的携带外源猪α干扰素基因的甲醇利用慢型重组PichiapastorisKM71菌株替换成携带外源溶菌酶(human lysozyme，hLZY)基因的甲醇利用慢型重组Pichiapastoris KM71菌株，诱导时间为71h(发酵性能及主要参数见表1)。
从表1可知，发酵液中最终的人源溶菌酶浓度为0.39g/L，人源溶菌酶的酶活为7.9×104 IU/mL。
实施例2：甲醇周期诱导控制策略下人源溶菌酶的表达性能
将实施例1中的携带外源猪α干扰素基因的甲醇利用慢型重组PichiapastorisKM71菌株替换成携带外源溶菌酶(human lysozyme，hLZY)基因的甲醇利用慢型重组Pichiapastoris KM71菌株，诱导时间为71h(发酵性能及主要参数见表1)。
从表1可知，发酵液中最终的人源溶菌酶浓度为1.46g/L，人源溶菌酶的酶活为2.15×105 IU/mL。
为了验证本发明专利(申请)“一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法”的通用性，将用于猪α干扰素生产的3种甲醇诱导方法(对比例1，对比例2，实施例1)直接用于MutS型毕赤酵母表达人源溶菌酶的发酵生产过程(对比例3，对比例4，实施例2)。从对比例3、对比例4以及实施例2可知，其结果/结论与利用MutS型毕赤酵母表达猪α干扰素的相应结果/结论完全一致。
两种MutS型毕赤酵母表达生产各自目标蛋白的结论/结果总括于表1中。与传统甲醇诱导方式(甲醇浓度控制于8-10g/L，DO～0％，对比例1和3，“次优”控制策略)相比，甲醇周期诱导控制(实施例1和2)的甲醇比消耗速率、最高目标蛋白浓度和蛋白活性均有提高，提高幅度分别为11％-18％、133％-154％和69％-86％。胞内最高甲醇浓度仅为对比例1和3相应值的8％-14％左右，胞内甲醇得到有效利用、其胞内积累得到极大缓解、“甲醇中毒”现象可以得到彻底消除。更为重要的是，甲醇周期诱导控制(实施例1和2)都是在通空气的温和条件下进行的，发酵生产的操作成本和安全隐患都有降低，经济效益明显改善。
表1不同诱导条件下MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的发酵性能比较
Figure BDA0001830472250000121
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (13)

1.一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述方法为当MutS型毕赤酵母的发酵生产进入甲醇诱导阶段时，先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持6～8h后，再以极低的速度流加甲醇，全程控制发酵液的溶氧浓度DO在15～25％，维持3～5h，重复上述先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作5～7次，甲醇诱导阶段结束；
所述溶氧浓度DO以其在水中的饱和浓度为100％；
所述溶氧浓度DO的控制方法为以一定的速度在发酵液中流加甲醇；
所述甲醇的流加速度如下：
F＝F*+Kc×(DO-DOset)，F≥0；
其中，F是甲醇流加速度，F*是基准流加速度，DO是发酵液中溶解氧的实际浓度，DOset是发酵液中溶解氧的控制浓度，Kc是控制参数，F*＝0.7mL/min，DOset＝20％，控制参数Kc＝0.05。
2.如权利要求1所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述方法为当MutS型毕赤酵母的发酵生产进入甲醇诱导阶段时，先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持7h，再控制发酵液的溶氧浓度DO在20％，维持4h，重复上述先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作6次，甲醇诱导阶段结束。
3.如权利要求1所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述甲醇浓度是通过基于甲醇电极的ON-OFF在线甲醇浓度控制方法进行调控的。
4.如权利要求1所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述方法为当MutS型毕赤酵母的发酵生产进入甲醇诱导阶段时，先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持7h，再控制发酵液的溶氧浓度DO在20％，维持4h，重复上述先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作6次，甲醇诱导阶段结束；所述甲醇浓度是通过基于甲醇电极的ON-OFF在线甲醇浓度控制方法进行调控的。
5.如权利要求1所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述溶氧浓度DO的控制方法为利用工控机和其内置的AD-DA数据接口/转化卡，驱动程序可调式蠕动泵，以一定的速度在发酵液中流加甲醇。
6.如权利要求1所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述方法为当MutS型毕赤酵母的发酵生产进入甲醇诱导阶段时，先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持7h，再控制发酵液的溶氧浓度DO在20％，维持4h，重复上述先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作6次，甲醇诱导阶段结束；所述溶氧浓度DO的控制方法为利用工控机和其内置的AD-DA数据接口/转化卡，驱动程序可调式蠕动泵，以一定的速度在发酵液中流加甲醇。
7.如权利要求1所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述方法为当MutS型毕赤酵母的发酵生产进入甲醇诱导阶段时，先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持7h，再控制发酵液的溶氧浓度DO在20％，维持4h，重复上述先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作6次，甲醇诱导阶段结束；所述甲醇浓度是通过基于甲醇电极的ON-OFF在线甲醇浓度控制方法进行调控的；所述溶氧浓度DO的控制方法为利用工控机和其内置的AD-DA数据接口/转化卡，驱动程序可调式蠕动泵，以一定的速度在发酵液中流加甲醇。
8.如权利要求1-7任一所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述方法为将MutS型毕赤酵母接种于含有甘油的初始发酵培养基中，并在初始发酵培养基中通入空气或氧气控制其溶氧浓度DO在10％以上进行培养，直至初始发酵培养基中的甘油消耗殆尽；初始发酵培养基中的甘油消耗殆尽后，采用改进型DO-Stat控制策略在发酵液中进行甘油流加，同时，用氨水控制发酵液pH为6.0、温度在30℃，直至发酵液中细胞密度达到125g/L；发酵液中细胞密度达到125g/L后，停止甘油流加，继续培养1～2h，直至完全耗尽发酵液中残留的甘油；完全耗尽发酵液中残留的甘油后，发酵液中DO会急剧上升，此时，控制发酵液中温度为20℃、pH为5.5，并在发酵液中添加甲醇，待DO开始下降、耗氧速率OUR开始上升，细胞开始适应甲醇存在的环境后，流加含有甲醇的诱导培养基启动甲醇诱导培养，甲醇诱导培养结束后，MutS型毕赤酵母的发酵结束；
所述甲醇诱导培养为先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持6～8h，再控制发酵液的溶氧浓度DO在15～25％，维持3～5h，重复上述先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作5～7次，甲醇诱导阶段结束。
9.如权利要求8所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述方法为将MutS型毕赤酵母接种于含有甘油的初始发酵培养基中，并在初始发酵培养基中通入空气或氧气控制其溶氧浓度DO在10％以上进行培养，直至初始发酵培养基中的甘油消耗殆尽；初始发酵培养基中的甘油消耗殆尽后，采用改进型DO-Stat控制策略在发酵液中进行甘油流加，同时，用氨水控制发酵液pH为6.0、温度在30℃，直至发酵液中细胞密度达到125g/L；发酵液中细胞密度达到125g/L后，停止甘油流加，继续培养1～2h，直至完全耗尽发酵液中残留的甘油；完全耗尽发酵液中残留的甘油后，发酵液中DO会急剧上升，此时，控制发酵液中温度为20℃、pH为5.5，并在发酵液中添加甲醇，待DO开始下降、耗氧速率OUR开始上升，细胞开始适应甲醇存在的环境后，流加含有甲醇的诱导培养基启动甲醇诱导培养，甲醇诱导培养结束后，MutS型毕赤酵母的发酵结束；
所述甲醇诱导培养为先控制发酵液的甲醇浓度在8～10g/L，维持7h，再控制发酵液的溶氧浓度DO在20％，维持4h，重复上述先控制甲醇浓度再控制溶氧浓度的操作6次，甲醇诱导阶段结束。
10.如权利要求8所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述MutS型毕赤酵母在初始发酵培养基中的接种量占初始发酵培养基中总体积的13％。
11.如权利要求8所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述氨水的体积百分浓度为5％。
12.如权利要求8所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法，其特征在于，所述MutS型毕赤酵母在初始发酵培养基中的接种量占初始发酵培养基中总体积的13％，所述氨水的体积百分浓度为5％。
13.权利要求1-12任一所述的一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法在提升毕赤酵母异源蛋白产量方面的应用。
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