CN104450499A - 一种基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警方法，属于生物技术领域。本发明方法步骤为：(1)确定发酵诱导期最优化的甲醇浓度变化曲线；(2)在线获取诱导期的过程参数；(3)建立支持向量机分类器；(4)对分类器进行训练和测试；(5)利用通过测试的分类器进行在线预警。将基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警系统用于pIFN-α发酵的在线故障诊断，该系统可以在发酵出现甲醇浓度过高异常时发出预警，最终发酵稳定性显著提高。

Description

一种基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警方法

技术领域

本发明涉及一种基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警方法，属于生物技术领域。

背景技术

甲醇营养型毕赤酵母(Methylotrophic Pichiapastoris)是一种优良的外源蛋白表达系统，近年来应用十分广泛，此表达系统的成功之处在于它具有强有力的醇氧化酶(AOX1)启动子，可严格调控外源蛋白的表达，但也存在不足之处：一是培养周期相对大肠杆菌较长，二是诱导期对甲醇浓度比较敏感。如果甲醇浓度过高，细胞的生长就会受到抑制，甚至出现细胞死亡。离线控制甲醇浓度时，虽然检测结果比较准确，但常常存在检测步骤繁琐、检测时间长、检测结果严重滞后等问题。而采用甲醇电极反馈控制的方法，在线调节发酵罐中甲醇浓度，由于甲醇电极容易受环境条件和其他挥发性物质的影响，使测量值与实际值相差很大。因此，寻找一种适宜的过程预警系统，在甲醇浓度过高时进行预警，对于提高目的蛋白的产量是很重要的。

发明内容

本发明以猪α干扰素(pIFN-α)为发酵产品，提出了一种基于支持向量机SVM(SupportVector Machine)的毕赤酵母发酵过程预警系统，用来识别发酵中甲醇浓度的适中和过量。

本发明提供的基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警系统包括发酵装置、检测装置和识别装置；所述检测装置将测量发酵过程参数传到所述识别装置；所述识别装置利用支持向量机分类器对过程参数进行状态分类；所述发酵过程参数包括发酵时间、搅拌转速、甲醇流加速率、氧气消耗速率、二氧化碳释放速率；所述状态分类是指分为发酵过程正常或发酵过程异常；所述发酵过程异常是指甲醇浓度过量。

所述预警系统中的状态分类通过支持向量机分类器实现。

本发明还提供一种基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警方法，包括以下步骤：

(1)确定发酵诱导期最优化的甲醇浓度变化曲线；

(2)在线获取诱导期的过程参数；

(3)建立支持向量机分类器；

(4)对分类器进行训练和测试；

(5)利用通过测试的分类器进行在线预警；

所述步骤(1)中最优化的甲醇浓度变化曲线必须通过至少6批正常发酵批次才能实现。

所述步骤(2)中的过程参数包括发酵时间、搅拌转速、甲醇流加速率、氧气消耗速率、二氧化碳释放速率。

所述步骤(3)支持向量机具体建立方法是：支持向量机为标准的向量机，所用的核函数是最常用的径向基(Radial basis function，RBF)核函数。学习样本可以表示为(Y_i,z_i)，向量Y_i表示第i组样本的输入特征。Y_i是一个5维向量，包括发酵时间、搅拌转速、甲醇流加速率、氧气消耗速率、二氧化碳释放速率，必须把所有数据归一化到0～1之间。z_i表示Y_i对应的特征标签，取值为“0”或“1”，表示发酵正常或者异常。

如图1所示，超平面H₁将样本点分为两类，H₁由WX+b＝0表示，H₂和H₃是一对平行的超平面，分别被定义为WX+b＝1和WX+b＝-1。SVM算法的目的是在保证二者均能对样本点进行正确分类的前提下，最大化它们之间的距离2/||W||，即最小化1/2||W||²，从而求解出分类超平面H₁。若分类正确，则所有的样本X_i(i＝1,2,……,N)均应满足y_i×(WX_i+b)≥1，H₁的求解过程可以用下述参数优化问题表示：

$\underset{W,b}{\min }\left(\frac{1}{2}{\left|\right|W\left|\right|}^2\right)$           公式1

Subject to y_i×(WX_i+b)≥1(1≤i≤N)

引入松弛变量ξ_i、惩罚因子C和拉格朗日乘子α_i、β_i，然后分别对W、b、α_i和β_i并求偏导，并将偏导置零，原问题可转化为：

$\underset{\mathrm{\&alpha;}}{\max }{L}_D=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\mathrm{\&alpha;}}_i-\frac{1}{2}\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}\underset{j=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}{y}_i{y}_j{\mathrm{\&alpha;}}_i{\mathrm{\&alpha;}}_j<X_i{X}_j>$        公式2

对未知X分类的判别函数如下：

$y\left(X\right)=\mathrm{sgn}[\underset{X_i\&Element;\mathrm{SV}}{\mathrm{\&Sigma;}}{\mathrm{\&alpha;}}_i{y}_i<X_{i}X>+b]$        公式3

如果X在原有特征空间内不是线性可分的，则可以利用核函数K(X_i,X)，将其映射至更高维的特征空间中再进行分类，本文所用的核函数是最常用的径向基(Radial basis function，RBF)核函数。核函数和映射后的判别函数分别如公式4和公式5所示：

    公式4

$y\left(X\right)=\mathrm{sgn}[\underset{X_i\&Element;\mathrm{SV}}{\mathrm{\&Sigma;}}{\mathrm{\&alpha;}}_i{y}_{i}K(X_i,X)+b]$        公式5

所述对分类器的训练和测试，是把历史数据分成两个部分，2批以上正常的数据作为训练样本，2批以上故障的数据和其他2批以上正常发酵的数据用来作为故障检验。

所述支持向量机分类器的训练和测试，在本发明的一种实施方式中，选择3批正常的数据作为训练样本，2批故障的数据和其他2批正常发酵的数据用来作为故障检验。

所述步骤(5)是在步骤(4)的测试结果都能达到要求后，才进行的。

所述支持向量机分类器进行测试，对于未参加训练的2批正常发酵数据和2批非正常发酵的数据，能做出正确的诊断，对故障作出响应的时间在1小时之内，然后才能进行在线故障诊断工作。

本发明的有益效果：本发明诊断方法能够在线快速准确地诊断出甲醇浓度过高的异常。同样的故障，当采用自适应人工神经网络时，有的不能诊断，有的滞后明显。该方法能够推广到重组毕赤酵母表达其他外源蛋白的发酵生产中。

附图说明

图1：支持向量机分类；

图2：最优化发酵条件下的甲醇浓度随时间变化曲线，其中黑色实圆代表甲醇浓度，空心三角形代表抗病毒活性；

图3：正常发酵、甲醇浓度过高情况下的诊断结果，其中(a)正常发酵时的特征标签z_i值图，(b)正常发酵时pIFN-α抗病毒活性及生物量变化，(c)甲醇浓度过高时的特征标签z_i值图，(d)甲醇浓度过高时pIFN-α抗病毒活性及生物量变化，圆圈代表生物量，三角形代表抗病毒活性。

具体实施方式

实施例1 发酵过程预警系统在pIFN-α发酵过程中的应用

pIFN-α发酵采用巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris KM71，Mut^S菌株，表达载体和外源基因分别为pPICZαA和IFNαcDNA。培养基组成如下(g/L，特别说明除外)：

平板培养基：YPD固体培养基：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，琼脂20。

种子培养基：YPD液体培养基：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。

发酵初始培养基：甘油20(mL/L)，H₃PO₄20(mL/L)，K₂SO₄1，(NH₄)₂SO₄5，CaSO₄0.1，MgSO₄1，PTM₁10(mL/L)，pH 6.0。

甘油流加培养基：甘油500(mL/L)，MgSO₄0.03，(NH₄)₂SO₄0.5，KH₂PO₄0.5，PTM₁10(mL/L)，pH 6.0。

甲醇流加培养基：甲醇500(mL/L)，MgSO₄0.03，(NH₄)₂SO₄0.5，KH₂PO₄0.5，PTM₁10(mL/L)，pH 5.5。

发酵过程在5L发酵罐(Biotech-2002，上海保兴生物设备工程有限公司)中进行，初始装液量为1.5L，接种量为10％，调节搅拌转速将DO维持在10％以上，发酵过程中温度始终控制在30℃，生长期和诱导期pH分别控制在6.0和5.5。菌体先在发酵初始培养基上生长10～12h，当甘油耗尽，DO迅速上升时，采用DO-Stat法流加甘油培养基，使菌体继续生长。当菌体浓度达到诱导条件(120～130g-DCW/L左右)后，停止流加甘油，进行1～2h的“饥饿培养”，使酵母细胞将发酵液中残留的甘油和其他可能充当替代碳源的中间代谢物质全部消耗。之后进入诱导期，开始诱导外源蛋白表达，诱导时间在60～70h。

一种基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警方法，包括以下步骤：

(1)最优化甲醇浓度变化曲线。

诱导期甲醇浓度直接影响了细胞的生理状态和目的蛋白的表达量。经过多次重复实验确定了最优化的甲醇浓度变化曲线。如图2甲醇浓度对pIFN-α抗病毒活性影响很大。在诱导阶段，控制甲醇浓度于一适中的水平(约10g/L)是实现pIFN-α高效表达的关键。过高甲醇浓度(15-20g/L)不利于pIFN-α的表达。

(2)获取表达期的过程参数。

通过各种检测仪器获取过程参数：发酵罐自动检测搅拌转速；氧气消耗速率、二氧化碳释放速率通过尾气分析仪检测；甲醇流加速率通过天平计量，发酵时间从诱导开始算起。过程数据储存在上位机。

(3)建立支持向量机分类器。

支持向量机为标准的向量机，所用的核函数是最常用的径向基(Radial basis function，RBF)核函数。学习样本可以表示为(Y_i,z_i)，向量Y_i表示第i组样本的输入特征。Y_i是一个5维向量，包括发酵时间、搅拌转速、甲醇流加速率、氧气消耗速率、二氧化碳释放速率，必须把所有数据归一化到0～1之间。z_i表示Y_i对应的特征标签，取值为“0”或“1”，表示发酵正常或者异常。

(4)对支持向量机分类器进行训练和测试。

所述的对神经网络进行训练和测试是，将每一批次的发酵时间、搅拌转速、甲醇流加速率、氧气消耗速率、二氧化碳释放速率的值记为一批数据，并将所有发酵批次的发酵测量数据分成两部分，前2批数据为训练样本，后4批数据为检验样本。

对于完成训练的支持向量机。在正常的发酵中，神经网络的输入和输出是相关的。用正常发酵数据作为输入数据时，特征标签z_i应该等于“0”。另一方面，在采用非正常数据作为神经网络的输入时，特征标签z_i应该等于“1”。图3a、3c所示，分别为正常发酵、异常发酵时的支持向量机特征标签z_i值输出。

(5)利用通过测试的支持向量机进行在线预警。

利用通过测试的支持向量机进行预测必须将输入数据归一化到0～1之间，再输入到通过测试的支持向量机，在线计算z_i值，就能实时判断是否有故障出现。

设计了两个批次诱导阶段甲醇浓度控制水平各不相同的pIFN-α发酵实验用来检验上述故障诊断系统的性能。批次1中，甲醇浓度控制在10g/L左右，处于一适中水平。批次2中，甲醇浓度较高，平均浓度超过15-20g/L，是典型的甲醇“过量”的发酵批次。这两个批次中pIFN-α抗病毒活性及生物量变化情况如图3b、3d所示。如图3a、3c所示，SVM-BTA/FUZZY预警系统能够快速准确地识别出三个批次pIFN-α发酵的状态。批次1中，SVM-BTA/FUZZY预警系统的输出值在整个发酵周期内(0～60h)始终维持在“0”，这表示发酵状态的识别结果为甲醇浓度“适中”。在批次2中，诊断程序开始运行后，SVM-BTA/FUZZY预警系统的输出值在1h内迅速上升，并最终稳定在“1”，一直维持到60h诱导结束，表明该批次的诊断结果为甲醇浓度“过量”。

通过比较可以得出结论：由于系统响应速度快，状态识别准确，鲁棒性强，所建立的预警系统对训练组和实时的在线过程都有很好的预测效果，可以作为识别pIFN-α发酵甲醇浓度过高故障的有效工具，有较强的推广能力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警系统，所述系统包括发酵装置、检测装置和识别装置；所述检测装置将测量发酵过程参数传到所述识别装置；所述识别装置利用支持向量机分类器对过程参数进行状态分类；所述发酵过程参数包括发酵时间、搅拌转速、甲醇流加速率、氧气消耗速率、二氧化碳释放速率；所述状态分类是指分为发酵过程正常或发酵过程异常；所述发酵过程异常是指甲醇浓度过量。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述状态分类是通过支持向量机分类器实现。

3.一种基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警方法，包括以下步骤：

(1)确定发酵诱导期最优化的甲醇浓度变化曲线；

(2)在线获取诱导期的过程参数，包括发酵时间、搅拌转速、甲醇流加速率、氧气消耗速率、二氧化碳释放速率；

(3)建立支持向量机分类器；

(4)对分类器进行训练和测试；

(5)利用通过测试的分类器进行在线预警。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1中最优化的甲醇浓度变化曲线通过至少6批正常发酵批次得到。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的支持向量机为标准的向量机，所用的核函数是径向基核函数，学习样本表示为(Y_i,z_i)，向量Y_i表示第i组样本的输入特征；所述Yi是一个5维向量，包括发酵时间、搅拌转速、甲醇流加速率、氧气消耗速率、二氧化碳释放速率，必须把所有数据归一化到0～1之间，z_i表示Y_i对应的特征标签，取值为“0”或“1”，表示Y_i的类别，即正常或异常。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述支持向量机分类器参数取值包括：超平面H₁将样本点分为两类，H₁由WX+b＝0表示，H₂和H₃是一对平行的超平面，分别被定义为WX+b＝1和WX+b＝-1，所述支持向量机算法的目的是在保证二者均能对样本点进行正确分类的前提下，最大化它们之间的距离2/||W||，即最小化1/2||W||²，从而求解出分类超平面H₁，若分类正确，则所有的样本X_i(i＝1,2,……,N)均应满足y_i×(WX_i+b)≥1，H₁的求解过程用下述参数优化问题表示：

                       公式1

Subject to y_i×(WX_i+b)≥1  (1≤i≤N)

引入松弛变量ξ_i、惩罚因子C和拉格朗日乘子α_i、β_i，然后分别对W、b、α_i和β_i并求偏导，并将偏导置零，原问题可转化为：

                  公式2

对未知X分类的判别函数如下：

                    公式3

如果X在原有特征空间内不是线性可分的，则利用核函数K(X_i,X)，将其映射至更高维的特征空间中再进行分类，所用的核函数是径向基核函数；核函数和映射后的判别函数分别如公式4和公式5所示：

    公式4

           公式5 。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4中对分类器的训练和测试，是把历史数据分成两个部分，2批以上正常的数据作为训练样本，2批以上故障的数据和其他2批以上正常发酵的数据用来作为故障检验。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤5是在步骤4的测试结果都能达到要求后，才进行的。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法用正常发酵数据作为输入数据时，特征标签z_i等于“0”，在采用非正常数据作为作为输入数据时，特征标签z_i等于“1”。

10.权利要求1所述预警系统在毕赤酵母发酵方面的应用。