CN114045320A - 一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法 - Google Patents

一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法 Download PDF

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CN114045320A CN202111321044.0A CN202111321044A CN114045320A CN 114045320 A CN114045320 A CN 114045320A CN 202111321044 A CN202111321044 A CN 202111321044A CN 114045320 A CN114045320 A CN 114045320A
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贾禄强
李天翼
王庆玲
李腾
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

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Abstract

本发明提供了一种基于改良型DO‑stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，所述方法包括当Mut+型重组毕赤酵母进入甲醇流加诱导阶段时，采用在线指数和DO‑stat相结合策略进行甲醇流加控制，以将DO的震荡宽度范围控制在10‑30％，甲醇浓度控制在0‑2g/L。采用本发明的方法，胞内的有毒的代谢物(甲醇和甲醛)维持在了零水平；且甲醇消耗/流加速度被明显提高了。

Description

一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的 方法
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法。
背景技术
人粒细胞集落刺激因子(hGCSF)是一种造血细胞因子，作用于中性粒细胞谱系的细胞，能引起定向前体细胞的增殖和分化，并激活成熟中性粒细胞。由于其低分子量(18.8kDa)的特性，hGCSF可快速从血浆中清除，半衰期(t1/2)极短，仅为4-8小时。为了解决这一问题，构建了重组毕赤酵母生产人血清白蛋白人粒细胞集落刺激因子(HSA-GCSFm)融合蛋白的组成型表达载体，其具有较强的生物活性和较长的体内半衰期。但是，与HSA-GCSFm融合蛋白生产过程优化的相关文献报道较少。
甲醇营养型毕赤酵母是一种表达外源蛋白的理想型的宿主。一般而言，重组毕赤酵母表达外源蛋白主要分成两个阶段：1)在细胞生长阶段，以甘油为唯一碳源在短时间内获得高密度的骨架完整、功能健全的细胞；2)在甲醇诱导阶段，通过流加甲醇诱导重组蛋白的高效表达。众所周知，甲醇诱导阶段的时间(70-90h)远长于细胞生长阶段(20-30h)。因此，开发一种有效的甲醇流加策略被认为是提高外源蛋白表达的关键问题。大量的甲醇流加策略已经被开发并应用于外源蛋白的高效表达，例如定速流加甲醇，甲醇ON-OFF流加和DO-stat流加甲醇等。在上述的甲醇流加策略中，在线DO-stat和ON-OFF反馈控制策略被认为优于其他控制策略，因为其在甲醇流加过程中可在线处理发酵过程参数的动态变化[CosO,Ramón R,Montesinos JL,et al.Microb Cell Fact,2006,5:17]。然而，传统的DO-stat流加策略通过在线测量的DO水平控制底物流加且(或)基于DO的持续震荡流加底物，这往往会导致碳源(甲醇)的匮乏[Jia LQ,Li T,Wu YX,et al.Appl.Microbiol.Biotechnol,2021,105:1041-1050]。具体地说，采用DO-stat流加策略时，毕赤酵母细胞对于甲醇的需求超出了甲醇的流加量，这意味着毕赤酵母细胞消耗甲醇受到了限制。另一方面，当采用ON-OFF控制策略时，甲醇浓度被控制在4-10g/L的充足水平会导致胞内有毒代谢物的积累[GaoMJ,Shi ZP.Chin J Chem Eng,2013,21:216-226]。因此，细胞处于甲醇过剩(ON-OFF控制)和匮乏(DO-stat控制)的状态必须被考虑和解决。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，目的是提高甲醇消耗率和外源蛋白的表达，也可为毕赤酵母表达外源蛋白的过程控制提供一些有价值的信息。
基于上述目的，本发明提供了一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，所述方法包括当Mut+型重组毕赤酵母进入甲醇流加诱导阶段时，采用在线指数和DO-stat相结合策略进行甲醇流加控制，以将DO的震荡宽度范围控制在10-30％，甲醇浓度控制在0-2g/L。
作为一种优选的实施方式，所述在线指数和DO-stat相结合策略进行甲醇流加控制，此方法将DO的震荡宽度控制在了狭窄且稳定的水平(～20％)，甲醇浓度在0-1g/L。
作为一种优选的实施方式，所述在线指数和DO-stat相结合策略是通过基于溶解氧电极在线监测溶解氧浓度进行调控甲醇流加速度的调控方法得到的。
所述调控方法是当细胞浓度达到预期目标且甘油完全耗尽时，开始进入甲醇流加阶段，利用DO电极在线测量DO浓度，预设DO浓度的设定值为20％，当测定浓度高于DO浓度的设定值时，停止甲醇流加；当测定浓度低于DO浓度的设定值时，启动甲醇流加。
所述甲醇的流加速度采用如下计算公式得到：
Figure BDA0003345612360000031
其中，FMeOH是甲醇流加速度；DO是发酵液中溶解氧的实际浓度；DOset＝20％，DOset是发酵液中溶解氧的设定浓度；KC＝0.06，KC是比例参数；YX/S＝0.37，YX/S是细胞对甲醇的得率；μset＝0.03l/h，μset是细胞比生长速度的设定值；Xt0＝80.0g/L，Xt0是甲醇流加开始时的细胞浓度；t0是甲醇流加的开始时间；tf是甲醇流加的结束时间。
所述溶解氧浓度的控制方法为利用工控机和其内置的AD-DA数据接口/转化卡，驱动程序可调式蠕动泵，以所述计算公式在发酵液中流加甲醇。
所述方法为将携带HSA-GCSFm融合蛋白的Mut+型重组毕赤酵母接种到含有甘油初始培养基的发酵罐中，通过调整搅拌转速将DO控制在20％以上，保持温度30℃，pH＝6.0；当初始培养基中甘油被耗尽且DO急剧上升，采用DO-stat控制策略用于甘油流加阶段的甘油流加，同时，控制发酵液pH为6.0，当细胞浓度达到～80g-DCW/L且残留的甘油完全耗尽后，开始流加甲醇进入甲醇诱导阶段，在整个甲醇诱导阶段，空气和纯氧按需求用于曝气，温度和pH控制不变。
所述Mut+型重组毕赤酵母在初始发酵培养基中的接种量为初始发酵培养基总体积的15-25％。
在发酵开始时，通气速度为3-5vvm。
在整个发酵阶段，通过氨水和磷酸控制发酵液pH为6.0。
本发明的有益效果：
(1)采用本发明的方法，胞内的有毒的代谢物(甲醇和甲醛)维持在了零水平。
(2)采用本发明的方法，甲醇消耗/流加速度被明显提高了。
(3)采用本发明的方法，在甲醇流加阶段，维持细胞代谢所需的甲醇处于最低水平。
(4)采用本发明的方法，HSA-GCSFm浓度达到了0.44g/L的最高水平。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为对比例1中Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的胞外甲醇浓度以及DO变化情况；其中，---：在线溶解氧浓度；■：胞外甲醇浓度；
图2为对比例1中Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的甲醇消耗速度以及胞内甲醇浓度曲线；其中，▲：甲醇比消耗速度；
Figure BDA0003345612360000041
胞内甲醇浓度；
图3为对比例1中Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的HSA-GCSFm浓度以及细胞浓度变化情况；其中，●：HSA-GCSFm浓度；◆：细胞浓度；
图4为对比例2中Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的胞外甲醇浓度以及DO变化情况；其中，---：在线溶解氧浓度；■：胞外甲醇浓度；
图5为对比例2中Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的甲醇消耗速度以及胞内甲醇浓度曲线；其中，▲：甲醇比消耗速度；
Figure BDA0003345612360000042
胞内甲醇浓度；
图6为对比例2中Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的HSA-GCSFm浓度以及细胞浓度变化情况；其中，●：HSA-GCSFm浓度；◆：细胞浓度；
图7为实施例中Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的胞外甲醇浓度以及DO变化情况；其中，---：在线溶解氧浓度；■：胞外甲醇浓度；
图8为实施例中Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的甲醇消耗速度以及胞内甲醇浓度曲线；其中，▲：甲醇比消耗速度；
Figure BDA0003345612360000051
胞内甲醇浓度；
图9为实施例中Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的HSA-GCSFm浓度以及细胞浓度变化情况；其中，●：HSA-GCSFm浓度；◆：细胞浓度；
图10为Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的细胞比生长速率；其中，●：实施例；■：对比例2；
图11为Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的细胞比生长速率与甲醇比消耗速率的线性关系；其中，●：实施例；■：对比例2；
图12为Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的细胞死亡率；其中，●：实施例；▲：对比例1；■：对比例2；
图13为Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的AOX比活性变化曲线；其中，●：实施例；▲：对比例1；■：对比例2；
图14为Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的FLD比活性变化曲线；其中，●：实施例；▲：对比例1；■：对比例2；
图15为Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的FDH比活性变化曲线；其中，●：实施例；▲：对比例1；■：对比例2；
图16为Mut+型重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的胞内甲醛浓度变化曲线；其中，●：实施例；▲：对比例1；■：对比例2。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
菌种
在本发明中，以Mut+型突变菌株P.pastoris GS115作为宿主菌株将HSA-hGCSFm基因连接到pPIC9K。本发明中的Mut+型重组P.pastoris菌株由江南大学构建，保存于实验室-40℃冰箱中。
培养基组成
培养基的具体组分如下(除特殊说明外单位均为g/L)：
活化培养基：葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨20，琼脂20。
种子培养基(YPD培养基)：葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨20。
初始培养基：甘油20，(NH4)2SO4 5，H3PO4 2(％，v/v)，MgSO4 1，CaSO4 0.1，K2SO4 1，PTM1 10mL/L，pH 6.0。
甘油流加培养基：甘油500，(NH4)2SO4 0.5，KH2PO4 0.5，MgSO4 0.03，PTM1 10mL/L，pH 6.0。
甲醇诱导培养基：纯甲醇(纯度99.5％)，PTM1 10mL/L，pH 6.0。
本发明中Mut+型重组毕赤酵母表达HSA-GCSFm的发酵流程如下：
将携带HSA-GCSFm融合蛋白的Mut+毕赤酵母接种到含有2.3L甘油初始培养基的5L发酵罐中，通过调整转速(不超过800rpm)将DO控制在20％以上的水平。此时，温度和pH分别保持在30℃和6.0。当初始培养基中甘油被耗尽且DO急剧上升，采用DO-stat控制策略用于甘油流加阶段的甘油流加，同时，用氨水和磷酸控制发酵液pH为6.0。当细胞浓度达到～80g-DCW/L的较高水平时且残留的甘油完全耗尽后，开始添加甲醇进入甲醇诱导阶段。此外，在整个甲醇诱导阶段，空气和纯氧按需求用于曝气，温度和pH控制不变。
对比例1(甲醇ON-OFF控制)：基于甲醇电极的在线测量值，通过ON-OFF甲醇控制策略将甲醇浓度控制在5-10g/L的水平。
对比例2：传统的DO-stat甲醇控制策略。
实施例(基于指数和DO-stat相结合控制)：基于指数和DO-stat控制策略，通过调节甲醇流加速度控制DO在20％水平，按照下述公式：
Figure BDA0003345612360000071
其中，FMeOH是甲醇流加速度；DO是发酵液中溶解氧的实际浓度；DOset＝20％，DOset是发酵液中溶解氧的设定浓度(％)；KC＝0.06，KC是比例参数；YX/S＝0.37，YX/S是细胞对甲醇的得率；μset＝0.03l/h，μset是细胞比生长速度的设定值；Xt0＝80.0g/L，Xt0是甲醇流加开始时的细胞浓度；t0是甲醇流加的开始时间；tf是甲醇流加的结束时间。
本发明中对比例和实施例的分析方法如下：
菌浓测定：P.pastoris细胞密度通过分光光度计在600nm条件下测定(OD600)，细胞干重(DCW)遵循如下一致性标准曲线：g-DCW/L＝0.25×OD600。
胞内和胞外甲醇浓度测定：采用气相色谱方法测定胞内和胞外甲醇浓度，具体方法参见参考文献：Gao MJ,Li Z,Yu RS,et al.Bioprocess Biosyst Eng,2012,35:1125-1136。
胞内甲醛浓度测定：采用液相色谱测定胞内甲醛浓度，具体方法参见参考文献：Gao MJ,Li Z,Yu RS,et al.Bioprocess Biosyst Eng,2012,35:1125-1136。
细胞死亡率测定：采用流式细胞术测定细胞死亡率，具体方法参见参考文献：WangZH,Wang Y,Zhang DX,et al.Bioresour Technol,2010,101:1318-1323。
HSA-GCSFm浓度测定：采用微量尿白蛋白试剂盒测定HSA-GCSFm浓度，具体方法参见参考文献：Guan B,Chen FX,Lei JY,et al.Appl Biochem Biotechnol,2013,171:1792-1804。
AOX、FLD、FDH比酶活性测定：参见参考文献：Gao MJ,Li Z,Yu RS,etal.Bioprocess Biosyst Eng,2012,35:1125-1136。
甲醇比消耗速率测定：参见参考文献：Jia LQ,Tu TY,Huai QQ,et al.PLoS ONE,2017,12:e0184602。
不同诱导控制策略下表达HSA-GCSFm的发酵性能
在高耗氧性P.pastoris表达外源蛋白的过程中，高密度细胞(～80-100g-DCW/L)，传统的通气条件无法同时实现甲醇和DO的充足状态。因此，“甲醇充足-氧气受限”和“甲醇受限-氧气充足”是两种可行的诱导控制策略。在本发明中，“甲醇充足-氧气受限”的环境通过甲醇ON-OFF控制策略(对比例1)实现，并首次应用于P.pastoris高效表达HSA-GCSFm。如图1所示，在甲醇诱导初期，当甲醇浓度控制于充足水平(4-10g/L)时，由于P.pastoris细胞的高耗氧特性，DO自然将至～0％的水平。在此条件下，由于氧气供应受限、甲醇无法被充分氧化(CH3OH+O2→HCHO+H2O2)，导致胞内甲醇大量积累(图2)。此时，由于胞内甲醇大量积累，P.pastoris细胞逐渐失去生长和外源蛋白合成的能力，发酵液中最高的细胞浓度和HSA-GCSFm浓度分别处于88.25g-DCW/L和0.13g/L的较低水平(图3)。当仅采用传统的DO-stat控制策略(对比例2)时，通过限制甲醇流加可以将甲醇浓度控制在～0g/L的受限状态，此时，DO可处于预期的充足状态(0-60％)(图4)。此时，胞内甲醇未发生积累，最终细胞浓度和HSA-GCSFm浓度分别达到了110.52g-DCW/L和0.30g/L的较高水平(图5和6)。
众所周知，传统的DO-stat流加策略仅通过DO的持续震荡决定基质(甲醇)的流加，会导致基质不充足无法实现外源蛋白的高效表达。在甲醇诱导阶段，甲醇单独诱导条件下，甲醇同时作为碳源、能源和诱导剂。因此，寻求合适的甲醇流加策略来维持甲醇消耗速度在较高水平是实现HSA-GCSFm高效表达的有效方法。
在本发明中，为了提高甲醇诱导阶段的甲醇消耗/流加速度来有效表达HSA-GCSFm，提出并实施了一种基于指数和DO-stat相结合控制策略(实施例)。如图7所示，在此条件下，DO的震荡宽度被控制在较窄且稳定的水平(～20％)，甲醇消耗/流加速度显著增加。此时，最终细胞浓度和HSA-GCSFm浓度分别达到了138.52g-DCW/L和0.44g/L的最高水平。
不同诱导控制策略下维持细胞代谢所需甲醇情况和细胞死亡率
以甲醇为唯一碳源的P.pastoris生产外源蛋白过程中，甲醇的消耗可分为两部分:细胞生长/目标重组蛋白合成和细胞维持代谢。通过描述比甲醇消耗速率(ν)与特定细胞生长速率(μ)，三种不同诱导策略下的维持系数(m)可由下式计算:
Figure BDA0003345612360000091
如图11所示，为了维持细胞内的稳态，当酵母细胞长时间暴露在DO剧烈连续振荡的环境时，采用对比例2所述的甲醇诱导控制策略，甲醇流向细胞的维持系数处于0.01951/h的最高水平(图11)；此时，在实施例所述的诱导控制策略下，DO的振荡宽度控制在狭窄且稳定的水平(图7)，使得甲醇流向细胞代谢的维持系数处于最低的水平(0.0126 1/h)(图11)。由此可知，在实施例条件下，甲醇消耗/流加速度和甲醇流向细胞生长/目标重组蛋白合成被显著增强。
除了维持代谢系数外，细胞死亡率是P.pastoris表达外源蛋白的另一个重要指标。当使用基于指数和DO-stat相结合控制策略(实施例)时，可以有效地避免细胞内严重的甲醇积累和DO的连续振荡。因此，在甲醇诱导阶段结束时，使用实施例所述的策略时，细胞死亡率仅维持在12.92％，而使用对比例1和对比例2所述策略时，细胞死亡率分别为27.84％和17.88％(图12)。
不同甲醇诱导策略下的细胞甲醇代谢相关酶活性及胞内甲醇积累情况重组毕赤酵母的甲醇代谢途径主要包括醇氧化酶(AOX)、甲醛脱氢酶(FLD)和甲酸脱氢酶(FDH)这三个关键酶。众所周知，AOX是甲醇代谢的第一个关键酶(CH3OH+O2→HCHO+H2O2)和目标蛋白合成启动子，其活性与甲醇消耗率、P.pastoris细胞代谢活性、HSA-GCSFm浓度直接相关。如图13所示，当采用实施例所述的策略时，AOX活性处于三种不同诱导策略中达到最高水平。在此条件下，AOX可以完全消耗流加的甲醇。相反，当使用对比例1所述的策略时，胞外甲醇浓度被控制在充足水平(图1)，因为AOX活性最低且氧气受限甲醇所催化的甲醇氧化反应不能有效地进行，胞外甲醇会迅速扩散到细胞内并逐渐积累在胞内积累(0.016-DCW/L，图2)。另一方面，FLD和FDH用于甲醇异化途径中的NADH和ATP的再生，作为外源蛋白表达的能量来源。当FLD和FDH的活性处于较高水平时，甲醇代谢的有毒中间物(甲醇、甲醛等)可以被充分氧化为CO2。如图14和15所示，当采用实施例所述的策略时，FLD和FDH活性处于三种不同诱导策略的最高水平且整个甲醇诱导阶段的胞内甲醇和甲醛的积累被有效抑制。
综上，本发明在很大程度上提高甲醇/流加速度和抑制胞内甲醇/甲醛积累，强化了HSA-GCSFm的表达。相较于传统的DO-stat控制策略，本发明的控制策略可以：1)将甲醇浓度控制在低水平(0-1g/L)，从而有效地将中间有毒代谢物(如甲醇和甲醛)的严重积累维持在几乎为零的水平；2)甲醇诱导强度可通过保持高水平的甲醇消耗率(0.0324vs 0.0237-0.0281 1/h)来验证；3)在3种诱导策略中，P.pastoris细胞维持代谢系数处于最低水平(0.0126vs 0.0195 1/h)，P.pastoris细胞活力明显提高(87.08％vs 72.16～82.12％)；4)最高的HSA-GCSFm浓度为0.44g/L，比对比例1和对比例2诱导策略的最高浓度提高了46％～238％。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括当Mut+型重组毕赤酵母进入甲醇流加诱导阶段时，采用在线指数和DO-stat相结合策略进行甲醇流加控制，以将DO的震荡宽度范围控制在10-30％，甲醇浓度控制在0-2g/L。
2.根据权利要求1所述基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述在线指数和DO-stat相结合策略是通过基于溶解氧电极在线监测溶解氧浓度进行调控甲醇流加速度的调控方法得到的。
3.根据权利要求2所述基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述调控方法是当细胞浓度达到预期目标且甘油完全耗尽时，开始进入甲醇流加阶段，利用DO电极在线测量DO浓度，预设DO浓度的设定值为20％，当测定浓度高于DO浓度的设定值时，停止甲醇流加；当测定浓度低于DO浓度的设定值时，启动甲醇流加。
4.根据权利要求1-3任一项所述基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述甲醇的流加速度采用如下计算公式得到：
Figure FDA0003345612350000011
其中，FMeOH是甲醇流加速度；DO是发酵液中溶解氧的实际浓度；DOset＝20％，DOset是发酵液中溶解氧的设定浓度；KC＝0.06，KC是比例参数；YX/S＝0.37，YX/S是细胞对甲醇的得率；μset＝0.03l/h，μset是细胞比生长速度的设定值；Xt0＝80.0g/L，Xt0是甲醇流加开始时的细胞浓度；t0是甲醇流加的开始时间；tf是甲醇流加的结束时间。
5.根据权利要求4所述基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述溶解氧浓度的控制方法为利用工控机和其内置的AD-DA数据接口/转化卡，驱动程序可调式蠕动泵，以所述计算公式在发酵液中流加甲醇。
6.根据权利要求1所述基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述方法为将携带HSA-GCSFm融合蛋白的Mut+型重组毕赤酵母接种到含有甘油初始培养基的发酵罐中，通过调整搅拌转速将DO控制在20％以上，保持温度30℃，pH＝6.0；当初始培养基中甘油被耗尽且DO急剧上升，采用DO-stat控制策略用于甘油流加阶段的甘油流加，同时，控制发酵液pH为6.0，当细胞浓度达到～80g-DCW/L且残留的甘油完全耗尽后，开始流加甲醇进入甲醇诱导阶段，在整个甲醇诱导阶段，空气和纯氧按需求用于曝气，温度和pH控制不变。
7.根据权利要求6所述基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述Mut+型重组毕赤酵母在初始发酵培养基中的接种量为初始发酵培养基总体积的15-25％。
8.根据权利要求6所述基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，在发酵开始时，通气速度为3-5vvm。
9.根据权利要求6所述基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，在整个发酵阶段，通过氨水和磷酸控制发酵液pH为6.0。
CN202111321044.0A 2021-11-09 2021-11-09 一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法 Pending CN114045320A (zh)

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Title
LUQIANG JIA ET AL.: "Enhancing HSA-GCSFm fusion protein production by Pichia pastoris with an on-line model-based exponential and DO-stat control modes", BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL, vol. 177, pages 1 - 9 *

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