CN116376792A - 酪氨酸生产菌株的定向改造方法及生产菌株与酪氨酸发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酪氨酸生产菌株的定向改造方法及生产菌株与酪氨酸发酵方法，在出发菌株E.coli TR03基础上对aroD、aroA、aroB、aroK基因的表达强度进行调整，通过莽草酸途径改造得到的酪氨酸生产菌株具有产酸速率高，发酵周期短的优点，应用该酪氨酸生产菌株高压发酵方法进行高压发酵，可有效提升酪氨酸生产强度，在生产中可以大幅降低水电用量，大量节约单次发酵的水电成本与人工成本，能够有效的提高酪氨酸的合成速率，使得生产菌能够在叫较短时间内达到其最大产物浓度，增加发酵批次，提高生产效率与利润。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是一种酪氨酸生产菌株的定向改造方法及生产菌株与酪氨酸发酵方法。
背景技术
酪氨酸(L-tyrosine，L-tyr)与苯丙氨酸、色氨酸同属芳香族氨基酸，是人体的条件必需氨基酸，在食品、饲料、医药、化工等行业具有重要应用。以往研究曾尝试过通过合理的代谢调控与分子生物学手段实现利用微生物积累酪氨酸的研究，且颇具成效。同时，crispr/cas9技术的问世，为代谢工程行业带来了诸多便利，但现有研究多为针对前体物质积累、关键酶的强化与解除反馈抑制等手段，针对莽草酸途径优化的报道相对较少，莽草酸途径较长，涉及到众多基因，同时是芳香族氨基酸的必须代谢途径，代谢改造的目的始终围绕着如何将葡萄糖更高效的引入到产物的合成途径中，因此对其进行针对性的优化具有实际意义。
目前酪氨酸发酵中较大的问题是由于酪氨酸拥有较低的溶解度(37℃、搅拌状态下＜2g/L)，且酪氨酸发酵对溶氧要求较高，需要通入大量的无菌空气，同时需要对设备转速的要求较高。在高速的搅拌、较大的气泡与大量的晶体的同时作用下，使得发酵过程中出现大量的泡沫，造成大量的发酵液溢液，大量活性菌体因此浪费无法继续产酸，降低了酪氨酸的生产效率，同时增加了染菌几率。通常来讲，操作人员会选择添加大量的消泡剂来抑制泡沫的产生，一方面会增加成本，另一方面过量的消泡剂容易对菌体造成毒副作用，因此如何做到安全有效的抑制酪氨酸发酵过程中的泡沫问题具有重要的实际意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种酪氨酸生产菌株的定向改造方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述定向改造方法获得的酪氨酸生产菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供应用上述酪氨酸生产菌株提升酪氨酸生产强度的高压发酵方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种酪氨酸生产菌株的定向改造方法，利用代谢工程改造方法针对莽草酸途径基因表达强度进行优化，在出发菌株E.coli TR03基础上对aroD、aroA、aroB、aroK基因的表达强度进行调整，其中：
在mbha假基因位点使用Pbba-j23106启动子控制aroD基因过表达，得到菌株TPO4；
再以菌株TP04为出发菌株，在rph假基因位点使用Pbba-j23105启动子控制aroA基因过表达，得到菌株TP05；
最后以菌株TP05为出发菌株，在yciQ假基因位点使用ParoK启动子控制aroK与aroB基因串联表达，得到菌株TP06，即为改造成功后的目的菌。
优选的，上述酪氨酸生产菌株的定向改造方法，其中：
Pbba-j23106启动子具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
Pbba-j23105启动子具有序列表SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
ParoK启动子具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
aroD基因具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
aroA基因具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
aroB+K基因具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。
优选的，上述酪氨酸生产菌株的定向改造方法，所述代谢工程改造方法为CRISPR-Cas9基因编辑技术。
一种酪氨酸生产菌株，由上述定向改造方法制备得到，即为菌株TP06。
一种应用上述酪氨酸生产菌株提升酪氨酸生产强度的高压发酵方法，具体步骤如下：
(1)种子培养：使用5L机械搅拌式发酵罐，培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为45％，当OD600nm为15时达到接种要求；
(2)高压发酵方法：使用5L机械搅拌式发酵罐，接种量为20％，培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为50％，通过调整尾气阀或通风量维持罐压，其中发酵前期维持在0.04Mpa，酪氨酸浓度≥25g/L后(需在罐内酪氨酸浓度≥25g/L时提高罐压)调整罐压至≥0.15Mpa，并维持到发酵结束；通过流加80％葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.3g/L，发酵周期≤32h。
优选的，上述高压发酵方法，发酵罐压力应≥0.15Mpa，具体应根据发酵设备极限压力设定发酵压力，优选的发酵罐压为0.16Mpa。
所述高压发酵是指调整发酵生产阶段(在酪氨酸结晶阶段)发酵罐压罐内压力，在较高水平的罐压下进行发酵，将罐压提升至0.15-0.2Mpa，并持续到发酵结束。发酵过程需在酪氨酸结晶泡沫无法抑制时提高罐压，通常在酪氨酸浓度≥25g/L时，由于酪氨酸较低的溶解度，在发酵前期同样会出现一定量的泡沫，但此时并不会造成发酵液溢液风险，随着发酵的进行，较多的葡萄糖溶液使得发酵体积增大，产量增多，此时溢液风险严重，因此需要提高罐压，操作人员也可根据实施发酵状态选择提高罐压时机，并根据发酵设备对极限压力的要求调整罐压强度。理论上来讲，罐压越高压制泡沫的能力越强，且优选利用通风量提高罐压力。
优选的，上述高压发酵方法，所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖25g/L，酵母3g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO4 1g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1.5g/L，MnSO4·H2O 5mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，生物素1mg/L，其余为水。
优选的，上述高压发酵方法，所述发酵培养中采用的发酵培养基为：葡萄糖15g/L，酵母粉3.5g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO4 1.5g/L，K2HPO4·3H2O1.5g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1g/L，谷氨酸2g/L，甲硫氨酸0.5g/L，磷酸吡哆醛10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，VB1 2mg/L，VB3 2mg/L，VB5 2mg/L，VB12 2mg/L，微量元素混合液2mL/L，其余为水。
优选的，上述高压发酵方法，所述微量元素混合液为：Na2MoO4·2H2O2.5g/L，AlCl3·6H2O 2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，
H3BO30.125g/L，其余为水。
有益效果：
上述酪氨酸生产菌株的定向改造方法，通过莽草酸途径改造得到的工程菌具有产酸速率高，发酵周期短的优点，在生产中可以大幅降低水电用量，大量节约单次发酵的水电成本与人工成本，能够有效的提高酪氨酸的合成速率，使得生产菌能够在叫较短时间内达到其最大产物浓度，增加发酵批次，提高生产效率与利润；采用的高压发酵方法能够很好的抑制发酵泡沫的产生，减少消泡剂的使用量，一方面能够节约生产成本，另一方面能够避免高浓度消泡剂对菌体造成的毒副作用，此外高罐压能够有效抑制泡沫的生成，减少发酵液溢液，提高生产强度，降低染菌几率，在一定程度上能够提高单次发酵的总产酸量。
附图说明
图1为莽草酸途径改造示意图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
实施例中所用的出发菌株E.coli TR03购自于天津科技大学代谢工程实验室，菌株信息记载于专利(CN111004761A)。
实施例中涉及的基因序列如下：
PJ23100启动子具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
Pbba-j23106启动子具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
Pbba-j23105启动子具有序列表SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。
ParoK启动子具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。
aroD基因具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
aroA基因具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列。
aroB+K基因具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。
实施例1
1.基因编辑的方法
采用的基因编辑方法参照文献(Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting.Metabolic Engineering，2015，31：13-21.)。该方法涉及的工程质粒pREDCas9、pGRB，其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统、λ噬菌体的Red重组系统、Cas9蛋白表达系统以及奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子PJ23100、gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列以及氨节青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)。下列实施例2-4中涉及到的专业名词均可在该文章中解释。
2.菌株构建过程中用到的引物见表1。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
实施例2
本实施例旨在说明在mbha假基因位点整合由Pbba-j23106启动子控制aroD基因步骤。
具体步骤如下：
①以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别以QCmbha-Up-s、QCmbha-Up-A、QCmbha-DN-S、QCmbha-DN-A与aroD-S、aroD-A为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂、与目的基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得Pbba-j23106-aroD(mbha)基因整合片段，所述基因整合片段由mbha上游同源臂、Pbba-j23106-aroD目的基因和mbha下游同源臂组成。
②以pGRB-mbha-S和pGRB-mbha-A为引物，通过PCR退火程序构建PGRB-mbha使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-mbha；
③将步骤②、③中得到的Pbba-j23106-aroD(mbha)基因整合片段与pGRB-mbha质粒电转进入E.coli TR03菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为TP04。
实施例3
本实施例旨在说明在rph假基因位点整合由Pbba-j23105启动子控制aroA基因步骤。
具体步骤如下：
①以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别以QCrph-Up-s、QCrph-Up-A、QCrph-DN-S、QCrph-DN-A与aroA-S、aroA-A为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂、与目的基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得Pbba-j23105-aroA(rph)基因整合片段，所述基因整合片段由rph上游同源臂、Pbba-j23105-aroA目的基因和rph下游同源臂组成。
②以pGRB-rph-S和pGRB-rph-A为引物，通过PCR退火程序构建PGRB-rph使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-rph。
③将步骤②、③中得到的Pbba-j23105-aroA(rph)基因整合片段与pGRB-rph质粒电转进入TR04菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为TP05。
实施例4
本实施例旨在说明在yciQ假基因位点整合由ParoK启动子控制aroK与aroB基因步骤。
具体步骤如下：
①以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别以QCyciQ-Up-s、QCyciQ-Up-A、QCyciQ-DN-S、QCyciQ-DN-A与aroK-S、aroB-A为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂、与目的基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得ParoK-aroK+B(yciQ)基因整合片段，所述基因整合片段由yciQ上游同源臂、ParoK-aroK+B目的基因和yciQ下游同源臂组成。
②以pGRB-yciQ-S和pGRB-yciQ-A为引物，通过PCR退火程序构建PGRB-yciQ使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-yciQ。
③将步骤②、③中得到的ParoK-aroK+B(yciQ)基因整合片段与pGRB-yciQ质粒电转进入TR05菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为TP06。
实施例5
以TP06为生产菌株，本实施例旨在说明权利要求6-9所述的发酵操作，该步骤同样适用于本发明提及的其他菌株发酵，仅需改变罐压条件即可，具体如下：
种子发酵培养：使用5L机械搅拌式发酵罐，培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为45％，当OD600nm为15时达到接种要求。
发酵培养：使用5L机械搅拌式发酵罐，接种量为20％，培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为50％，通过流加80％葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.3g/L，通过调整尾气阀或通风量维持罐压，其中发酵前期维持在0.04Mpa，酪氨酸浓度≥25g/L时维持在0.16Mpa，本发明公开了两组发酵数据，分别为菌株TP06在全程0.04Mpa罐压下的发酵结果(恒压发酵)与菌株TP06在发酵进行到酪氨酸浓度≥25g/L，提升罐压至0.16Mpa(高压发酵)，发酵周期均为32h，结果如实施例6表1所示。
优选的，所用种子发酵培养基：葡萄糖25g/L，酵母3g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1.5g/L，MnSO4·H2O5mg/L，FeSO4·7H2O10mg/L，生物素1mg/L。
优选的，所用发酵培养基：葡萄糖15g/L，酵母粉3.5g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1g/L，谷氨酸2g/L，甲硫氨酸0.5g/L，磷酸吡哆醛10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，VB1.3.5.12各2mg/L，微量元素混合液2mL/L。
其中，微量元素混合液成分为：Na2MoO4·2H2O2.5g/L，AlCl3·6H2O2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CuCl2·2H2O0.25g/L，H3BO30.125g/L，需提前配置使用。
实施例6
本实施例在于展示实施例5中所述的发酵结果，并将菌株TR06与专利(CN111004761A)中记载的菌株E.coli TR03生产能力(发酵可进行25h，酪氨酸产量41.2g/L，生产强度为1.64g/(L.h))做出对比展示。结果如表2所示。
表2高压发酵与恒压发酵结果对比
由表2可以看出，高压发酵使得溢液率下降了40.4％，总产量提高了7.7％，取得了积极有益的效果；罐内产物浓度达到了55.6g/L，较菌株E.coli TR03提高了34.9％，转化率达到了24.6％，生产强度达到了1.75g/(L.h)，较菌株E.coli TR03提高了6.3％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本发明菌株的构建步骤不分先后顺序，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种酪氨酸生产菌株的定向改造方法，其特征在于：在出发菌株E.coli TR03基础上对aroD、aroA、aroB、aroK基因的表达强度进行调整，其中：
在mbha假基因位点使用Pbba-j23106启动子控制aroD基因过表达；
再在rph假基因位点使用Pbba-j23105启动子控制aroA基因过表达；
最后在yciQ假基因位点使用ParoK启动子控制aroK与aroB基因串联表达，即为改造成功后的目的菌。
2.根据权利要求1所述的酪氨酸生产菌株的定向改造方法，其特征在于：Pbba-j23106启动子具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
Pbba-j23105启动子具有序列表SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
ParoK启动子具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
aroD基因具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
aroA基因具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
aroB+K基因具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的酪氨酸生产菌株的定向改造方法，其特征在于：所述代谢工程改造方法为CRISPR-Cas9基因编辑技术。
4.一种酪氨酸生产菌株，由权利要求1所述定向改造方法制备得到。
5.一种应用权利要求4所述酪氨酸生产菌株提升酪氨酸生产强度的高压发酵方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)种子培养：使用机械搅拌式发酵罐，培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为45％，当OD600nm为15时达到接种要求；
(2)高压发酵方法：使用机械搅拌式发酵罐，接种量为20％，培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为50％，通过调整尾气阀或通风量维持罐压，其中发酵前期维持在0.04Mpa，酪氨酸浓度≥25g/L后调整罐压至≥
0.15Mpa，并维持到发酵结束；通过流加80％葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.3g/L，发酵周期≤32h。
6.根据权利要求5所述的高压发酵方法，其特征在于：发酵罐压为0.16Mpa。
7.根据权利要求5所述的高压发酵方法，其特征在于：所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖25g/L，酵母3g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4·7H2O2g/L，柠檬酸1.5g/L，MnSO4·H2O 5mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，生物素1mg/L，其余为水。
8.根据权利要求5所述的高压发酵方法，其特征在于：所述发酵培养中采用的发酵培养基为：葡萄糖15g/L，酵母粉3.5g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1g/L，谷氨酸2g/L，甲硫氨酸0.5g/L，磷酸吡哆醛10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，VB1 2mg/L，VB 3 2mg/L，VB 5 2mg/L，VB 12 2mg/L，微量元素混合液2mL/L，其余为水。
9.根据权利要求8所述的高压发酵方法，其特征在于：所述微量元素混合液为：Na2MoO4·2H2O 2.5g/L，AlCl3·6H2O 2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，H3BO30.125g/L，其余为水。
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