KR101483790B1 - 혐기성 미생물의 연속 배양 방법 및 배양 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혐기성 미생물을 연속 배양하여 특정한 생산물을 제조하는 방법에 있어서, (1) 배양물의 하부층으로 상기 생산물의 생산에 이용되는 기질을 공급하는 단계; (2) 혐기성 미생물이 배양물의 하부층에 위치하도록 유지하면서 혐기성 미생물이 기질을 이용하여 생산물을 생산하도록 하는 단계; (3) 배양물의 상부층으로부터 생산물을 회수하는 단계를 포함한 혐기성 미생물의 연속 배양 방법에 관한 것이다. 또한, 제어부; 배양조; 기질을 저장하는 기질 챔버; 기질 챔버로부터 배양조에 기질을 공급하기 위한 기질 공급 펌프 또는 밸브; 기질 챔버로부터 배양조의 하단까지 이어지는 기질 공급관; 생산물을 저장하는 생산물 챔버; 배양조로부터 생산물 챔버로 생산물을 회수하기 위한 생산물 회수 펌프 또는 밸브; 배양조의 상단으로부터 생산물 챔버까지 이어지는 생산물 회수관; 교반기를 포함하는 혐기성 미생물의 연속 배양 장치에 관한 것이다.
혐기성 미생물, 연속 배양, 에탄올, 부탄올

Description

혐기성 미생물의 연속 배양 방법 및 배양 장치 {Anaerobic Continuous Culture Method of Organism and Apparatus Therefor}
본 발명은 혐기성 미생물의 연속 배양 방법 및 배양 장치에 관한 것으로, 보다 자세하게는 혐기성 미생물을 연속 배양하여 특정한 생산물을 제조하는 방법에 있어서, (1) 배양물의 하부층으로 상기 생산물의 생산에 이용되는 기질을 공급하는 단계; (2) 혐기성 미생물이 배양물의 하부층에 위치하도록 유지하면서 혐기성 미생물이 기질을 이용하여 생산물을 생산하도록 하는 단계; (3) 배양물의 상부층으로부터 생산물을 회수하는 단계를 포함한 혐기성 미생물의 연속 배양 방법 및 이를 위한 배양장치에 관한 것이다.
발효 또는 세포 배양에서 일반적으로 이용되는 배양 방식에는 회분식 배양법 (batch culture)과 연속식 배양법 (continuous culture)이 있다.
회분식 배양법은 배양이 완전히 종료된 후 다시 배지를 교체하는 방식이다. 즉, 초기에 한번 배지를 채운 후 배양이 완료될 때까지 더 이상 영양소를 공급하거나 제거하지 않는 배양 방법을 의미한다. 회분식 배양에서는 배양 개시 후 일정한 시간이 경과하면 세포가 성장을 멈추고 그 후 기질이 더 이상 소비되지 않음과 동 시에 생산물도 만들어지지 않는다.
연속식 배양은 하나 이상의 영양소를 발효 개시 직후 또는 배양물이 어떤 단계에 도달한 후에 또는 공급된 영양소가 배양물로부터 고갈되는 경우, 미생물에 연속적으로 공급하고 배양물을 연속적으로 회수하는 방식의 배양을 의미한다. 연속식 배양에서는 필수 영양소를 이용하여 바람직한 성장 조건을 유지하도록 일반적으로 기준을 정하고, 균체의 증식속도와 희석속도와 같은 조건에서 필수 영양소를 배양물에 공급하여 균체의 성장과 생산물의 생산속도를 조절한다.
일반적으로 회분식은 배양조와 배지의 멸균, 균체의 증식, 생산물의 생산 및 배양 후 배양조의 세척 등 4-5 단계를 거치기 때문에 각각의 배양에 적어도 20시간 이상의 배양시간이 소요된다. 반면에 연속식 배양은 일단 배양이 개시되면 7일 내지 1달 동안 배양이 지속될 수 있기 때문에 단위 배양조당 생산성이 4배 내지 20배에 이르는 체적 생산성을 얻을 수 있다. 또한 회분식 배양과 달리 일시적으로 많은 노동력을 요구하지 않으며, 배양 조작이 간단하여 자동화의 가능성이 높고, 오염의 문제에 있어서도 회분식 배양보다 유리한 장점이 있다.
이러한 장점에도 불구하고 현재 개발되어 있는 연속식 배양법은 연속적으로 고농도의 균체가 생산되어 소비된 영양소 대비 생산물의 생산수율이 떨어진다는 문제점이 있고, 또한 균체의 최대 증식속도 보다 높은 희석속도에서는 연속식 배양이 불가능하기 때문에 균체의 최대 증식속도 보다 높은 체적 생산속도를 얻을 수 없다는 한계가 있다.
특히, 효모와 같은 편성 혐기성 미생물을 발효시켜 에탄올, 부탄올, 젖산과 같이 사람에게 유용한 생산물을 대량으로 생산하고자 할 경우에 또는 균체 증식속도가 낮은 미생물을 대량으로 배양하여 이용하고자 할 경우에 체적 생산성을 개선하는 것이 필요하다. 이러한 필요에 따라 당업계에는 다음과 같은 기술들이 개발되어 있다.
대한민국등록특허 제10-0349950호에는 자화성 효모인 피키아 스티피티스 (Pichia stipitis)를 이용하여 자일로스로부터 에탄올을 연속적으로 생산하는 방법에 있어서, 연속배양조건이 초기 자일로스농도 1~10w/v%, 공급 기질의 자일로스 농도 10g/ℓ, 통기량 0.1~0.2vvm, 교반속도 200rpm 및 희석속도 0.08h-1인 것을 특징으로 하는 에탄올을 연속적으로 생산하는 방법을 개시하고 있다.
대한민국공개특허 제2007-0108024호는 호화챔버 및 액화챔버를 포함하며 호화챔버 및 액화챔버가 단일의 탱크로 구비되는 전처리 유닛, 전처리 유닛 소정 부위에 구비되며 호화챔버에서 배출된 매시를 가열하여 액화챔버로 이송하는 제트쿠커; 액화챔버 하단에 연결되며 액화챔버에서 배출된 매시 일부에 효모 또는 자이모모나스를 주입하여 주모로서 배양하는 배양유닛; 액화챔버에서 배출되는 매시 및 배양유닛에서 배양된 일정량의 주모를 수용하는 예비발효조; 및 예비발효조 일단에 연결되어 예비발효조에서 배출된 매시를 적정농도를 발효시키는 주발효유닛을 포함하는 에탄올 제조장치를 개시하고 있다.
대한민국등록특허 제10-0644854호는 고형물 체류 시간이 50일 이상 유지되는 상향류식 반응기 및 상기 반응기로부터의 유출수의 일부 또는 전부가 유입되고, 양전하를 띠는 부직포가 충전되며, 배출되는 유출수가 다시 상기 반응기로 유입되는 혐기성 암모늄 산화균 유실 방지 배양조를 포함하는 혐기성 암모늄 산화균의 연속 배양 장치 및 이를 이용한 연속 배양 방법을 개시하고 있다.
본 발명자들은 혐기성 미생물을 연속 배양하여 특정한 생산물을 제조하는 방법에 있어서, 혐기성 미생물을 배양물의 하부층에 위치시키고 기질을 배양물의 하부층으로 투입함으로써 혐기성 미생물이 상기 기질을 미생물의 증식 보다는 생산물을 생산하는데 이용함에 따라 혐기성 미생물의 비증식속도 보다 더 높은 희석속도에서 생산물을 효율적으로 생산할 수 있다는 것을 확인하고, 이러한 배양 방법 및 장치를 제공하고자 한다.
본 발명은 혐기성 미생물을 연속 배양하여 특정한 생산물을 제조하는 방법에 있어서, (1) 배양물의 하부층으로 상기 생산물의 생산에 이용되는 기질을 공급하는 단계; (2) 혐기성 미생물이 배양물의 하부층에 위치하도록 유지하면서 혐기성 미생물이 기질을 이용하여 생산물을 생산하도록 하는 단계; (3) 배양물의 상부층으로부터 생산물을 회수하는 단계를 포함한 혐기성 미생물의 연속 배양 방법에 관한 것이다.
일반적인 미생물의 배양 방법에서는 미생물이 배양물 전체에 균일하게 위치하도록 하는데 반하여 본 발명에 따른 혐기성 미생물의 연속 배양 방법은 미생물이 배양물의 하부층에 위치하도록 유지하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 '미생물이 배양물의 하부층에 위치한다는 것'은 미생물이 배양물의 하부층에 국한하여 위치한다는 것이 아니라 상대적으로 무거워 아래로 가라앉는 혐기성 미생물과 그와 는 달리 생산물은 배양물 내에 균일하게 혼합되거나 상대적으로 가벼워 배양물의 상부로 떠오르게 되어 분리되는 것을 의미한다.
본 발명에서 미생물이 배양물의 하부층에 위치하도록 하는 방법에는 미생물의 응집을 촉진시키는 유전자, 예를 들면 FLO1, FLO1S 등의 유전자를 미생물에 도입하거나 (Liu, N. et al. FEMS Yeast Res. 2007, vol.7, pp.1362-137) 미생물을 응집시키는 물질, 예를 들면 알루민산나트륨, 황산제1철, 염화제2철, 황산알루미늄, 알루민산소다와 같은 무기계 응집제 또는 예를 들면 폴리알루미늄 클로라이드 (Polyaluminum Chloride), 폴리알루미늄 하이드록시디클로라이드 실리케이트 (Polyaluminum Hydroxidechloride Silicate), 폴리염화알루미늄, 폴리알루미늄실리케이트설페이트 (Polyaluminum Silicate Sulfate; PASS), 폴리아크릴아미드 (Poly acryl amide)와 같은 무기계 고분자 응집제 또는 미생물이 생산하는 다당류 또는 키토산계 폴리머와 같은 생물 고분자를 미생물과 함께 배양하는 방법이 있다. 또한, 배양조 내에서 교반에 의한 혼합효과를 제시하는 다음 수학식 1을 활용하여 혼합시간이 20초 이상이 되도록 교반속도를 설정하는 방법이 있다 (C. J. Hoogendoorn et al. Chem. Eng. Sci. 1967. vol.22, pp.1689-1699).
tm = 1.54V/ND3
상기 식에서 tm은 혼합시간(초), V는 배양조의 배양물 체적(톤), D는 배양조내에 설치된 교반기의 지름(미터), N은 배양조의 교반속도(초-1) 을 의미한다.
전술된 방법과 함께 배양조내 통기를 배제함으로써 본 발명에서는 미생물이 배양물의 하부층에 위치하도록 할 수 있다.
본 발명에 의해 배양되는 '혐기성 미생물'은 산소를 필요로 하지 않는 산소 비요구성 미생물을 통칭하고, 일반적으로 통성 혐기성 미생물, 산소내성 혐기성 미생물 및 편성 혐기성 미생물로 구분한다. 통성 혐기성 미생물은 산소의 유무와 관계없이 증식할 수 있는 미생물이고, 산소내성 혐기성 미생물은 산소가 있어도 살 수 있지만 산소를 이용하지 않는 미생물이며, 편성 혐기성 미생물은 유리 산소가 존재하면 생장하지 못하므로 반드시 산소가 없는 곳에서만 생활할 수 있는 미생물이다. 본 발명의 배양 방법은 전술된 혐기성 미생물에 모두 적용 가능하지만, 본 발명에서는 배양조내 통기를 배제하므로 편성 혐기성 미생물을 배양하는데 특히 유용하다.
본 발명에 따라 배양될 수 있는 혐기성 미생물은 사람에게 유용한 생산물, 예를 들면 에탄올, 부탄올, 젖산, 프로판올, 수소 가스, 숙신산, 아세톤, 부티릭산, 초산, 프로피온산, 부탄디올, 프로판디올과 같은 생산물을 생산할 수 있는 혐기성 미생물이라면 어떠한 것이든지 무방하며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카로마이세스를 포함하는 효모류, 아스퍼질러스를 포함하는 곰팡이류 그리고 바실러스 사카로부티리쿰 (Bacillus saccharobutylicum) 클로스트리디움 (Clostridium), 클레브시엘라 (Klebsiella), 에어로모나스 (Aeromonas), 세라티아 (Serratia), 데설포비브리오 알칼리오게네스 (Desulfovibrio Alcaliogenes), 노카르디아 (Nocardia), 메탄자화 균류(Methanogenic bacteria) 등 모든 혐기 및 편성혐기 미생물이다.
본 발명에 따라 단계 (1)에서는 배양물의 하부층으로 특정한 생산물의 생산에 이용되는 기질을 공급한다. 앞서 주지된 바와 같이 본 발명은 혐기성 미생물이 배양물의 하부층에 위치하도록 유지하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 단계 (1)에서는 배양물 중 혐기성 미생물이 위치하는 부분으로 특정한 생산물의 생산에 이용되는 기질을 공급하는 것이다. 여기서, 기질의 공급속도는 기질로부터 생산물이 생산되는 속도와 같거나 기질로부터 생산물이 생산되는 속도 보다 느리게 설정하는 것이 바람직하다.
단계 (2)에서는 혐기성 미생물이 배양물의 하부층에 위치하도록 유지하면서 혐기성 미생물이 기질을 이용하여 생산물을 생산하도록 한다. 배양물의 하부층에 위치하는 혐기성 미생물은 역시 배양물의 하부층으로 공급된 기질을 이용하여 생산물을 생산한다. 본 발명에 따라 혐기성 미생물은 배양물의 하부층에 집중적으로 증식하여 위치하기 때문에 기질이 공급되더라도 상기 기질을 혐기성 미생물의 증식에 이용하기 보다는 생산물을 생산하는데 이용하게 된다. 따라서, 기질이 효율적으로 생산물로 생산될 수 있다.
단계 (3)에서는 배양물의 상부층으로부터 생산물을 회수한다. 전술된 단계 (2)에 의해 기질을 배양물의 하부층으로 투입함에 따라 기질의 농도가 상부층으로 갈수록 점진적으로 낮아진다. 따라서, 혐기성 미생물이 기질을 이용하여 만든 생산물은 배양물의 상부층으로 이동하게 된다. 반면에 앞서 주지된 바와 같이 혐기성 미생물과 기질은 배양물의 하부층에 위치한다. 따라서, 배양물의 상부층으로부터 생산물만을 용이하게 회수할 수 있으며, 혐기성 미생물 및 기질이 배양조 밖으로 유출되는 것을 감소시킬 수 있다. 여기서, 생산물의 회수속도는 기질의 공급속도와 같거나 기질의 공급속도 보다 빠르게 설정하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명에 따라 혐기성 미생물을 연속 배양하여 생산물을 생산할 경우에 균체의 역학은 다음 수학식 2와 같이 나타낼 수 있다.
균체의 공급속도 + 균체 성장 - 균체 회수 = 균체량 변화
여기서, 본 발명에 의하면 균체량 변화가 없으므로 균체 역학은 다음 수학식 3과 같이 나타낼 수 있다.
Figure 112007084391118-pat00001
Figure 112007084391118-pat00002
, 이므로
Figure 112007084391118-pat00003
X0 = 0 이므로
Figure 112007084391118-pat00004
, 여기서 D =
Figure 112007084391118-pat00005
라 하면
Figure 112007084391118-pat00006
이고
Figure 112007084391118-pat00007
가 된다. 여기서
Figure 112007084391118-pat00008
이다.
(상기 식에서 μ는 미생물의 비증식속도, F는 기질의 공급속도, V는 배양액의 체적, D는 희석속도, X0는 배양조로 공급되는 균체의 농도, X1 은 배양조에 체류하는 균체의 농도, X2는 배양조로부터 회수되는 균체의 농도를 의미한다)
수학식 3에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따라 배양할 경우에 미생물의 비증식속도는 배양조에 체류하는 균체농도 대비 배양조로부터 회수되는 균체농도비에 대한 희석속도로 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 혐기성 미생물을 연속 배양하여 생산물을 생산할 경우에 기질, 생산물 및 균체간의 관계 역학은 다음 수학식 4와 같이 나타낼 수 있다.
기질의 공급속도 - 균체 성장 - 균체의 기초대사 - 생산물 - 기질 회수량 = 기질 변화량
여기서, 본 발명에 의하면 기질 변화가 없으므로 기질, 생산물 및 균체간의 관계 역학은 다음 수학식 5와 같이 나타낼 수 있다.
Figure 112007084391118-pat00009
Figure 112007084391118-pat00010
, 이므로
Figure 112007084391118-pat00011
, 여기서 D =
Figure 112007084391118-pat00012
이고
Figure 112007084391118-pat00013
=
Figure 112007084391118-pat00014
이므로
Figure 112007084391118-pat00015
Figure 112007084391118-pat00016
Figure 112007084391118-pat00017
Figure 112007084391118-pat00018
이고,
Figure 112007084391118-pat00019
는 기질의 소비속도 qs 이므로
Figure 112007084391118-pat00020
가 된다.
여기서
Figure 112007084391118-pat00021
이므로
Figure 112007084391118-pat00022
가 된다.
(상기 식에서 S0는 배양조로 공급되는 기질의 농도, S는 배양조에 존재하는 기질의 농도, Yx는 단위 기질당 생산되는 균체의 중량, m은 균체의 기초 대사에 필요한 기질의 양, Yp는 단위 기질당 생산되는 생산물의 양, qs는 단위 균체당 시간당 소비하는 기질의 양, qp는 단위 균체당 시간당 생산되는 생산물의 양을 의미한다)
상기 수학식 5에 나타낸 바와 같이 본 발명에 의하여 배양할 경우에 공급된 기질의 대부분이 생산물의 생산에 이용되고 미생물의 성장에는 거의 이용되지 않는다.
전술된 수학식 2 내지 5에 나타낸 바에 따르면 본 발명에 따른 혐기성 미생물의 연속 배양 방법은 희석속도가 미생물의 최대 비증식속도와 같거나 미생물의 최대 비증식속도 보다 빠르게 설정된 상태에서 진행할 수 있다.
본 발명에 따른 혐기성 미생물의 연속 배양 방법은 하기 구성요소로 이루어진 배양 장치를 이용하여 구현할 수 있다.
본 발명은 제어부; 배양조; 기질을 저장하는 기질 챔버; 기질 챔버로부터 배양조에 기질을 공급하기 위한 기질 공급 펌프 또는 밸브; 기질 챔버로부터 배양조의 하단까지 이어지는 기질 공급관; 생산물을 저장하는 생산물 챔버; 배양조로부터 생산물 챔버로 생산물을 회수하기 위한 생산물 회수 펌프 또는 밸브; 배양조의 상단으로부터 생산물 챔버까지 이어지는 생산물 회수관; 교반기를 포함하는 혐기성 미생물의 연속 배양 장치에 관한 것이다.
여기서, 기질 공급관은 한 단부는 기질 챔버에 연결되고 다른 단부는 배양조의 하단에 연결되는 형태이거나, 한 단부는 기질 챔버에 연결되고 다른 단부는 배양물의 하부층 (즉, 혐기성 미생물이 위치하는 부분)에 침지되는 형태로 배양조의 하단까지 연결된 형태일 수 있다. 마찬가지로 생산물 회수관은 한 단부는 배양조의 상단에 연결되고 다른 단부는 생산물 챔버에 연결되는 형태이거나, 한 단부는 배양물의 상부층 (즉, 생산물이 위치하는 부분)에 침지되는 형태로 배양조의 상단까지 연결되고 다른 단부는 생산물 챔버에 연결되는 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 연속 배양 장치는 기질, 혐기성 미생물 및 생산물의 농도를 검출할 수 있는 장치를 추가로 구비하는 것이 바람직하다.
한 양태로서, 본 발명의 배양 장치 (100)는 데이터 신호 및 제어 신호 송수신 등 전체적인 동작을 제어하는 제어부 (110); 모니터 버튼과 같은 입출력 장치 (도시하지 않음); 배양이 이루어지는 배양조 (120); 기질을 저장하는 기질 챔버 (132); 기질 챔버로부터 배양조에 기질을 공급하기 위한 기질 공급 펌프 (134); 기질 챔버로부터 배양조의 하단까지 이어지는 기질 공급관 (136); 생산물을 저장하는 생산물 챔버 (142); 배양조로부터 생산물 챔버로 생산물을 회수하기 위한 생산물 회수 펌프 (144); 배양조의 상단으로부터 생산물 챔버까지 이어지는 생산물 회수관 (146); 배양조내에 위치하는 교반기 (150)를 포함하여 이루어진다.
이러한 양태에서, 배양하기 전에 입력 장치를 통하여 혐기성 미생물을 배양물의 하부층에 위치하도록 교반속도를 조정 및 입력하고, 기질의 공급속도와 생산물의 회수속도 등을 입력한다. 이와 같이 입력된 값들은 배양을 진행하면서 재조정할 수 있다.
제어부 (110)는 앞서 입력된 교반속도에 따라 배양물을 교반한다. 이를 위하여 교반기 (150)에 상기 교반속도에 상응하는 작동 신호를 전송한다. 교반기 (150)는 제어부 (110)로부터 전송받은 신호에 따라 작동하여 배양조 (120) 내에서 배양물을 교반한다.
또한, 제어부 (110)는 앞서 입력된 기질의 공급속도에 따라 기질을 공급한다. 이를 위하여 기질 공급 펌프 (134)에 상기 기질의 공급속도에 상응하는 작동 신호를 전송한다. 기질 공급 펌프 (134)는 제어부 (110)로부터 전송받은 신호에 따라 작동하여 기질 챔버 (132)에 저장되어 있던 기질을 기질 공급관 (136)을 통하여 배양조 (120)로 공급한다. 여기서, 기질 공급관 (136)은 한 단부는 기질 챔버 (132)에 연결되고, 다른 단부는 배양물의 하부층에 침지된 형태이므로 기질은 배양 물의 하부층으로 공급될 수 있다.
또한, 제어부 (110)는 앞서 입력된 생산물의 회수속도에 따라 생산물을 회수한다. 이를 위하여 생산물 회수 펌프 (144)에 상기 생산물의 회수속도에 상응하는 작동 신호를 전송한다. 생산물 회수 펌프 (144)는 제어부 (110)로부터 전송받은 신호에 따라 작동하여 배양조 (120)의 상단에 위치하는 생산물을 생산물 챔버 (142)로 회수한다. 여기서, 생산물 이동관 (146)은 한 단부는 배양물의 상부층에 침지된 형태이고, 다른 단부는 생산물 챔버에 연결되어 있으므로 생산물은 배양물의 상부층으로부터 회수될 수 있다.
본 발명에 따라 혐기성 미생물을 연속 배양하여 특정한 생산물을 제조하는 방법에 있어서, 혐기성 미생물을 배양물의 하부층에 위치시키고 기질을 배양물의 하부층으로 투입함에 따라 혐기성 미생물이 상기 기질을 미생물의 증식 보다는 생산물을 생산하는데 이용함에 따라 특정한 생산물을 효율적으로 생산할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
A. 전 배양
500㎖의 플라스크에 각각 50㎖의 전 배양 배지 [22% 함수포도당 (삼양 제넥스) 1.0% 효모 엑기스 (Difco), 0.05% 제일인산칼륨 (제일화학), 0.01% 황산마그네슘 (제일화학), 0.1% 황산암모늄 (제일화학), pH 5.0]를 분주한 후 121℃에서 20분간 가압 살균하였다. 배지를 냉각한 후에 에탄올 생산 효모균(KBM-4502)을 각각 일백금니씩 접종하여 30℃에서 16시간 동안 분당 180회 왕복 진탕 배양하였다.
B. 연속 배양
1L의 배양 배지 [22% 함수포도당 (삼양 제넥스), 1.0 % 효모 엑기스(Difco), 0.05% 제일인산칼륨 (제일화학), 0.01% 황산마그네슘 (제일화학), 0.1% 황산암모늄 (제일화학), pH 5.0]를 2.5ℓ의 발효조에 넣고, 121℃에서 20분간 가압 살균하였다. 배지를 냉각한 후에 상기 종배양액을 5% 접종하고, 40 내지 500rpm의 교반속도와 1.0 내지 1.5VVM의 통기 조건으로 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양개시 12시간 이후부터 연속 배양 배지 [22% 포도당 (삼양 제넥스), 0.2 % 효모 엑기스 (Difco), 0.01% 황산마그네슘 (제일화학), 0.1% 황산암모늄 (제일화학), pH 5.0]를 페리스탈틱 펌프를 이용하여 희석속도 0.05, 0.1, 0.15 또는 0.2 1/h 가 되도록 연속적으로 첨가시켜주면서 연속배양을 수행하였다. 이때 교반속도는 400rpm 이하에서 통기를 시켜주지 않는 혐기적 발효조건에서 대부분의 효모균이 발효조 하부층에 침전된 상태에서 연속배양을 수행하였다 (도 2 참조).
또한, 연속 배양시에 원하는 배양액의 체적을 유지시켜주기 위하여 배지의 공급속도보다 빠른 속도로 배양액의 상부표면으로부터 페리스탈틱 펌프를 이용하여 연속적으로 배양액을 회수하였다.
연속배양을 통하여 소비된 포도당과 생산된 에탄올은 미국 바이오래드사의 Aminex-87H 컬럼과 RI 검출기가 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였고 배양액 중에 존재하는 균체량은 600nm의 흡광도를 이용하여 측정하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이 본 실시예에서 설정한 배양 조건에 의하여 배양물의 하부층에 효모균체의 대부분이 존재하는데 반하여 배양물의 상부층에는 효모균체가 거의 존재하지 않았다. 또한, 배양 시간이 경과함에 따라 균체의 양은 일정하게 유지되고 에탄올은 지속적으로 생산됨으로써 에탄올을 대량으로 생산할 수 있었다.
도 1은 본 발명에 따른 혐기성 미생물의 연속 배양 장치의 한 양태를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 혐기성 미생물의 연속 배양 방법 및 장치에 의해 혐기성 미생물이 배양물의 하부층에 위치하는 것을 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 혐기성 미생물의 연속 배양 방법에 의해 효모를 배양하여 에탄올을 생산한 양태에서 시간별 에탄올의 생산량을 나타낸 것이다.
<도면의 각 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1: 혐기성 미생물 100: 배양 장치
110: 제어부 120: 배양조
132: 기질 챔버 134: 기질 공급 펌프
136: 기질 공급관 142: 생산물 챔버
144: 생산물 회수 펌프 146: 생산물 회수관
150: 교반기

Claims (10)

  1. 혐기성 미생물을 연속 배양하여 특정한 생산물을 제조하는 방법에 있어서, (1) 배양물의 하부층으로 상기 생산물의 생산에 이용되는 기질을 공급하는 단계; (2) 혐기성 미생물이 배양물의 하부층에 위치하도록 혐기성 미생물은 미생물을 응집시키는 물질과 함께 배양하여, 혐기성 미생물이 배양물의 하부층에 위치하도록 유지하면서 혐기성 미생물이 기질을 이용하여 생산물을 생산하도록 하는 단계; (3) 배양물의 상부층으로부터 생산물을 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 미생물을 응집시키는 물질은 알루민산나트륨, 황산제1철, 염화제2철, 황산알루미늄, 알루민산소다, 폴리알루미늄 클로라이드 (Polyaluminum Chloride), 폴리알루미늄 하이드록시디클로라이드 실리케이트 (Polyaluminum Hydroxidechloride Silicate), 폴리염화알루미늄, 폴리알루미늄실리케이트설페이트(Polyaluminum Silcate Sulfate; PASS), 폴리아크릴아미드 (Polyacryl amide), 미생물이 생산하는 다당류 또는 키토산계 폴리머인 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물의 연속 배양 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    배양조내 통기를 배제하는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물의 연속 배양 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    단계 (1)에서 기질의 공급속도는 기질로부터 생산물이 생산되는 속도와 같거나 기질로부터 생산물이 생산되는 속도 보다 느리게 설정하는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물의 연속 배양 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    단계 (3)에서 생산물의 회수속도는 기질의 공급 속도와 같거나 기질의 공급 속도 보다 빠르게 설정하는 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물의 연속 배양 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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