CN118086161A - 一株产l-酪氨酸的大肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产L‑酪氨酸的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过理性代谢工程改造获得L‑酪氨酸的重组菌株，在E.coli SA07基础上，通过回补表达aroK、aroL和tyrAfbr(M53I/A354V)，敲除全局调节因子基因tyrR，pheA，trpD，tyrP，发酵罐发酵L‑酪氨酸产量达到45.8g/L；利用中等强度启动子过表达DNA结合转录双调节因子基因marA提高了菌株的存活率，经过5L发酵罐发酵48h，酪氨酸产量可以达到65.9g/L，葡萄糖得率为21.9％，死亡率降低至43.5％。本发明发酵生产酪氨酸的方法工艺操作简单易行、性能稳定，适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一株产L-酪氨酸的大肠杆菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
L-酪氨酸(L-Tyrosine，Tyr)，又名(S)-2-氨基-3-对羟苯基丙酸，是三大芳香族氨基酸之一，在医药、食品、饲料和化工等领域有广泛应用。医药领域中，可作为氨基酸类的药物，用于治疗脑炎、脊髓灰质炎等疾病，在食品、饲料中可作为营养补充剂、增香剂使用，在化工领域中可作为原料用于有机合成多巴、甲状腺素和肾上腺素等。
L-酪氨酸的生产方法主要有水解法、化学合成法、生物酶法和生物发酵法。蛋白质水解法和化学合成法，由于过程复杂，收率低，对环境的污染较大，已经逐渐被微生物法取代。微生物直接发酵法生产氨基酸具有可以利用廉价碳源、反应温和、操作简单等优势。大肠杆菌中L-酪氨酸的合成途径和调控机制清晰明确，通过对L-酪氨酸的合成途径进行合理设计和优化以实现L-酪氨酸的高效发酵生产，包括提高前体物质的供应量、解除关键酶的反馈抑制、阻断竞争代谢途径和调节转运系统等方法。周景文团队对L-酪氨酸转运系统进行了改造以减少L-酪氨酸在细胞内的积累，然后引入磷酸酮醇酶途径，并进行辅因子工程，将葡萄糖代谢引导至莽草酸途径以合成L-酪氨酸。另外，为了提高L-酪氨酸在发酵中后期的积累，对大肠杆菌的乙酸途径进行了改造，通过适应性进化提高了菌株对乙酸的耐受性。最后，在5L发酵罐中进行了系统的发酵优化，该工程菌株发酵62h产出的L-酪氨酸浓度达到92.5g/L(Synthetic and Systems Biotechnology,2023,8(4):724-731)，这是迄今为止报道的最高产量。该菌株通过进化得到，工作量较大，同时存在回复突变导致菌株生产性能下降的风险。L-酪氨酸发酵中存在难点问题是由于L-酪氨酸溶解度(37℃、搅拌状态下＜2g/L)较低，且L-酪氨酸发酵对溶氧要求较高，设备转速的要求较高。在高速的搅拌、较大的气泡与大量的晶体的同时作用下，发酵液出现大量泡沫，菌体的死亡率较高，大量活性菌体因此浪费无法继续产酸，降低了L-酪氨酸的生产效率。
发明内容
本研究团队前期以E.coliW3110为底盘，构建了高产莽草酸的生产菌株E.coliSA07发酵罐水平上发酵48h生产莽草酸126.4g/L(公开于专利CN115820518A)，以该菌株为底盘，不通过诱变育种技术，理性代谢工程改造构建获得高产L-酪氨酸的E.coli，在基因组中利用中等强度启动子或强启动子过表达DNA结合转录双调节因子基因marA降低了E.coli死亡率，提高了葡萄糖的得率，对生物法生产L-酪氨酸具有重要意义。
本发明的第一个目的是提供一种高效生产L-酪氨酸的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌中，以E.coli SA07为出发菌株，回补莽草酸激酶I编码基因aroK和莽草酸激酶II编码基因aroL，过表达tyrAfbr(M53I/A354V)基因。
进一步地，敲除全局调节因子编码基因tyrR。
进一步地，敲除编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheA和编码苯甲酸合成酶亚基基因trpD。
进一步地，敲除编码酪氨酸通透酶基因tyrP。
进一步地，过表达DNA结合转录双调节因子基因marA。
进一步地，利用中等强度启动子或强启动子起始基因marA的表达。
进一步地，所述中等强度启动子包括PJ23108。
进一步地，所述强启动子包括PJ23119、PJ23101、Ptac。
进一步地，所述莽草酸激酶I的NCBI登录号为YP_026215.2；所述莽草酸激酶II的NCBI登录号为NP_414922.1；所述基因tyrAfbr(M53I/A354V)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步地，所述全局调节因子的NCBI登录号为NP_415839.1；所述分支酸变位酶/预苯酸脱水酶的NCBI登录号为NP_417090.1；所述苯甲酸合成酶亚基的NCBI登录号为NP_415779.1。
进一步地，所述酪氨酸通透酶的NCBI登录号为NP_416420.1。
进一步地，所述DNA结合转录双调节因子的NCBI登录号为NP_416048.2。
本发明的第二个目的是提供一种菌剂，所述菌剂中含有所述重组大肠杆菌。
本发明的第三个目的是提供一种制备L-酪氨酸的方法，所述方法为利用重组大肠杆菌或所述菌剂进行发酵生产。
进一步地，所述方法是采用所述重组大肠杆菌在发酵培养基中进行好氧发酵，得到含有L-酪氨酸的发酵液。
进一步地，在所述好氧发酵过程中，溶氧控制在20％以上。
进一步地，在所述的好氧发酵过程中，初始培养基中葡萄糖耗尽时，流加葡萄糖以控制葡萄糖浓度在0-1.0g/L。
进一步地，在所述的好氧发酵过程中，pH控制在6.8-7.0，发酵温度控制在35～38℃。
进一步地，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖20-30g/L，酵母浸出粉5-8g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾3g/L，柠檬酸钠1g/L，硫酸铵6.5g/L，硫酸锰20mg/L，硫酸亚铁35mg/L，L-蛋氨酸1g/L，L-苯丙氨酸0.5g/L，L-色氨酸0.1g/L，生物素0.5mg/L，维生素B10.5 mg/L，维生素B30.5 mg/L，维生素B50.5mg/L，微量元素混合液2.0mL/L。
本发明第四个目的是提供所述重组大肠杆菌或所述菌剂在制备L-酪氨酸或含有L-酪氨酸的产品中的应用。
有益效果:
本发明以高产莽草酸的生产菌株E.coli SA07底盘，不通过诱变育种技术，而是以代谢工程改造构建获得高产L-酪氨酸的E.coli Tyr10。该菌株是在E.coli SA07基础上，通过回补表达aroK、aroL和tyrAfbr(M53I/A354V)以打通莽草酸流向L-酪氨酸的代谢通路，L-酪氨酸的产量实现了从0到1.34g/L的变化；随后，在重组菌E.coli Tyr03的基础上，敲除全局调节因子tyrR以消除L-酪氨酸积累对关键路径基因(aroF,aroG,aroL和aroP)的反馈抑制，删除基因pheA和trpD，阻断L-苯丙氨酸和L-色氨酸生成，以增加分支酸通往L-酪氨酸的通量，L-酪氨酸的产量上升至2.45g/L；进一步的，通过探索酪氨酸转运路径的优化，最终通过删除编码酪氨酸通透酶的tyrP基因以减少酪氨酸转运到胞内，L-酪氨酸的产量进一步上升至3.01g/L，发酵罐发酵L-酪氨酸产量达到45.8g/L；最后，为了提高重组菌在发酵中的存活率，在E.coli Tyr08菌株基因组过表达DNA结合转录双调节因子基因marA，菌体死亡率从62.9％降低至43.5％，同时，L-酪氨酸相对于葡萄糖的得率从18.5％提高至21.9％。优化调控DNA结合转录双调节因子基因marA表达的启动子强度，最终发酵罐发酵48h，L-酪氨酸产量达到55.0-65.9g/L。该菌株具有发酵生产L-酪氨酸的工业化应用潜力。
具体实施方式
下述实施例中涉及的方法：
酪氨酸和其他氨基酸使用高效液相色谱法检测。流动相A是将3.01g无水乙酸钠，200μL三乙胺，5ml四氢呋喃溶于995mL超纯水中，用10％乙酸调pH至7.2；流动相B是将3.01g无水乙酸钠溶于200ml超纯水，用10％乙酸调pH至7.2，再加乙腈400ml，甲醇400ml。色谱柱为Aglient ZORBAX SB-Aq 250×4.6mm，5μm。利用衍生剂OPA进行柱前在线衍生方法，柱温：40℃，流速为1.0mL/min进行梯度洗脱，紫外检测波长：UV 338nm。
葡萄糖测定方法：使用深圳西尔曼生物传感分析仪M-100进行分析。
葡萄糖得率的计算：葡萄糖得率(％)＝酪氨酸最高产量(g/L)/葡萄糖消耗(g/L)×100。
菌体死亡率测定：取2mL样品，PBS洗涤菌体3次后，稀释至OD600在0.4-0.6之间。加入4-6μLPI染色液，冰浴避光染色15min后使用流式细胞仪检测。
摇瓶验证发酵条件：将制备好的摇瓶种子液按照10％(v/v)接种至摇瓶发酵培养基中，发酵温度37℃，摇床转速200rpm/min，发酵液中添加用苯酚红做指示剂，使用氨水调节pH在6.6-6.7之间，发酵48h。
下述实施例中涉及的培养基：
斜面/LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌30min。
种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，氯化钠10g/L，121℃灭菌30min。
摇瓶培养基(发酵初始培养基)：葡萄糖30g/L，酵母浸出粉8g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾3g/L，柠檬酸钠1g/L，硫酸铵6.5g/L，硫酸锰20mg/L，硫酸亚铁35mg/L，L-蛋氨酸1g/L，L-苯丙氨酸1g/L，L-谷氨酸0.5g/L，生物素0.5mg/L，维生素B10.5 mg/L，维生素B30.5mg/L，维生素B50.5 mg/L，微量元素混合液2.0mL/L。
表1微量元素混合液成分与浓度
| 成分 | 含量(g/L) | 成分 | 含量(g/L) |
| Al2(SO4)3·18H2O | 2.3 | Na2MoO4·2H2O | 2.5 |
| CoCl·6H2O | 1.5 | ZnSO4·2H2O | 0.5 |
| H3BO3 | 0.2 | CaCl2·2H2O | 12 |
实施例1：酪氨酸生产菌株代谢工程改造
以前期构建并保存的重组大肠杆菌E.coli SA07为底盘细胞进行理性的代谢工程改造(公开于专利：CN115820518A)，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术删除、整合和替换目标基因，使用均为商品化试剂、质粒等材料。具体改造路线包括：(1)基因组过量表达莽草酸激酶I aroK、莽草酸激酶II aroL和双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶tyrA以打通莽草酸流向L-酪氨酸的代谢通路；(2)删除全局调节因子tyrR以消除L-酪氨酸积累对关键路径基因(aroF,aroG,aroL和aroP)的反馈抑制；删除编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheA和trpD，阻断L-苯丙氨酸和L-色氨酸生成，以增加分支酸通往L-酪氨酸的通量；(3)删除编码酪氨酸通透酶tyrP基因以减少酪氨酸转运到胞内；(4)过表达DNA结合转录双调节因子基因marA提高了E.coli存活率。
1.E.coli SA07回补aroK、aroL和tyrAfbr(M53I/A354V)菌株的构建
为了强化L-酪氨酸的代谢通量，基因组上使用强启动子Pj23101过量表达莽草酸激酶I aroK(NCBI Reference Sequence:YP_026215.2)、莽草酸激酶II aroL(NCBIReference Sequence:NP_414922.1)和双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶突变体tyrAfbr(M53I/A354V)基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)以打通莽草酸流向L-酪氨酸的代谢通路，分别构建了重组菌株E.coli Tyr01、E.coli Tyr02和E.coli Tyr03。构建菌株的引物见表2。
以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以及一对aroK上游区域-f/aroK上游区域-r的引物、一对Pj23101 aroK-f/Pj23101 aroK-r的引物和一对aroK下游区域-f/aroK下游区域-r的引物进行PCR获得。
PCR反应程序：Prime star MIX聚合酶用作聚合酶，进行如下PCR扩增：在95℃下变性3分钟；在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下聚合1分钟，进行29次循环；并在72℃下聚合5分钟。通过将Gibson组装将PCR扩增得到的三个片段进行同源重组获得融合片段。将融合片段和pTargetF质粒通过电击转化方法转化至带Cas9质粒的E.coli SA07菌株中，在30℃培养箱中采用含Kan和Spe抗性LB平板进行筛选，对培养基上长出的菌落进行验证，获得目的菌株。经过IPTG诱导和42℃培养16小时。经证实，在LB固体培养基上生长但在含有Kan的LB固体培养基、含有Spe的LB固体培养基上未生长。得到重组菌株E.coli Tyr01。
以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以及一对aroL上游区域-f/aroL上游区域-r的引物、一对Pj23101 aroL-f/Pj23101 aroL-r的引物和一对aroL下游区域-f/aroL下游区域-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli SA07菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr02。
以由苏州金唯智公司基因合成的tyrAfbr(M53I/A354V)基因为模板，以及一对tyrA上游区域-f/tyrA上游区域-r的引物、一对Pj23101 tyrA-f/Pj23101 tyrA-r的引物和一对tyrA下游区域-f/tyrA下游区域-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr02菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coliTyr03。
上述菌株构建完成后，利用摇瓶水平验证L-酪氨酸的积累情况(表3)，打通莽草酸流向L-酪氨酸的代谢通路的重组菌株E.coli Tyr02可以积累L-酪氨酸0.35g/L；通过利用强启动子过量表达解除反馈抑制的tyrAfbr(M53I/A354V)的重组菌株E.coli Tyr03，L-酪氨酸积累达到1.34g/L，相较于E.coli Tyr02提高了2.83倍。此时，另外两种芳香族氨基酸苯丙氨酸和色氨酸分别积累了0.55g/L和0.36g/L。
表2引物序列
表3基因表达对酪氨酸积累的影响
2.删除tyrR、pheA和trpD菌株的构建
为了进一步提交酪氨酸的代谢流量，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术删除重组菌株E.coli Tyr03基因组上的全局调节因子tyrR(NCBI Reference Sequence:NP_415839.1)以消除L-酪氨酸积累对关键路径基因的反馈抑制，构建工程菌株E.coli Tyr04；在此基础上，删除双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶pheA(NCBI Reference Sequence:NP_417090.1)，构建工程菌株E.coli Tyr05，截断苯丙氨酸合成路径；进一步删除苯甲酸合成酶亚基trpD(NCBI Reference Sequence:NP_415779.1)，截断色氨酸合成路径，构建工程菌株E.coli Tyr06，增强酪氨酸的合成路径的代谢流量。构建菌株的引物见表4.
为了构建敲除tyrR基因的E.coli Tyr03菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，一对tyrR上游区域-f/tyrR上游区域-r的引物和一对tyrR下游区域-f/tyrR下游区域-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr03菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr04。
为了构建敲除pheA基因的E.coli Tyr04菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，一对pheA上游区域-f/pheA上游区域-r、一对pheA下游区域-f/pheA下游区域-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coliTyr04菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr05。
为了构建敲除trpD基因的E.coli Tyr05菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，一对trpD上游区域-f/trpD上游区域-r的引物和一对trpD下游区域-f/trpD下游区域-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr05菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr06。
上述菌株构建完成后，摇瓶水平验证酪氨酸的积累情况(表5)，删除转录调控因子tyrR，E.coli Tyr04可以积累酪氨酸1.78g/L，但是苯丙氨酸和色氨酸的产量同时增加。随后，阻断苯丙氨酸和色氨酸代谢路径，构建的菌株E.coli Tyr06发酵生产酪氨酸浓度达到2.45g/L，不再积累苯丙氨酸和色氨酸，此时发酵液中有少量酪氨酸沉淀析出。
表4引物序列
表5基因删除对酪氨酸积累的影响
3.酪氨酸转运路径的改造
为了进一步增加酪氨酸的转运路径，E.coli Tyr06菌株的基因组上使用强启动子Pj23101强化酪氨酸转运蛋白YddG表达量(NCBI Reference Sequence:NP_415990.5)，构建菌株E.coli Tyr07，增加L-酪氨酸向胞外转运，摇瓶发酵验证发现酪氨酸的产量反而下降了4.08％，而且菌株生长变慢；因此E.coli Tyr06和E.coli Tyr07中分别删除编码酪氨酸通透酶基因tyrP(NCBI Reference Sequence:NP_416420.1)以减少酪氨酸转运到胞内，构建菌株E.coli Tyr08和E.coli Tyr09，摇瓶验证发现仅删除tyrP基因(NCBI ReferenceSequence:NP_416420.1)效果更好，酪氨酸积累达到3.01g/L，葡萄糖得率达到0.16g/g(表7)。构建菌株的引物见表6。
为了构建具有强启动子Pj23101过表达yddG基因的E.coli Tyr06菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，一对yddG上游区域-f/yddG上游区域-r的引物、一对yddG下游区域-f/yddG下游区域-r的引物和一对Pj23101yddG-f/Pj23101yddG-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr06菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr07。
为了构建敲除tyrP基因的E.coli Tyr06菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，一对tyrP上游区域-f/tyrP上游区域-r的引物和一对tyrP下游区域-f/tyrP下游区域-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr06菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr08。
为了构建敲除tyrP基因的E.coli Tyr07菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，一对tyrP上游区域-f/tyrP上游区域-r的引物和一对tyrP下游区域-f/tyrP下游区域-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr07菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr09。
表6引物序列
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| yddG上游区域-f | ctcaatcagagattcttgccgc |
| yddG上游区域-r | aataactgccgggtctacgg |
| Pj23101yddG-f | tttacagctagctcagtcctaggtattatgctagctgtggaatgacacgacaaaaagcaacgc |
| Pj23101yddG-r | ttaaccacgacgtgtcgcc |
| yddG下游区域-f | caatggacgtcagtcgcaga |
| yddG下游区域-r | ccaacggtttaccgttacgc |
| tyrP上游区域-f | ggtatgtttctgagcagcatgaag |
| tyrP上游区域-r | gctttcttctgtcctgacgatc |
| tyrP下游区域-f | cagatagcctcaaattccttattgg |
| tyrP下游区域-r | gtgttgagttctccgcaagag |
表7酪氨酸转运系统改造对酪氨酸积累的影响
| 菌株名称 | 基因特点 | 酪氨酸(g/L) | 葡萄糖得率(g/g) |
| E.coliTyr06 | E.coliTyr05ΔtrpD | 2.45 | 0.14 |
| E.coliTyr07 | E.coliTyr06yddG::Pj23101yddG | 2.35 | 0.14 |
| E.coliTyr08 | E.coliTyr06ΔtyrP | 3.01 | 0.16 |
| E.coliTyr09 | E.coliTyr07ΔtyrP | 2.55 | 0.15 |
实施例2：E.coliTyr08发酵生产L-酪氨酸
(1)种子液制备
将实施例1中构建的工程菌株E.coli Tyr08在固体平板培养基上划线，37℃恒温培养箱中培养12h，用接种针挑取单菌落挑取一环接入50mL/500mL种子培养基中进行培养，37℃，200rpm震荡培养8h，OD600值在10-12之间。
(2)5L发酵罐发酵培养
将步骤(1)制备好的种子液按照接种量10％(v/v)接种至含有2.5L发酵初始培养基的5L发酵罐中，发酵初始条件：温度37℃，pH 7.0，风量2vvm，罐压恒定0.03Mpa，初始转速400rpm/min。发酵过程中，通过调节通气量和搅拌转速将发酵过程中的溶氧维持在20％以上，最大风量为3vvm，最高搅拌转速为1000r/min。流加氨水维持pH在6.8-7.0。发酵培养基中初始葡萄糖全部耗尽时，通过流加补料800g/L的葡萄糖溶液，控制葡萄糖浓度在1.0g/L以下，直至发酵结束。
结果表明，采用本实施例的方法对菌株E.coli Tyr08发酵生产L-酪氨酸，发酵48h，L-酪氨酸产量达到45.8g/L，葡萄糖得率为18.5％。L-酪氨酸发酵对溶氧要求高，在高速的搅拌、较大的气泡与L-酪氨酸析出晶体的同时作用下，使得发酵过程中出现大量的泡沫，使用流式细胞仪检测发酵过程中细胞的死亡率，随着发酵进行，死亡率不断升高，发酵终点死亡率达到了62.9％，因此浪费大量菌体，无法继续产酸，降低了L-酪氨酸的生产效率。
实施例3：抗逆元件的筛选
为了提高菌体抗逆性能，保证发酵后期菌体的存活率，通过转录组数据分析和文献调研筛选了5个可能与菌株抗逆相关的基因元件(表8)，分别为DNA结合转录双调节因子marA(NCBI Reference Sequence:NP_416048.2)、fadR(NCBI Reference Sequence:NP_416846.2)、crp(NCBI Reference Sequence:NP_417816.1)、arfA(NCBI ReferenceSequence:YP_588467.1)和higA(NCBI Reference Sequence:NP_311991.1)。为了防止蛋白过表达增加菌体负担，E.coli Tyr08中使用中等强度启动子PJ23108替原始启动子，构建菌株E.coli Tyr10、E.coli Tyr11、E.coli Tyr12、E.coli Tyr13和E.coli Tyr14，构建菌株所使用的的引物见表9。
为了构建具有中等强度启动子Pj23108过表达marA基因的E.coli Tyr08菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以及一对marA上游区域-f/marA上游区域-r的引物、一对marA下游区域-f/marA下游区域-r的引物和一对Pj23108marA-f/Pj23108marA-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr08菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr010。
为了构建具有中等强度启动子Pj23108过表达fdaR基因的E.coli Tyr08菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以及一对fadR上游区域-f/fadR上游区域-r的引物、一对fadR下游区域-f/fadR下游区域-r的引物和一对Pj23108fadR-f/Pj23108fadR-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr08菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr011。
为了构建具有中等强度启动子Pj23108过表达crp基因的E.coli Tyr08菌株，以通过使用大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以及一对crp上游区域-f/crp上游区域-r的引物、一对crp下游区域-f/crp下游区域-r的引物和一对Pj23108crp-f/Pj23108crp-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr08菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr012。
为了构建具有中等强度启动子Pj23108过表达arfA基因的E.coli Tyr08菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以及一对arfA上游区域-f/arfA上游区域-r的引物、一对arfA下游区域-f/arfA下游区域-r的引物和一对Pj23108arfA-f/Pj23108arfA-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr08菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr013。
为了构建具有中等强度启动子Pj23108过表达higA基因的E.coli Tyr08菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以及一对higA上游区域-f/higA上游区域-r的引物、一对higA下游区域-f/higA下游区域-r的引物和一对Pj23108higA-f/Pj23108higA-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr08菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr014。
表8抗逆元件的基因序列与功能
| 基因 | 基因序列 | 功能描述 |
| marA | NP_416048.2 | DNA结合转录双调节因子 |
| fadR | NP_416846.2 | 调控细胞脂肪酸合成 |
| crp | NP_417816.1 | DNA结合转录双调节因子 |
| arfA | YP_588467.1 | 核糖体调控因子 |
| higA | NP_311991.1 | DNA结合转录抑制因子 |
表9引物序列
按照实施例2中的培养方式进行发酵培养，检测酪氨酸的产量与发酵结束时菌体的死亡率(表11)，结果发现当表达marA、arfA和higA都可以不同程度降低菌株的死亡率，但是只有过表达marA可以同时提高酪氨酸的产量(65.9g/L)，发酵结束时菌体的死亡率从62.9％降低至43.5％，葡萄糖得率从18.5％提高至21.9％。进一步优化marA的表达强度，将启动子PJ23108分别替换为强启动子PJ23119、PJ23101、Ptac，构建菌株E.coli Tyr15、E.coliTyr16、E.coli Tyr17，构建菌株所使用的的引物见表10。
为了构建具有强启动子Pj23119过表达marA基因(NCBI Reference Sequence:NP_416048.2)的E.coli Tyr08菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以及一对marA上游区域-f/marA上游区域-r的引物、一对marA下游区域-f/marA下游区域-r的引物和一对Pj23119marA-f/Pj23119marA-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr08菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coliTyr015。
为了构建具有强启动子Pj23101过表达marA基因(NCBI Reference Sequence:NP_416048.2)的E.coli Tyr08菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以及一对marA上游区域-f/marA上游区域-r的引物、一对marA下游区域-f/marA下游区域-r的引物和一对Pj23101 marA-f/Pj23101 marA-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr08菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coliTyr016。
为了构建具有强启动子Ptac过表达marA基因(NCBI Reference Sequence:NP_416048.2)的E.coli Tyr08菌株，以大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以及一对marA上游区域-f/marA上游区域-r的引物、一对marA下游区域-f/marA下游区域-r的引物和一对PtacmarA-f/PtacmarA-r的引物进行PCR获得。采用相同的方法将融合片段和pTargetF质粒转化至带Cas9质粒的E.coli Tyr08菌株中，经过培养和筛选得到重组菌株E.coli Tyr017。
按照实施例2中的培养方式进行发酵培养，检测E.coli Tyr15、E.coli Tyr16、E.coli Tyr17菌株酪氨酸的产量与发酵结束时菌体的死亡率(表11)，发酵结束时菌体的死亡率均出现不同程度下降，酪氨酸积累55.0-63.2g/L，因此，最优启动子仍然为中等强度启动子PJ23108。
表10引物序列
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| marA上游区域-f | ggcatcggtcaattcattcatttgac |
| marA上游区域-r | gtttacggcaggactttcttaagc |
| Pj23119marA-f | ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagctgtggaatgtccagacgcaatactgac |
| Pj23119marA-r | gattgcctcagtgacgttgtc |
| Pj23101marA-f | tttacagctagctcagtcctaggtattatgctagctgtggaatgtccagacgcaatactgac |
| Pj23101marA-r | gattgcctcagtgacgttgtc |
| PtacmarA-f | ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaatgtccagacgcaatactgac |
| PtacmarA-r | gattgcctcagtgacgttgtc |
| marA下游区域-f | atgaaaccactttcatccgcaatag |
| marA下游区域-r | cagtctggttactatcgatatgaccac |
表11抗逆元件对酪氨酸积累的影响
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种高效生产L-酪氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌中，以E.coli SA07为出发菌株，回补莽草酸激酶I编码基因aroK和莽草酸激酶II编码基因aroL，过表达tyrAfbr(M53I/A354V)基因。
2.根据权利要求1所述的的重组大肠杆菌，其特征在于，敲除全局调节因子编码基因tyrR，编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheA和编码苯甲酸合成酶亚基基因trpD。
3.根据权利要求2所述的的重组大肠杆菌，其特征在于，敲除编码酪氨酸通透酶基因tyrP。
4.根据权利要求3所述的的重组大肠杆菌，其特征在于，过表达DNA结合转录双调节因子基因marA。
5.根据权利要求4所述的的重组大肠杆菌，其特征在于，利用中等强度启动子或强启动子起始基因marA的表达。
6.根据权利要求5所述的的重组大肠杆菌，其特征在于，所述中等强度启动子包括PJ23108；所述强启动子包括PJ23119、PJ23101、Ptac。
7.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1～6任一所述重组大肠杆菌。
8.一种制备L-酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1～6任一重组大肠杆菌或权利要求7所述菌剂进行发酵生产。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是采用所述重组大肠杆菌在发酵培养基中进行好氧发酵，得到含有L-酪氨酸的发酵液；可选的，所述好氧发酵中，控制溶氧在20％以上。
10.权利要求1～6任一重组大肠杆菌或权利要求7所述菌剂在制备L-酪氨酸或含有L-酪氨酸的产品中的应用。
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