CN116904379A - 一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种利用葡萄糖发酵产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用。其中所述工程菌由下述表达方法得到：以野生型大肠杆菌MG1655为底盘细胞，在其染色体上多拷贝异源表达来自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的ectABC基因簇，赋予底盘细胞合成四氢嘧啶的能力，利用强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控来源于T7噬菌体的RNA聚合酶，同时结合双T7启动子调控ectABC基因簇高效表达，对支路基因敲除的同时增强表达合成路径关键基因，最终构建获得高产四氢嘧啶的基因重组菌株。罐上发酵48h，四氢嘧啶最高产量达78g/L。该方法具有发酵生产原料价格低廉、培养工艺简单，设备损耗小，单批发酵产量高，成本低，易于实现工业化生产。

Description

一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用。
背景技术
四氢嘧啶(Ectoine)学名四氢甲基嘧啶二羧酸，别名依克多因，是一种新型水溶性两性离子氨基酸衍生物，能够维持细胞的渗透压平衡，具有很强的水分子络合能力，使得细胞游离水结构化，是一种优秀的天然保湿剂。具有如下结构：
四氢嘧啶可以对高温、冷冻、射线等极端环境中细胞内蛋白质、酶、核酸等起到保护作用，对抗紫外线对皮肤的伤害、修复紫外线导致的细胞DNA的损伤。作为一种具有保湿修复功能的天然化妆品活性成分，四氢嘧啶被广泛地应用于护肤品领域，是国际各大主流护肤品和化妆品品牌产品的主效成分之一。
目前，生产四氢嘧啶的方法主要有微生物发酵法和细胞转化法。其中，微生物发酵法主要是利用高嗜盐微生物以葡萄糖为底物采用“细菌挤奶法”工艺生产，此法虽可获得较高产量的四氢嘧啶，但工艺对生产设备要求高(耐腐蚀)，产品分离纯化难度较大，生产成本高。浙江海正药业股份有限公司授权公告号为CN 103451137 B的专利报道了一种生产四氢嘧啶的盐单胞菌及其突变株，可在较低浓度下发酵实现较高浓度的四氢嘧啶产量，发酵72h生成四氢嘧啶19.9g/L。细胞转化法主要是利用重组工程菌细胞以L-天冬氨酸和甘油为底物进行酶催化合成四氢嘧啶，此法虽然避免了高嗜盐微生物生产的缺点，但酶催化过程添加大量的底物和辅因子同样导致了生产成本的增加。CN 104593442 B报道利用大肠杆菌BW-pBAD-ectABC转化天冬氨酸钠合成四氢嘧啶的方法，菌体重复使用5次，胞外合成四氢嘧啶87.5g，合成效率11.67g/L.d。
近年来，通过工程化大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌进行发酵合成四氢嘧啶的研究越来越多，但四氢嘧啶的产量仍然偏低。面对四氢嘧啶日益增加的市场需求，开发高产四氢嘧啶工程菌株来提高单批发酵收益来降低生产成本具有非常重要的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用葡萄糖高效生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，并将构建获得的重组菌株应用于四氢嘧啶的发酵生产中，实现四氢嘧啶的发酵高产量、低成本且发酵生产工艺简单，为工业化生产四氢嘧啶奠定基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株高产四氢嘧啶的基因重组菌株(ECM06)，所述重组菌株是在野生型大肠杆菌MG1655染色体上多拷贝异源表达来自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的ectABC基因簇，重构了四氢嘧啶合成通路，赋予重组菌株合成四氢嘧啶的能力；利用强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控来源于T7噬菌体的RNA聚合酶(T7RNAP)，同时结合双T7启动子(SEQID NO.108)用于调控ectABC的高效表达；所述重组菌株包括对iclR(SEQ ID NO.109)和thrA(SEQ ID NO.110)两个基因进行敲除，在敲除iclR和thrA基因的同时对应敲入由T7启动子调控来源于谷氨酸棒状杆菌的L-天冬氨酸激酶(CglysCS301Y)基因(SEQ ID NO.111)和L-天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(CgAsd)基因(SEQ ID NO.112)；用Ptrp2启动子替换ppc基因(SEQ ID NO.113)和pfkB基因(SEQ ID NO.114)的启动子。
所述重组菌株以大肠杆菌MG1655为宿主细胞改造获得；
所述ectABC基因簇包含的ectA、ectB、和ectC的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
所述强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
本发明另一目的在于提供利用葡萄糖高效生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，具体如下：
(1)以大肠杆菌MG1655为出发菌株，重构四氢嘧啶合成途径：
①构建由双T7启动子调控的ectABC表达盒，即T7-ectB+T7-ectAC，敲入基因组lacZ基因位点表达。
②构建由强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控T7RNAP表达盒，即Ptrp2-T7RNAP，敲入基因组lacI基因位点表达。
(2)四氢嘧啶合成途径支路基因的敲除及关键基因的增强表达
①敲除iclR基因打开乙醛酸循环实现草酰乙酸的累积，同时在iclR基因位点敲入CglysCS301Y表达盒，即T7-CglysCS301Y；
②敲除thrA基因阻断L-天冬氨酸-β-半醛流向支路代谢，同时在thrA位点敲入CgAsd表达盒，即T7-CgAsd；
③替换ppc基因启动子为Ptrp2；
④替换pfkB基因启动子为Ptrp2。
(3)ectABC的增强表达
在yeep基因位点敲入ectABC表达盒的第二个拷贝。
本发明的目的之二，提供一种重组菌株摇瓶发酵生产四氢嘧啶的方法，具体如下：
步骤(1)重组菌株平板活化：使用无菌接种环取重组菌株于LB固体平板上划线，倒置恒温培养至长出单菌落。
步骤(2)种子菌培养：从步骤(1)活化的LB平板上挑取单菌落(形态圆润规则)接种于含LB液体培养基的试管中，恒温振荡培养。
步骤(3)摇瓶发酵：将步骤(2)培养好的种子液按4％～10％的接种量转接于发酵培养基的摇瓶中，进行恒温培养。
优选的，在步骤(1)中，倒置恒温培养温度为37℃，培养时间为15～24h。
优选的，在步骤(2)中，恒温振荡培养温度为37℃，时间为10～15h。
优选的，在步骤(3)中，恒温培养温度为37℃，时间为15～24h。
优选的，步骤(3)中获得的重组菌株进行冷冻保藏，优选的，重组菌保藏于甘油管中。优选的，保藏温度为-80℃至-70℃。
在一个优选的实施方案中，摇瓶发酵15～24h后四氢嘧啶的产量达1.452g/L。
在一个优选的实施方案中，摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖3～8g/L；甘油2～6g/L；酵母粉2～8g/L；玉米浆干粉5～15g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～1g/L，L-苏氨酸0.1～1g/L，其余为水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
本发明的目的之三，提供一种重组菌株发酵罐发酵生产四氢嘧啶的方法，具体如下：
步骤(a)重组菌株斜面活化培养：取一管保藏的重组菌株，用接种环取一环菌液于茄形瓶LB斜面上均匀涂布，置于恒温培养箱培养。
步骤(b)种子罐培养：取适量无菌水于茄形瓶中，用接种环将步骤(a)菌体全部刮起后，轻轻摇动茄形瓶形成菌悬液。将菌悬液全部接种于含种子培养基的发酵罐中，维持pH在7.0左右。
步骤(c)发酵罐培养：将培养好的种子菌液按照15％转接于含发酵培养基的发酵罐中，葡萄糖为底物，pH 7.0左右，发酵过程中检测DO值和pH值，发酵生产四氢嘧啶。
步骤(a)中，优选的，茄子瓶LB斜面培养基配方：酵母提取粉5g/L；蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，其余为水，pH 7.0左右，121℃灭菌20min。
步骤(a)中，优选的，恒温培养箱温度为37℃，时间为15～20h。
步骤(b)中，优选的，用25％氨水维持pH在7.0左右；优选的，将所述菌悬液全部接种于含种子培养基的发酵罐中，维持pH在7.0左右，温度37℃，溶解氧(DO)维持在20％～40％之间，培养约5～8h。
步骤(b)中，优选的，罐上种子培养基组分：葡萄糖5～20g/L；甘油3～15g/L；酵母粉2～8g/L；玉米浆干粉5～15g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～1g/L，L-苏氨酸0.1～1g/L，消泡剂适量，其余为水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
步骤(c)中，发酵罐培养：所述培养温度37℃初始转速200rpm，流加25％氨水维持pH7.0左右，罐压0.05MPa，通过调整转速、通气量来使溶氧维持在20～40％。进一步的，当溶氧(DO)和pH同时快速上升时，说明底物葡萄糖已耗完，先迅速流加葡萄糖补料，优选的，葡萄糖补料浓度500～650g/L，115℃灭菌15min。使DO下降至40％以下，再以一定的流加速率维持葡萄糖浓度在2～8g/L。优选的，发酵周期为48h。在发酵过程间隔取样检测OD600和四氢嘧啶的生成量，在此过程中，本申请发明人惊奇的发现，通过HPLC检测结果显示发酵44h发酵液四氢嘧啶生成量达到最高为78g/L。
步骤(c)中，优选的，发酵罐培养基组分(15L)：葡萄糖10～30g/L；甘油10～30g/L；酵母粉5～30g/L；玉米浆干粉5～50g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～5g/L，L-苏氨酸0.1～5g/L，消泡剂适量，其余为水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
相较于现有技术，本发明的有益发明在于：
1、本发明的四氢嘧啶高产菌株通过在大肠杆菌MG1655基因组上多拷贝双T7启动子调控的ectABC表达盒(T7-ectB+T7-ectAC)，由强启动子色氨酸串联启动子调控T7 RNA聚合酶(T7RNAP)表达，使宿主细胞重构获得合成四氢嘧啶的途径。
2、本发明在敲除iclR和thrA基因的同时(增加草酰乙酸累积能力和阻断L-天冬氨酸-β-半醛流向支路代谢)，引入T7启动子调控的CglysCS301Y和CgAsd基因，增强L-天冬氨酸-β-半醛的合成能力。
3、本发明提供的四氢嘧啶的生产方法，实现在非高盐、无需添加抗生素、无诱导物的条件下发酵制备四氢嘧啶，产量可达78g/L，远高于现阶段大肠杆菌生产工艺。本发明重组菌株发酵培养工艺简单，设备损耗小，单批发酵产量高，成本低，易于实现工业化生产。
附图说明
图1为pET32a-ectB+T7-ectAC质粒图谱。
图2为ectABC基因簇酶蛋白诱导表达图谱。
其中图2A，M：Protein Marker；1：ECT-A菌未诱导总蛋白样品；2：ECT-A菌诱导上清样品；3：ECT-A菌诱导沉淀样品；4：ECT-B菌未诱导总蛋白样品；5：ECT-B菌诱导上清样品；6：ECT-B菌诱导沉淀样品；7：ECT-C菌未诱导总蛋白样品；8：ECT-C菌诱导上清样品；9：ECT-C菌诱导沉淀样品。图2B，M：Protein Marker；1：ECT-BAC菌株-1#未诱导总蛋白样品；2：ECT-BAC-1#菌株诱导上清样品；3：ECT-BAC-1#菌株诱导沉淀样品；4：ECT-BAC-2#菌株诱导上清样品；5：ECT-BAC-2#菌株诱导沉淀样品。
图3为本发明实施例2中重组菌株ECM01、ECM02、ECM03、ECM04、ECM05、ECM06、ECM07和大肠杆菌MG1655摇瓶发酵生成四氢嘧啶的产量示意图。
图4为本发明实施例5中重组菌株ECM06在30L发酵罐中高密度发酵合成四氢嘧啶的示意图。
图5为实施例5发酵液中四氢嘧啶的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合附图和较佳实施例对本发明做进一步的说明，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下列实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1利用葡萄糖高效生产四氢嘧啶重组菌的构建
一、底盘细胞重构四氢嘧啶合成路径
1、ectABC基因簇表达质粒构建及诱导表达
将来源于伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的ectABC基因簇编码ectA、ectB和ectC基因序列进行密码子优化，序列见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO,3，将优化的基因序列提交通用生物进行合成，获得携带目的基因片段的pUC57-ectA、pUC57-ectB和pUC57-ectC质粒。
以pET32a(+)质粒为模板，用32a-F/32a-R引物对PCR控制获得pET32a载体线性化片段；再分别以pUC57-ectA、pUC57-ectB和pUC57-ectC质粒为模板，用ectA-F/ectA-R、ectB-F/ectB-R和ectC-F/ectC-R引物对进行PCR扩增获得ectA、ectB和ectC片段。用Cleanup试剂盒纯化获得pET32a载体线性化片段、ectA、ectB和ectC片段。回收产物再经Dpn I 37℃酶切1h来消除模板质粒。按照Ready-to-Use Seamless Cloning Kit(上海生工)说明书将pET32a载体线性化片段分别和ectA、ectB和ectC片段进行连接反应，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布氨苄抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pET32a-ectA、pET32a-ectB和pET32a-ectC质粒，化转表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)获得pET32a-ectA/BL21(DE3)、pET32a-ectB/BL21(DE3)和pET32a-ectC/BL21(DE3)重组菌株，分别简称为ECT-A、ECT-B和ECT-C菌株。
以pET32a-ectB质粒为模板，利用32a-ectB-F/32a-ectB-R引物对进行PCR扩增获得pET32a-ectB载体线性化片段，用T7-ectA-F/ectA-R1和ectC-F1/ectC-R1引物对分别以pET32a-ectA和pET32a-ectC质粒为模板PCR扩增获得T7-ectA片段和ectC-2片段(含T7终止子)。用Clean up试剂盒纯化获得pET32a-ectB载体线性化片段、T7-ectA和ectC-2片段。回收产物再经Dpn I 37℃酶切1h来消除模板质粒，按照Ready-to-Use Seamless CloningKit说明书将pET32a-ectB载体线性化片段、T7-ectA和ectC-2片段进行连接反应，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布氨苄抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pET32a-ectB+T7-ectAC质粒，化转表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)获得pET32a-ectB+T7-ectAC/BL21(DE3)重组菌株，简称为ECT-BAC菌株。
将ECT-A、ECT-B、ECT-C和ECT-BAC菌株分别接种含5mL LB培养基试管中，添加Amp至终浓度为100mg/L，37℃培养6～9h，按1％～4％接种量转接50mL TB培养基摇瓶(Amp终浓度100mg/L)，37℃培养2～6h后添加IPTG至终浓度为0.05～0.5mM，降温至28℃，诱导培养8～20h。离心收集菌体后用20mM pH 7.0PBS重悬后进行超声破碎后，破碎样品进行SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况，结果见图2。由图可知，ectA、ectB和ectC均实现可溶表达且蛋白表达量较高(图2A)，同时构建的共表达质粒在双T7启动子的调控下同时实现ectA、ectB和ectC的可溶表达(图2B)。
2、整合ectABC基因簇表达盒(第一个拷贝)
以大肠杆菌MG1655为出发菌株，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因组上lacZ位点进行整合四氢嘧啶合成基因簇ectABC表达盒(T7-ectB+T7-ectA-ectC)，使得底盘细胞获得合成四氢嘧啶的能力。
(1)pTD-lacZ::ectABC质粒构建：以pTargetF质粒为模板，以pT-lacZ::ectABC-F/pT-lacZ::ectABC-R为引物对进行PCR扩增，扩增产物经Clean up试剂盒回收后再用Dpn I在37℃恒温酶切1h。酶切产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养阳性转化子，测序验证获得序列正确的pTargetF-lacZ::ectABC质粒。
以Ecoli MG1655基因组为模板，利用lacZ-up-F/lacZ-up-R引物对扩增获得DonorDNA的上游同源臂lacZ-up片段；用lacZ-dn-F/lacZ-dn-R引物对扩增获得Donor DNA的下游同源臂lacZ-dn片段。以共表达质粒pET32a-ectB+T7-ectAC为模板，用lacZ::ectABC-F/lacZ::ectABC-R引物对扩增获得Donor DNA ectABC表达盒片段。以pTargetF-lacZ::ectABC质粒为模板，用pTargetF-line-F/pTargetF-line-R引物对扩增获得pTargetF-lacZ::ectABC质粒的线性化片段。用Clean up试剂盒获得获得上游同源臂lacZ-up片段、下游同源臂lacZ-dn片段、Donor DNA ectABC表达盒片段和pTargetF-lacZ::ectABC线性化片段，Donor DNA ectABC表达盒片段和pTargetF-lacZ::ectABC线性化片段还经Dpn I 37℃酶切1h来消除模板质粒。按照Ready-to-Use Seamless Cloning Kit说明书将pTargetF-lacZ::ectABC线性化片段、上游同源臂lacZ-up片段、下游同源臂lacZ-dn片段和Donor DNAectBAC表达盒片段进行连接反应，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pTD-lacZ::ectABC质粒。
(2)大肠杆菌MG1655/pCas菌株感受态细胞制备：利用CaCl2法制备大肠杆菌MG1655感受态细胞，将pCas质粒化转大肠杆菌MG1655感受态细胞，涂布于卡那霉素平板(Kan终浓度50mg/L)，置于30℃恒温培养箱倒置过夜培养筛选阳性克隆。挑取单菌落于5mLLB试管(含Kan 50mg/L)中，30℃振荡培养过夜，按1％接种量将试管种子液转接于50mL LB摇瓶(Kan终浓度50mg/L)30℃培养至OD600为0.3时添加L-阿拉伯糖至终浓度10～20mM，30℃继续培养至OD600为0.6。4000rpm、4℃离心10min收集菌体细胞，采用CaCl2法进行制备获得大肠杆菌MG1655/pCas菌株感受态细胞。
(3)转化：将约800～1200ng pTD-lacZ::ectABC质粒化转100μL大肠杆菌MG1655/pCas菌株感受态细胞中，42℃热激90s后立即加入1mL LB培养基，30℃孵育2～3h后涂布含50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB双抗平板，30℃倒置培养15～24h。从双抗平板中挑取单菌落以lacZ-up-F1/lacZ-dn-R1引物对进行菌落PCR验证，以野生型大肠杆菌MG1655菌液为阴性对照，结果筛选获得扩增条带大小为3941bp的阳性菌落，阴性对照扩增条带大小为1923bp，阳性菌扩增产物测序确认ectABC表达盒编辑成功，获得ECT菌株。
(4)消除pTargetF质粒：将筛选获得的阳性菌落接种于含50mg/L卡那霉素的5mLLB试管中，30℃培养2～4h后添加IPTG至终浓度为0.5mM继续培养过夜；过夜诱导培养菌液划线于卡那霉素LB抗性平板，30℃倒置培养15～24h分离单菌落，随后挑取单菌落同时划线于卡那霉素盒壮观霉素平板，30℃倒置培养过夜，筛选能在卡那霉素平板上生长而不能在壮观霉素平板上生长的单菌落(pTD-lacZ::ectABC质粒成功消除)，获得ECT/pCas菌株。
3、整合Ptrp2-T7RNAP表达盒
(1)pTD-lacI::T7RNAP质粒构建：以pTargetF质粒为模板，以pT-lacI::T7RNAP-F/pT-lacI::T7RNAP-R为引物对进行PCR扩增，扩增产物经Clean up试剂盒回收后再用Dpn I在37℃恒温酶切1h。酶切产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养阳性转化子，测序验证获得序列正确的pTargetF-lacI::T7RNAP质粒。
以Ecoli MG1655基因组为模板，利用lacI-up-F/lacI-up-R引物对扩增获得DonorDNA的上游同源臂lacI-up片段；用lacI-dn-F/lacI-dn-R引物对扩增获得Donor DNA的下游同源臂lacI-dn片段。以大肠杆菌BL21(DE3)菌液为模板，用lacI::T7RNAP-F/lacI::T7RNAP-R引物对扩增获得Donor DNA T7RNAP基因片段(含终止子)；以合成的pUC57-Ptrp2质粒(强启动子色氨酸串联启动子序列见SEQ ID NO.4)为模板，引物Ptrp2-F/Ptrp-R引物对扩增获得Ptrp2启动子片段。以pTargetF-lacI::T7RNAP质粒为模板，用pTargetF-line-F/pTargetF-line-R引物对扩增获得pTargetF-lacI::T7RNAP质粒的线性化片段。用Cleanup试剂盒获得获得上游同源臂lacI-up片段、下游同源臂lacI-dn片段、Donor DNA Ptrp2启动子片段和T7RNAP基因片段和pTargetF-lacI::T7RNAP线性化片段。pTargetF-lacI::T7RNAP线性化片段还经Dpn I37℃酶切1h来消除模板质粒。按照Ready-to-Use SeamlessCloning Kit说明书将pTargetF-lacI::T7RNAP线性化片段、上游同源臂lacI-up片段、下游同源臂lacI-dn片段、Donor DNA Ptrp2启动子片段和T7RNAP片段进行连接反应，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pTD-lacI::T7RNAP质粒。
(2)ECT/pCas菌株感受态细胞制备：将ECT/pCas菌株接种于5mL LB试管(含Kan50mg/L)中，30℃振荡培养过夜，按1％接种量将试管种子液转接于50mL LB摇瓶(Kan终浓度50mg/L)30℃培养至OD600为0.3时添加L-阿拉伯糖至终浓度10～20mM，30℃继续培养至OD600为0.6。4000rpm、4℃离心10min收集菌体细胞，采用CaCl2法进行制备获得ECT/pCas菌株感受态细胞。
(3)转化：将约800～1200ng pTD-lacI::T7RNAP质粒化转100μL ECT/pCas菌株感受态细胞中，42℃热激90s后立即加入1mL LB培养基，30℃孵育2～3h后涂布含50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB双抗平板，30℃倒置培养15～24h。从双抗平板中挑取单菌落以lacI-up-F1/lacI-dn-R1引物对进行菌落PCR验证，以野生型大肠杆菌MG1655菌液为阴性对照，结果筛选获得扩增条带大小为4235bp的阳性菌落，阴性对照扩增条带大小为1857bp，阳性菌扩增产物测序确认T7RNAP表达盒编辑成功，获得ECM01菌株。
(4)消除pTargetF质粒：将筛选获得的阳性菌落接种于含50mg/L卡那霉素的5mLLB试管中，30℃培养2～4h后添加IPTG至终浓度为0.5mM继续培养过夜；过夜诱导培养菌液划线于卡那霉素LB抗性平板，30℃倒置培养15～24h分离单菌落，随后挑取单菌落同时划线于卡那霉素盒壮观霉素平板，30℃倒置培养过夜，筛选能在卡那霉素平板上生长而不能在壮观霉素平板上生长的单菌落(pTD-lacI::T7RNAP质粒成功消除)。
(5)消除pCas质粒：将消除pTD-lacI::T7RNAP质粒的单菌落接种于5mL LB试管中，37℃培养过夜，次日用接种环取一环过夜培养菌液于LB平板上划线，置于37℃培养箱倒置过夜培养分离单菌落，挑取单菌落分别划线于LB平板(无抗性)和卡那霉素平板，30℃恒温培养7～12h，筛选在无抗平板上生长而不能在卡那霉素平板上不能生长的菌落，说明pCas质粒成功消除，构建获得无质粒ECM01菌株。
二、支路基因敲除及合成通路关键酶的增强表达
DNA结合转录抑制因子IclR通过和乙醛酸循环操纵子aceBAK的启动子区结合从而阻碍了RNA聚合酶的结合，进而关闭了乙醛酸循环。为了打开乙醛酸循环实现增加前体物质草酰乙酸的累积的目的，进行敲除iclR基因。另外，在敲除iclR基因的同时，进行敲入源于谷氨酸棒状杆菌的CglysCS301Y基因，由T7启动子调控，实现增强四氢嘧啶合成途径天冬氨酸激酶的表达。
1、敲除iclR基因和增强表达CglysC基因
(1)pET32a-CglysCS301Y质粒构建：以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组为模板，用CglysC-F/CglysC-R引物对进行PCR扩增获得CglysC基因片段；以pET32a(+)质粒为模板，用32a-F/32a-R为引物对进行PCR扩增获得线性化pET32a载体片段，扩增产物经Clean up试剂盒回收，线性化pET32a片段再用Dpn I在37℃恒温酶切1h。按照Ready-to-Use SeamlessCloning Kit说明书将pET32a线性化片段和CglysC片段进行连接反应，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布氨苄抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pET32a-CglysC质粒。
CglysC基因定点突变：利用CglysC-F1/CglysC-R1引物对以pET32a-CglysC质粒为模板进行反向PCR扩增获得pET32a-CglysC线性化片段(CglysC蛋白序列第301位由S突变位Y)，扩增产物经Clean up试剂盒回收，回收产物再用Dpn I在37℃恒温酶切1h，酶切产物经Clean up试剂盒回收后直接化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布氨苄抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证序列正确的pET32a-CglysCS301Y质粒。
(2)pTD-iclR::CglysCS301Y质粒构建：以pTargetF质粒为模板，以pT-iclR::CglysC-F/pT-iclR::CglysC-R为引物对进行PCR扩增，扩增产物经Clean up试剂盒回收后再用Dpn I在37℃恒温酶切1h。酶切产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养阳性转化子，测序验证获得序列正确的pTargetF-iclR::CglysC质粒。
以Ecoli MG1655基因组为模板，利用iclR-up-F/iclR-up-R引物对扩增获得DonorDNA的上游同源臂iclR-up片段；用iclR-dn-F/iclR-dn-R引物对扩增获得Donor DNA的下游同源臂iclR-dn片段。以pET32a-CglysCS301Y质粒为模板，用iclR::CglysC-F、iclR::CglysC-R引物对扩增获得Donor DNA CglysCS301Y表达盒片段。以pTargetF-iclR::CglysC质粒为模板，用pTargetF-line-F/pTargetF-line-R引物对扩增获得pTargetF-iclR::CglysC质粒的线性化片段。用Clean up试剂盒获得获得上游同源臂iclR-up片段、下游同源臂iclR-dn片段、Donor DNA CglysCS301Y表达盒片段和pTargetF-iclR::CglysC线性化片段。Donor DNACglysCS301Y表达盒片段和pTargetF-iclR::CglysC线性化片段还经Dpn I 37℃酶切1h来消除模板质粒。按照Ready-to-Use Seamless Cloning Kit说明书将pTargetF-iclR::CglysC线性化片段、上游同源臂iclR-up片段、下游同源臂iclR-dn片段和Donor DNA CglysCS301Y表达盒片段进行连接反应，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pTD-iclR::CglysCS301Y质粒。
(3)ECM01/pCas菌株感受态细胞制备：将ECM01/pCas菌株接种于5mL LB试管(含Kan50mg/L)中，30℃振荡培养过夜，按1％接种量将试管种子液转接于50mL LB摇瓶(Kan终浓度50mg/L)30℃培养至OD600为0.3时添加L-阿拉伯糖至终浓度10～20mM，30℃继续培养至OD600为0.6。4000rpm、4℃离心10min收集菌体细胞，采用CaCl2法进行制备获得ECM01/pCas菌株感受态细胞。
(4)转化：将约800～1200ng pTD-iclR::CglysCS301Y质粒化转100μL ECM01/pCas菌株感受态细胞中，42℃热激90s后立即加入1mL LB培养基，30℃孵育2～3h后涂布含50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB双抗平板，30℃倒置培养15～24h。从双抗平板中挑取单菌落以iclR-up-F1/iclR-dn-R1引物对进行菌落PCR验证，以野生型大肠杆菌MG1655菌液为阴性对照，结果筛选获得扩增条带大小为2938bp的阳性菌落，阴性对照扩增条带大小为1890bp，阳性菌扩增产物测序确认CglysCS301Y表达盒编辑成功，获得ECM02菌株。
(5)消除pTargetF质粒：将筛选获得的阳性菌落接种于含50mg/L卡那霉素的5mLLB试管中，30℃培养2～4h后添加IPTG至终浓度为0.5mM继续培养过夜；过夜诱导培养菌液划线于卡那霉素LB抗性平板，30℃倒置培养15～24h分离单菌落，随后挑取单菌落同时划线于卡那霉素盒壮观霉素平板，30℃倒置培养过夜，筛选能在卡那霉素平板上生长而不能在壮观霉素平板上生长的单菌落(pTD-iclR::CglysCS301Y质粒成功消除)。
(6)消除pCas质粒：将消除pTD-iclR::CglysCS301Y质粒的单菌落接种于5mL LB试管中，37℃培养过夜，次日用接种环取一环过夜培养菌液于LB平板上划线，置于37℃培养箱倒置过夜培养分离单菌落，挑取单菌落分别划线于LB平板(无抗性)和卡那霉素平板，30℃恒温培养7～12h，筛选在无抗平板上生长而不能在卡那霉素平板上不能生长的菌落，说明pCas质粒成功消除，构建获得无质粒ECM02菌株。
2、敲除thrA基因和增强表达CgAsd基因
由于thrA基因编码的高丝氨酸脱氢酶I能够催化L-天冬氨酸-β-半醛生成L-高丝氨酸，导致L-天冬氨酸-β-半醛向分支代谢产物苏氨酸和赖氨酸和蛋氨酸的支路代谢。通过敲除thrA基因使代谢流更多的流向四氢嘧啶合成路径。在敲除thrA基因的同时，进行敲入源于谷氨酸棒状杆菌的天冬氨酸半醛脱氢酶CgAsd，由T7启动子调控，来增强四氢嘧啶合成路径中L-天冬氨酸半醛的合成能力。
(1)pET32a-CgAsd质粒构建：以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组为模板，用CgAsd-F/CgAsd-R引物对进行PCR扩增获得CgAsd基因片段；以pET32a(+)质粒为模板，用32a-F/32a-R为引物对进行PCR扩增获得线性化pET32a载体片段，扩增产物经Clean up试剂盒回收，线性化pET32a片段再用Dpn I在37℃恒温酶切1h。按照Ready-to-Use SeamlessCloning Kit说明书将pET32a线性化片段和CgAsd片段进行连接反应，连接产物化转E.coliDH5α感受态细胞中，涂布氨苄抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pET32a-CgAsd质粒。
(2)pTD-thrA::CgAsd质粒构建：以pTargetF质粒为模板，以pT-thrA::CgAsd-F/pT-thrA::CgAsd-R为引物对进行PCR扩增，扩增产物经Clean up试剂盒回收后再用Dpn I在37℃恒温酶切1h。酶切产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养阳性转化子，测序验证获得序列正确的pTargetF-thrA::CgAsd质粒。
以Ecoli MG1655基因组为模板，利用thrA-up-F/thrA-up-R引物对扩增获得DonorDNA的上游同源臂thrA-up片段；用thrA-dn-F/thrA-dn-R引物对扩增获得Donor DNA的下游同源臂thrA-dn片段。以pET32a-CgAsd质粒为模板，用thrA::CgAsd-F/thrA::CgAsd-R引物对扩增获得Donor DNA CgAsd表达盒片段。以pTargetF-thrA::CgAsd质粒为模板，用pTargetF-line-F/pTargetF-line-R引物对扩增获得pTargetF-thrA::CgAsd质粒的线性化片段。用Clean up试剂盒获得获得上游同源臂thrA-up片段、下游同源臂thrA-dn片段、Donor DNA CgAsd表达盒片段和pTargetF-thrA::CgAsd线性化片段。Donor DNA CgAsd表达盒片段和pTargetF-thrA::CgAsd线性化片段还经Dpn I 37℃酶切1h来消除模板质粒。按照Ready-to-Use Seamless Cloning Kit说明书将pTargetF-thrA::CgAsd线性化片段、上游同源臂thrA-up片段、下游同源臂thrA-dn片段和Donor DNA CgAsd表达盒片段进行连接反应，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pTD-thrA::CgAsd质粒。
(3)ECM02/pCas菌株感受态细胞制备：将ECM02/pCas菌株接种于5mL LB试管(含Kan50mg/L)中，30℃振荡培养过夜，按1％接种量将试管种子液转接于50mL LB摇瓶(Kan终浓度50mg/L)30℃培养至OD600为0.3时添加L-阿拉伯糖至终浓度10～20mM，30℃继续培养至OD600为0.6。4000rpm、4℃离心10min收集菌体细胞，采用CaCl2法进行制备获得ECM02/pCas菌株感受态细胞。
(4)转化：将约800～1200ng pTD-thrA::CgAsd质粒化转100μL ECM02/pCas菌株感受态细胞中，42℃热激90s后立即加入1mL LB培养基，30℃孵育2～3h后涂布含50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB双抗平板，30℃倒置培养15～24h。从双抗平板中挑取单菌落以thrA-up-F1/thrA-dn-R1引物对进行菌落PCR验证，以野生型大肠杆菌MG1655菌液为阴性对照，结果筛选获得扩增条带大小为2938bp的阳性菌落，阴性对照扩增条带大小为1890bp，阳性菌扩增产物测序确认CgAsd表达盒编辑成功，获得ECM03菌株。
(5)消除pTargetF质粒：将筛选获得的阳性菌落接种于含50mg/L卡那霉素的5mLLB试管中，30℃培养2～4h后添加IPTG至终浓度为0.5mM继续培养过夜；过夜诱导培养菌液划线于卡那霉素LB抗性平板，30℃倒置培养15～24h分离单菌落，随后挑取单菌落同时划线于卡那霉素盒壮观霉素平板，30℃倒置培养过夜，筛选能在卡那霉素平板上生长而不能在壮观霉素平板上生长的单菌落(pTD-thrA::CgAsd质粒成功消除)。
(6)消除pCas质粒：将消除pTD-thrA::CgAsd质粒的单菌落接种于5mL LB试管中，37℃培养过夜，次日用接种环取一环过夜培养菌液于LB平板上划线，置于37℃培养箱倒置过夜培养分离单菌落，挑取单菌落分别划线于LB平板(无抗性)和卡那霉素平板，30℃恒温培养7～12h，筛选在无抗平板上生长而不能在卡那霉素平板上不能生长的菌落，说明pCas质粒成功消除，构建获得无质粒ECM03菌株。
3、ppc基因的增强表达
为进一步增强关键前体草酰乙酸的合成能力，通过将ppc基因自身启动子置换为强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)来达到增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达。
(1)pTD-Pppc::Ptrp2质粒构建：以pTargetF质粒为模板，以pT-Pppc::Ptrp2-F/pT-Pppc::Ptrp2-R为引物对进行PCR扩增，扩增产物经Clean up试剂盒回收后再用Dpn I在37℃恒温酶切1h。酶切产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养阳性转化子，测序验证获得序列正确的pTargetF-Pppc::Ptrp2质粒。
以Ecoli MG1655基因组为模板，利用Pppc-up-F/Pppc-up-R引物对扩增获得DonorDNA的上游同源臂Pppc-up片段；用Pppc-dn-F/Pppc-dn-R引物对扩增获得Donor DNA的下游同源臂Pppc-dn片段。以pUC57-Ptrp2质粒为模板，用Ptrp2-F1/Ptrp2-R1引物对扩增获得Donor DNA Ptrp2启动子片段。以pTargetF-Pppc::Ptrp2质粒为模板，用pTargetF-line-F/pTargetF-line-R引物对扩增获得pTargetF-Pppc::Ptrp2质粒的线性化片段。用Clean up试剂盒获得获得上游同源臂Pppc-up片段、下游同源臂Pppc-dn片段、Donor DNA Ptrp2片段和pTargetF-Pppc::Ptrp2线性化片段。Donor DNA Ptrp2启动子片段和pTargetF-Pppc::Ptrp2线性化片段还经Dpn I 37℃酶切1h来消除模板质粒。按照Ready-to-Use SeamlessCloning Kit说明书将pTargetF-Pppc::Ptrp2线性化片段、上游同源臂Pppc-up片段、下游同源臂Pppc-dn片段和Donor DNA Ptrp2启动子片段进行连接反应，连接产物化转E.coliDH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养，菌落PCR筛选的阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pTD-Pppc::Ptrp2质粒。
(2)ECM03/pCas菌株感受态细胞制备：将ECM03/pCas菌株接种于5mL LB试管(含Kan50mg/L)中，30℃振荡培养过夜，按1％接种量将试管种子液转接于50mL LB摇瓶(Kan终浓度50mg/L)30℃培养至OD600为0.3时添加L-阿拉伯糖至终浓度10～20mM，30℃继续培养至OD600为0.6。4000rpm、4℃离心10min收集菌体细胞，采用CaCl2法进行制备获得ECM03/pCas菌株感受态细胞。
(3)转化：将约800～1200ng pTD-Pppc::Ptrp2质粒化转100μL ECM03/pCas菌株感受态细胞中，42℃热激90s后立即加入1mL LB培养基，30℃孵育2～3h后涂布含50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB双抗平板，30℃倒置培养15～24h。从双抗平板中挑取单菌落以Ptrp2-yz-F/Pppc-dn-R1引物对进行菌落PCR验证，以野生型大肠杆菌MG1655菌液为阴性对照，结果筛选获得扩增条带大小为1025bp的阳性菌落，阴性对照扩增无条带，阳性菌扩增产物测序确认Ptrp2启动子编辑成功，获得ECM04菌株。
(4)消除pTargetF质粒：将筛选获得的阳性菌落接种于含50mg/L卡那霉素的5mLLB试管中，30℃培养2～4h后添加IPTG至终浓度为0.5mM继续培养过夜；过夜诱导培养菌液划线于卡那霉素LB抗性平板，30℃倒置培养15～24h分离单菌落，随后挑取单菌落同时划线于卡那霉素盒壮观霉素平板，30℃倒置培养过夜，筛选能在卡那霉素平板上生长而不能在壮观霉素平板上生长的单菌落(pTD-Pppc::Ptrp2质粒成功消除)。
(5)消除pCas质粒：将消除pTD-Pppc::Ptrp2质粒的单菌落接种于5mL LB试管中，37℃培养过夜，次日用接种环取一环过夜培养菌液于LB平板上划线，置于37℃培养箱倒置过夜培养分离单菌落，挑取单菌落分别划线于LB平板(无抗性)和卡那霉素平板，30℃恒温培养7～12h，筛选在无抗平板上生长而不能在卡那霉素平板上不能生长的菌落，说明pCas质粒成功消除，构建获得无质粒ECM04菌株。
4、pfkB基因的增强表达
6-磷酸果糖激酶2是糖酵解途径关键的限速酶，为了增强重组工程菌对葡萄糖的利用效率，将pfkB基因自身启动子置换为Ptrp2来达到增强表达的目的。
(1)pTD-PpfkB::Ptrp2质粒构建：以pTargetF质粒为模板，以pT-PpfkB::Ptrp2-F/pT-PpfkB::Ptrp2-R为引物对进行PCR扩增，扩增产物经Clean up试剂盒回收后再用Dpn I在37℃恒温酶切1h。酶切产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养阳性转化子，测序验证获得序列正确的pTargetF-PpfkB::Ptrp2质粒。
以Ecoli MG1655基因组为模板，利用PpfkB-up-F/PpfkB-up-R引物对扩增获得Donor DNA的上游同源臂PpfkB-up片段；用PpfkB-dn-F/PpfkB-dn-R引物对扩增获得DonorDNA的下游同源臂PpfkB-dn片段。以pUC57-Ptrp2质粒为模板，用Ptrp2-F3/Ptrp2-R3引物对扩增获得Donor DNA Ptrp2启动子片段。以pTargetF-PpfkB::Ptrp2质粒为模板，用pTargetF-line-F/pTargetF-line-R引物对扩增获得pTargetF-PpfkB::Ptrp2质粒的线性化片段。用Clean up试剂盒获得获得上游同源臂PpfkB-up片段、下游同源臂PpfkB-dn片段、Donor DNA Ptrp2片段和pTargetF-PpfkB::Ptrp2线性化片段。Donor DNA Ptrp2启动子片段和pTargetF-PpfkB::Ptrp2线性化片段还经Dpn I 37℃酶切1h来消除模板质粒。按照Ready-to-Use Seamless Cloning Kit说明书将pTargetF-PpfkB::Ptrp2线性化片段、上游同源臂PpfkB-up片段、下游同源臂PpfkB-dn片段和Donor DNA Ptrp2启动子片段进行连接反应，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养，菌落PCR筛选的阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pTD-PpfkB::Ptrp2质粒。
(2)ECM04/pCas菌株感受态细胞制备：将ECM04/pCas菌株接种于5mL LB试管(含Kan50mg/L)中，30℃振荡培养过夜，按1％接种量将试管种子液转接于50mL LB摇瓶(Kan终浓度50mg/L)30℃培养至OD600为0.3时添加L-阿拉伯糖至终浓度10～20mM，30℃继续培养至OD600为0.6。4000rpm、4℃离心10min收集菌体细胞，采用CaCl2法进行制备获得ECM04/pCas菌株感受态细胞。
(3)转化：将约800～1200ng pTD-PpfkB::Ptrp2质粒化转100μL ECM04/pCas菌株感受态细胞中，42℃热激90s后立即加入1mL LB培养基，30℃孵育2～3h后涂布含50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB双抗平板，30℃倒置培养15～24h。从双抗平板中挑取单菌落以Ptrp2-yz-F/PpfkB-dn-R1引物对进行菌落PCR验证，以野生型大肠杆菌MG1655菌液为阴性对照，结果筛选获得扩增条带大小为995bp的阳性菌落，阴性对照扩增无条带，阳性菌扩增产物测序确认Ptrp2启动子编辑成功，获得ECM05菌株。
(4)消除pTargetF质粒：将筛选获得的阳性菌落接种于含50mg/L卡那霉素的5mLLB试管中，30℃培养2～4h后添加IPTG至终浓度为0.5mM继续培养过夜；过夜诱导培养菌液划线于卡那霉素LB抗性平板，30℃倒置培养15～24h分离单菌落，随后挑取单菌落同时划线于卡那霉素盒壮观霉素平板，30℃倒置培养过夜，筛选能在卡那霉素平板上生长而不能在壮观霉素平板上生长的单菌落(pTD-PpfkB::Ptrp2质粒成功消除)。
(5)消除pCas质粒：将消除pTD-PpfkB::Ptrp2质粒的单菌落接种于5mL LB试管中，37℃培养过夜，次日用接种环取一环过夜培养菌液于LB平板上划线，置于37℃培养箱倒置过夜培养分离单菌落，挑取单菌落分别划线于LB平板(无抗性)和卡那霉素平板，30℃恒温培养7～12h，筛选在无抗平板上生长而不能在卡那霉素平板上不能生长的菌落，说明pCas质粒成功消除，构建获得无质粒ECM05菌株。
三、多拷贝四氢嘧啶合成基因簇ectABC增强重组菌合成四氢嘧啶的能力
通过在底盘细胞基因组上进行多拷贝ectABC，以增强ectABC的表达量来提高重组菌合成四氢嘧啶的能力。
1、ectABC基因簇的增强表达(第二个拷贝)
(1)pTD-yeep::ectABC质粒构建：以pTargetF质粒为模板，以pT-yeep::ectABC-F/pT-yeep::ectABC-R为引物对进行PCR扩增，扩增产物经Clean up试剂盒回收后再用Dpn I在37℃恒温酶切1h。酶切产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养阳性转化子，测序验证获得序列正确的pTargetF-yeep::ectABC质粒。
以Ecoli MG1655基因组为模板，利用yeep-up-F/yeep-up-R引物对扩增获得DonorDNA的上游同源臂yeep-up片段；用yeep-dn-F/yeep-dn-R引物对扩增获得Donor DNA的下游同源臂yeep-dn片段。以共表达质粒pET32a-ectB+T7-ectAC为模板，用yeep::ectABC-F/yeep::ectABC-R引物对扩增获得Donor DNA ectABC表达盒片段。以pTargetF-yeep::ectABC质粒为模板，用pTargetF-line-F/pTargetF-line-R引物对扩增获得pTargetF-yeep::ectABC质粒的线性化片段。用Clean up试剂盒获得获得上游同源臂yeep-up片段、下游同源臂yeep-dn片段、Donor DNA ectABC表达盒片段和pTargetF-yeep::ectABC线性化片段，Donor DNA ectABC表达盒片段和pTargetF-yeep::ectABC线性化片段还经Dpn I 37℃酶切1h来消除模板质粒。按照Ready-to-Use Seamless Cloning Kit说明书将pTargetF-yeep::ectABC线性化片段、上游同源臂yeep-up片段、下游同源臂yeep-dn片段和Donor DNAectBAC表达盒片段进行连接反应，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pTD-yeep::ectABC质粒。
(2)ECM05/pCas菌株感受态细胞制备：将ECM05/pCas菌种接种于5mL LB试管(含Kan50mg/L)中，30℃振荡培养过夜，按1％接种量将试管种子液转接于50mL LB摇瓶(Kan终浓度50mg/L)30℃培养至OD600为0.3时添加L-阿拉伯糖至终浓度10～20mM，30℃继续培养至OD600为0.6。4000rpm、4℃离心10min收集菌体细胞，采用CaCl2法进行制备获得ECM05/pCas菌株感受态细胞。
(3)转化：将约800～1200ng pTD-yeep::ectABC质粒化转100μL ECM05/pCas菌株感受态细胞中，42℃热激90s后立即加入1mL LB培养基，30℃孵育2～3h后涂布含50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB双抗平板，30℃倒置培养15～24h。从双抗平板中挑取单菌落以yeep-up-F1/yeep-dn-R1引物对进行菌落PCR验证，以野生型大肠杆菌MG1655菌液为阴性对照，结果筛选获得扩增条带大小为4113bp的阳性菌落，阴性对照扩增条带大小为1527bp，阳性菌扩增产物测序确认ectABC表达盒编辑成功，获得ECM06菌株。
(4)消除pTargetF质粒：将筛选获得的阳性菌落接种于含50mg/L卡那霉素的5mLLB试管中，30℃培养2～4h后添加IPTG至终浓度为0.5mM继续培养过夜；过夜诱导培养菌液划线于卡那霉素LB抗性平板，30℃倒置培养15～24h分离单菌落，随后挑取单菌落同时划线于卡那霉素盒壮观霉素平板，30℃倒置培养过夜，筛选能在卡那霉素平板上生长而不能在壮观霉素平板上生长的单菌落(pTD-yeep::ectABC质粒成功消除)。
(5)消除pCas质粒：将消除pTD-yeep::ectABC质粒的单菌落接种于5mL LB试管中，37℃培养过夜，次日用接种环取一环过夜培养菌液于LB平板上划线，置于37℃培养箱倒置过夜培养分离单菌落，挑取单菌落分别划线于LB平板(无抗性)和卡那霉素平板，30℃恒温培养7～12h，筛选在无抗平板上生长而不能在卡那霉素平板上不能生长的菌落，说明pCas质粒成功消除，构建获得无质粒ECM06菌株。
2、ectABC基因簇的增强表达(第三个拷贝)
(1)pTD-yjiV::ectABC质粒构建：以pTargetF质粒为模板，以pT-yjiV::ectABC-F/pT-yjiV::ectABC-R为引物对进行PCR扩增，扩增产物经Clean up试剂盒回收后再用Dpn I在37℃恒温酶切1h。酶切产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养阳性转化子，测序验证获得序列正确的pTargetF-yjiV::ectABC质粒。
以Ecoli MG1655基因组为模板，利用yjiV-up-F/yjiV-up-R引物对扩增获得DonorDNA的上游同源臂yjiV-up片段；用yjiV-dn-F/yjiV-dn-R引物对扩增获得Donor DNA的下游同源臂yjiV-dn片段。以共表达质粒pET32a-ectB+T7-ectAC为模板，用yjiV::ectABC-F/yjiV::ectABC-R引物对扩增获得Donor DNA ectABC表达盒片段。以pTargetF-yjiV::ectABC质粒为模板，用pTargetF-line-F/pTargetF-line-R引物对扩增获得pTargetF-yjiV::ectABC质粒的线性化片段。用Clean up试剂盒获得获得上游同源臂yjiV-up片段、下游同源臂yjiV-dn片段、Donor DNA ectABC表达盒片段和pTargetF-yjiV::ectABC线性化片段，Donor DNA ectABC表达盒片段和pTargetF-yjiV::ectABC线性化片段还经Dpn I 37℃酶切1h来消除模板质粒。按照Ready-to-Use Seamless Cloning Kit说明书将pTargetF-yjiV::ectABC线性化片段、上游同源臂yjiV-up片段、下游同源臂yjiV-dn片段和Donor DNAectBAC表达盒片段进行连接反应，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性平板培养，菌落PCR筛选获得阳性克隆子通过测序验证获得序列正确的pTD-yjiV::ectABC质粒。
(2)ECM06/pCas菌株感受态细胞制备：将ECM06/pCas菌种接种于5mL LB试管(含Kan50mg/L)中，30℃振荡培养过夜，按1％接种量将试管种子液转接于50mL LB摇瓶(Kan终浓度50mg/L)30℃培养至OD600为0.3时添加L-阿拉伯糖至终浓度10～20mM，30℃继续培养至OD600为0.6。4000rpm、4℃离心10min收集菌体细胞，采用CaCl2法进行制备获得ECM06/pCas菌株感受态细胞。
(3)转化：将约800～1200ng pTD-yjiV::ectABC质粒化转100μL ECM06/pCas菌株感受态细胞中，42℃热激90s后立即加入1mL LB培养基，30℃孵育2～3h后涂布含50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB双抗平板，30℃倒置培养15～24h。从双抗平板中挑取单菌落以yjiV-up-F1/yjiV-dn-R1引物对进行菌落PCR验证，以野生型大肠杆菌MG1655菌液为阴性对照，结果筛选获得扩增条带大小为4145bp的阳性菌落，阴性对照扩增条带大小为1932bp，阳性菌扩增产物测序确认第3个ectABC表达盒编辑成功，获得ECM07菌株。
(4)消除pTargetF质粒：将筛选获得的阳性菌落接种于含50mg/L卡那霉素的5mLLB试管中，30℃培养2～4h后添加IPTG至终浓度为0.5mM继续培养过夜；过夜诱导培养菌液划线于卡那霉素LB抗性平板，30℃倒置培养15～24h分离单菌落，随后挑取单菌落同时划线于卡那霉素盒壮观霉素平板，30℃倒置培养过夜，筛选能在卡那霉素平板上生长而不能在壮观霉素平板上生长的单菌落(pTD-yjiV::ectABC质粒成功消除)。
(5)消除pCas质粒：将消除pTD-yjiV::ectABC质粒的单菌落接种于5mL LB试管中，37℃培养过夜，次日用接种环取一环过夜培养菌液于LB平板上划线，置于37℃培养箱倒置过夜培养分离单菌落，挑取单菌落分别划线于LB平板(无抗性)和卡那霉素平板，30℃恒温培养7～12h，筛选在无抗平板上生长而不能在卡那霉素平板上不能生长的菌落，说明pCas质粒成功消除，构建获得无质粒ECM07菌株。
实施例1所用引物见下表：
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实施例2摇瓶发酵评估四氢嘧啶产量变化
分别将实施例1构建获得的重组菌株ECM01、ECM02、ECM03、ECM04、ECM05、ECM06、ECM07和大肠杆菌MG1655(对照)进行摇瓶发酵评估合成四氢嘧啶的能力，
(1)重组菌株平板活化：使用无菌接种环分别取1环ECM01、ECM02、ECM03、ECM04、ECM05、ECM06、ECM07和大肠杆菌MG1655菌株于LB固体平板上划线，37℃倒置恒温培养15～24h至长出单菌落。
(2)种子菌培养：从活化的LB平板上挑取单菌落(形态圆润规则)接种于含5mL LB液体培养基的试管中，37℃培养恒温振荡培养10～15h。
(3)摇瓶发酵：将培养好的种子液按4％～10％的接种量转接于含50mL发酵培养基的摇瓶中，37℃恒温培养15～24h。
摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖3～8g/L；甘油2～6g/L；酵母粉2～8g/L；玉米浆干粉5～15g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～1g/L，L-苏氨酸0.1～1g/L，其余为水，pH 7.0，121℃灭菌20min。(4)HPLC检测：将摇瓶发酵液经12000rpm离心后收集上清液进行HPLC检测四氢嘧啶的含量，结果显示：重组菌株ECM01、ECM02、ECM03、ECM04、ECM05、ECM06、ECM07和大肠杆菌MG1655摇瓶发酵四氢嘧啶的生成量分别为0.128g/L、0.288g/L、0.475g/L、0.584g/L、0.807g/L、1.452g/L、1.118g/L和0g/L，其中ECM06重组菌株四氢嘧啶的产量最高，将ECM06菌株进行罐上高密度发酵。
(5)HPLC检测方法：
使用流动相将上清稀释100倍,经0.22um微孔过滤膜过滤后待测:使用Agilent1260高效液相色谱仪测定四氢嘧啶,色谱条件：进样量10uL,色谱柱为Waters XBridge C18 4.6*250mm 3.5um色谱柱,柱温25℃,流动相为40mM NaH2PO4+10mM辛烷磺酸钠(磷酸调节pH＝3.0)，缓冲盐：甲醇＝95:5,流速1mL/min,紫外检测波长210nm,出峰时间约10.509min。
实施例3重组菌株ECM06高密度发酵合成四氢嘧啶(30L)
(1)重组菌株斜面活化培养：从-80℃冰箱中取一管保藏的ECM06重组菌甘油管，用接种环取一环菌液于茄形瓶LB斜面上均匀涂布，置于37℃恒温培养箱培养15～20h。
(2)种子罐培养：取适量无菌水于茄形瓶中，用接种环将菌体全部刮起后，轻轻摇动茄形瓶形成菌悬液。将菌悬液全部接种于含3L种子培养基的5L发酵罐中，用25％氨水维持pH在7.0左右，温度37℃，DO维持在20％～40％之间，培养约5～8h。
(3)发酵罐培养：将培养好的种子菌液按照5％转接于含15L发酵培养基的30L发酵罐中，培养温度37℃初始转速200rpm，流加25％氨水维持pH 7.0左右，罐压0.05MPa，通过调整转速、通气量来使溶氧维持在20～40％。当溶氧(DO)和pH同时快速上升时，说明底糖已耗完，先迅速流加葡萄糖补料(400～650g/L)使DO下降至40％以下，再以一定的流加速率维持葡萄糖浓度在10～15g/L，发酵周期为42h。HPLC检测42h发酵液四氢嘧啶生成量为46g/L。
茄子瓶斜面培养基配方：酵母提取粉5g/L；蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，其余为水，pH 7.0左右，121℃灭菌20min。
罐上种子培养基：葡萄糖5～20g/L；甘油3～15g/L；酵母粉2～8g/L；玉米浆干粉5～15g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～1g/L，L-苏氨酸0.1～1g/L，消泡剂适量，其余为水，pH7.0，121℃灭菌20min。
罐上发酵培养基(15L)：葡萄糖10～30g/L；甘油10～30g/L；酵母粉5～20g/L；玉米浆干粉5～20g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～2g/L，L-苏氨酸0.1～2g/L，消泡剂适量，其余为水，pH7.0，121℃灭菌20min。
补料：葡萄糖400g/L～650g/L，115℃灭菌15min。
实施例4重组菌株ECM06高密度发酵合成四氢嘧啶
(1)重组菌株斜面活化培养：从-80℃冰箱中取一管保藏的ECM06重组菌甘油管，用接种环取一环菌液于茄形瓶LB斜面上均匀涂布，置于37℃恒温培养箱培养15～20h。
(2)种子罐培养：取适量无菌水于茄形瓶中，用接种环将菌体全部刮起后，轻轻摇动茄形瓶形成菌悬液。将菌悬液全部接种于含3L种子培养基的5L发酵罐中，用25％氨水维持pH在7.0左右，温度37℃，DO维持在20％～40％之间，培养约5～8h。
(3)发酵罐培养：将培养好的种子菌液按照10％转接于含15L发酵培养基的30L发酵罐中，培养温度37℃初始转速200rpm，流加25％氨水维持pH 7.0左右，罐压0.05MPa，通过调整转速、通气量来使溶氧维持在20～40％。当溶氧(DO)和pH同时快速上升时，说明底糖已耗完，先迅速流加葡萄糖补料(400～650g/L)使DO下降至40％以下，再以一定的流加速率维持葡萄糖浓度在5～10g/L，发酵周期为42h。HPLC检测42h发酵液四氢嘧啶生成量为62g/L。
茄子瓶斜面培养基配方：酵母提取粉5g/L；蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，其余为水，pH 7.0左右，121℃灭菌20min。
罐上种子培养基：葡萄糖5～20g/L；甘油3～15g/L；酵母粉2～8g/L；玉米浆干粉5～15g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～1g/L，L-苏氨酸0.1～1g/L，消泡剂适量，其余为水，pH7.0，121℃灭菌20min。
罐上发酵培养基(15L)：葡萄糖10～30g/L；甘油10～30g/L；酵母粉5～30g/L；玉米浆干粉5～30g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～3.5g/L，L-苏氨酸0.1～3.5g/L，消泡剂适量，其余为水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
补料：葡萄糖450～650g/L，115℃灭菌15min。
实施例5重组菌株ECM06高密度发酵合成四氢嘧啶
(1)重组菌株斜面活化培养：从-80℃冰箱中取一管保藏的ECM06重组菌甘油管，用接种环取一环菌液于茄形瓶LB斜面上均匀涂布，置于37℃恒温培养箱培养15～20h。
(2)种子罐培养：取适量无菌水于茄形瓶中，用接种环将菌体全部刮起后，轻轻摇动茄形瓶形成菌悬液。将菌悬液全部接种于含3L种子培养基的5L发酵罐中，用25％氨水维持pH在7.0左右，温度37℃，DO维持在20％～40％之间，培养约5～8h。
(3)发酵罐培养：将培养好的种子菌液按照15％转接于含15L发酵培养基的30L发酵罐中，培养温度37℃初始转速200rpm，流加25％氨水维持pH 7.0左右，罐压0.05MPa，通过调整转速、通气量来使溶氧维持在20～40％。当溶氧(DO)和pH同时快速上升时，说明底糖已耗完，先迅速流加葡萄糖补料(400～650g/L)使DO下降至40％以下，再以一定的流加速率维持葡萄糖浓度在2～8g/L，发酵周期为48h。发酵过程间隔取样检测OD600和四氢嘧啶的生成量，HPLC检测结果显示发酵44h发酵液四氢嘧啶生成量达到最高为78g/L。
茄子瓶斜面培养基配方：酵母提取粉5g/L；蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，其余为水，pH 7.0左右，121℃灭菌20min。
罐上种子培养基：葡萄糖5～20g/L；甘油3～15g/L；酵母粉2～8g/L；玉米浆干粉5～15g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～1g/L，L-苏氨酸0.1～1g/L，消泡剂适量，其余为水，pH7.0，121℃灭菌20min。
罐上发酵培养基(15L)：葡萄糖10～30g/L；甘油10～30g/L；酵母粉5～30g/L；玉米浆干粉5～50g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～5g/L，L-苏氨酸0.1～5g/L，消泡剂适量，其余为水，pH7.0，121℃灭菌20min。
补料：葡萄糖500～650g/L，115℃灭菌15min。
以上所述仅为本发明专利的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明专利的保护范围内。

Claims (11)

1.一株高产四氢嘧啶的基因重组菌株，其特征在于，所述高产重组菌株是以野生型大肠杆菌MG1655为宿主细胞，进一步包括：在所述宿主细胞基因组上多拷贝异源表达来自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的ectABC基因簇表达盒，利用强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控来源于T7噬菌体的RNA聚合酶(T7RNAP)，同时结合双T7启动子用于调控ectABC的高效表达；所述重组菌株包括对iclR和thrA两个基因进行敲除，在敲除iclR和thrA基因的同时对应敲入由T7启动子调控来源于谷氨酸棒状杆菌的L-天冬氨酸激酶(CglysCS301Y)基因和L-天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(CgAsd)基因；用Ptrp2启动子替换ppc基因和pfkB基因的启动子。
2.如权利要求1所述的基因重组菌株，其特征在于，所述ectABC基因簇表达盒包含的ectA、ectB和ectC的核苷酸序列依次为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；所述ectABC基因簇表达盒由双T7启动子调控，即为T7-ectB+T7-ectAC-T7 terminator；所述强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
3.如权利要求1或2所述的基因重组菌株的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)以大肠杆菌MG1655为出发菌株，重构四氢嘧啶合成途径：
①构建由双T7启动子调控的ectABC表达盒，即T7-ectB+T7-ectAC，敲入基因组lacZ基因位点表达；
②构建由强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控T7RNAP表达盒，即Ptrp2-T7RNAP，敲入基因组lacI基因位点表达；
(2)四氢嘧啶合成途径支路基因的敲除及关键基因的增强表达：
①敲除iclR基因打开乙醛酸循环实现草酰乙酸的累积，同时在iclR基因位点敲入CglysCS301Y表达盒，即T7-CglysCS301Y；
②敲除thrA基因阻断L-天冬氨酸-β-半醛流向支路代谢，同时在thrA位点敲入CgAsd表达盒，即T7-CgAsd；
③替换ppc基因启动子为Ptrp2；
④替换pfkB基因启动子为Ptrp2；
(3)ectABC的增强表达：
在yeep基因位点敲入ectABC表达盒的第二个拷贝。
4.一种权利要求1或2所述的基因重组菌株摇瓶发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤(1)重组菌株平板活化：使用无菌接种环取重组菌株于LB固体平板上划线，倒置恒温培养至长出单菌落；
步骤(2)种子菌培养：从步骤(1)活化的LB平板上挑取单菌落(形态圆润规则)接种于含LB液体培养基的试管中，恒温振荡培养；
步骤(3)摇瓶发酵：将步骤(2)培养好的种子液按4％～10％的接种量转接于发酵培养基的摇瓶中，进行恒温培养。
5.如权利要求4所述的方法，优选的，在步骤(1)中，倒置恒温培养温度为37℃，培养时间为15～24h；在步骤(2)中，恒温振荡培养温度为37℃，时间为10～15h；在步骤(3)中，恒温培养温度为37℃，时间为15～24h；在步骤(3)中，获得的重组菌ECM06进行冷冻保藏于甘油管中，保藏温度为-80℃至-70℃。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖3～8g/L；甘油2～6g/L；酵母粉2～8g/L；玉米浆干粉5～15g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～1g/L，L-苏氨酸0.1～1g/L，其余为水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
7.一种权利要求1或2所述的基因重组菌株发酵罐发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，发酵罐发酵生产四氢嘧啶的步骤具体如下：
步骤(a)重组菌株斜面活化培养：取一管保藏的ECM06重组菌，用接种环取一环菌液于茄形瓶LB斜面上均匀涂布，置于恒温培养箱培养；
步骤(b)种子罐培养：取适量无菌水于茄形瓶中，用接种环将步骤(a)菌体全部刮起后，轻轻摇动茄形瓶形成菌悬液。将菌悬液全部接种于含种子培养基的发酵罐中，维持pH在7.0左右；
步骤(c)发酵罐培养：将培养好的种子菌液按照15％转接于含发酵培养基的发酵罐中，葡萄糖为底物，pH 7.0左右，发酵过程中检测DO值和pH值，发酵生产四氢嘧啶。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述茄子瓶LB斜面培养基配方：酵母提取粉5g/L；蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，其余为水，pH 7.0左右，121℃灭菌20mi，所述恒温培养箱温度为37℃，培养时间为15～20h；
步骤(b)中，用25％氨水维持pH在7.0左右；优选的，将所述菌悬液全部接种于含种子培养基的发酵罐中，维持pH在7.0左右，温度37℃，溶解氧(DO)维持在20％～40％之间，培养约5～8h。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，用25％氨水维持pH在7.0左右；将所述菌悬液全部接种于含种子培养基的发酵罐中，维持pH在7.0左右，温度37℃，溶解氧(DO)维持在20％～40％之间，培养约5～8h，所述罐上种子培养基组成：葡萄糖5～20g/L；甘油3～15g/L；酵母粉2～8g/L；玉米浆干粉5～15g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～1g/L，L-苏氨酸0.1～1g/L，消泡剂适量，其余为水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述发酵罐培养：所述培养温度37℃初始转速200rpm，流加25％氨水维持pH 7.0左右，罐压0.05MPa，通过调整转速、通气量来使溶氧维持在20～40％，当溶氧(DO)和pH同时快速上升时，流加葡萄糖补料，所述葡萄糖补料浓度500～650g/L，115℃灭菌15min，DO下降至40％以下，再以一定的流加速率维持葡萄糖浓度在2～8g/L，发酵周期为48h。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述发酵培养基组分：葡萄糖10～30g/L；甘油10～30g/L；酵母粉5～30g/L；玉米浆干粉5～50g/L；柠檬酸0.5～5g/L；磷酸二氢钾1～3g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸亚铁2～10mg/L；硫酸锰10～30mg/L，L-蛋氨酸0.1～5g/L，L-苏氨酸0.1～5g/L，消泡剂适量，其余为水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
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