MXPA03009345A - El microoganismo del cual el gen fadr tuvo expresion bloqueada en el cromosoma y un procedimiento para producir l-treonina mediante fermentacion con el mismo mutante. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un microorganismo de produccion de L-treonina caracterizado porque el gen fadR presente en el cromosoma del microorganismo ha sido bloqueado en cuanto a expresion y un metodo para producir L-treonina utilizando dicho microorganismo mutado; el microorganismo mutado de la presente invencion incrementa la produccion de L-treonina.

Description

EL MICROORGANISMO DEL CUAL EL GEN fadR TUVO EXPRESION BLOQUEADA EN EL CROMOSOMA Y UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-TREONINA MEDIANTE FERMENTACION CON EL MISMO MUTANTE ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un microorganismo que produce L-treonina y un procedimiento para producir L-treonina mediante fermentación con el mismo microorganismo. Más particularmente, se dirige a un microorganismo mutado con la capacidad de producir altamente L-treonina en donde el gen fadR presente en el cromosoma del microorganismo ha sido presentado "con expresión bloqueada" al utilizar un sistema de recombinación homólogo de sitio específico como el gen ere y sitio loxp de manera que la expresión del operón aceBAK no se reprime parcialmente mediante la biosíntesis de L-treonina, y a un procedimiento para producir L-treonina mediante fermentación con dicho mutante.

DESCRIPCION DE LA TECNICA ANTERIOR La L-treonina es un tipo de aminoácido esencial y se utiliza ampliamente como alimento y aditivos alimenticios y también como material farmacéutico y materia prima para sintetizar algunos fármacos. Se ha producido mediante fermentación con mutantes artificiales del género Escherichla, Coryneform bacteria, Seratia y Providencia. Por ejemplo, la solicitud de patente japonesa No. S56-10037 describe un método para producir L-treonina utilizando una cepa que pertenece al género Escherichia que tiene un requerimiento nutricional para el ácido diaminopimérico y metionina y tiene la resistencia a la inhibición de retroalimentación por medio de treonina y un sistema biosintético de treonina. La solicitud de patente japonesa abierta al público No. S58-224684 describe un método para producir L-treonina utilizando una cepa que pertenece al género Brevibacteríum que es resistente a S-(2-aminoetil)-L-cisteína y ácido a-amino-ß-hidroxi valérico y tiene requerimiento nutricional para L-isoleucina y L-lisina. La solicitud de patente coreana abierta al público No. 87-8022 describe un método para producir L-treonina utilizando una cepa resistente al ácido -amino-p-hidroxi valérico que requiere metionina, que pertenece al género Escherichia que tiene una resistencia adicional a al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en rifampicina, lisina, metionina, ácido aspártico, y homoserina y tiene una capacidad reducida de descomponer la L-treonina. La solicitud de patente japonesa abierta al público No. H2-219582 describe un método para producir L-treonina utilizando una cepa que pertenece al género Providencia que es resistente al ácido a-amino-p-hidroxi vaiérico, L-etionina, tioisoleucina, oxitiamina, y sulfaguanidina y tiene un requerimiento nutricional para la L-leucina y también un requerimiento permeable para L-isoleucina. Sin embargo, los métodos conocidos anteriores se oponen a los inconvenientes ya que no logran proporcionar una alta producción de L-treonina o deben agregarse sustancias costosas para requerimientos nutricíonales tales como ácido diaminopimérico e isoleucina. En otras palabras, el uso de cepas que requieren ácido diaminopimérico incluye una fermentación adicional de ácido diaminopimérico y de este modo puede cargar costo en producción de L-treonina. En el caso en donde una cepa que tiene un requerimiento nutricional para isoleucina se utiliza para la producción de L-treonina, isoleucina costosa debe agregarse al medio de fermentación, lo cual incrementa el costo. En un intento por superar estos inconveniente, los inventores de la presente desarrollaron una cepa que produce L-treonina de Escheríchia coli que es resistente a los análogos de L-metionina, L-treonina y L-lisina y ácido a-amino butírico y tiene un requerimiento nutricional para la metionina y un requerimiento permeable para isoleucina y se produjo de manera exitosa L-treonina mediante fermentación con la cepa en alto rendimiento en comparación con las cepas anteriores. La cepa y un método para producir L- treonina utilizando dicha cepa fue una patente otorgada a través de la solicitud de patente coreana No. 92-8365. Los inventores de la presente se han mantenido estudiado el desarrollo de una cepa con la capacidad de producir L-treonina en un rendimiento más incrementado y se han enfocado en el gen fadR, factor regulador para expresión del operón relacionado con la descomposición de ácido graso (operón fad) y operón de derivación de glioxilato (operón aceBAK). Se sabe que la proteína FadR reprime la expresión del operón fad y el operón aceBAK cuando la concentración del ácido graso en una célula es elevado, mientras incrementa la expresión del operón relacionado con la biosíntesis de ácido grado cuando la concentración de ácido graso en la célula es bajo (J. E. Cronan Jr. y D. Lapore, E. coli y Salmonella, vol 1 , pp 21 1-214). El operón aceBAK se somete a biosíntesis de oxaloacetato a partir de piruvato que implica la conversión de isocitrato, intermedio del ciclo de ácido cítrico (ciclo TCA), en glioxilato, de glioxilato en malato, y de malato en oxaloacetato. Mientras tanto, el ciclo de ácido cítrico se somete a la biosíntesis de oxaloacetato a partir de piruvato a través de 8 (ocho) trayectorias y, durante el procedimiento, los intermediarios se convierten en otros intermediarios metabólicos que incluyen dióxido de carbono. En este contexto, si la expresión del operón aceBAK disminuye, entonces el ciclo de glioxilato se inhibe para incrementar una velocidad de conversión de fuente de carbono en otros intermediarios metabólicos a través del ciclo de ácido cítrico, que da como resultado una producción disminuida de L-treonina contra cantidades idénticas de fuente de carbono. Por lo tanto, para desarrollar una cepa con la capacidad de producir una alta concentración de L-treonina al incrementar la expresión de aceBAK, es necesario bloquear la expresión del gen fadR. Además, en caso de que se integre el marcador antibiótico en el cromosoma, el marcador no puede utilizarse de nueva cuenta para bloquear la expresión de otro gen. De esta manera se requiere remover el marcador del cromosoma, y los inventores de la presente aplican los sistemas de recombinación de sitio-específico cre/loxp, para bloquear la expresión del gen fadR.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los inventores de la presente han desarrollado una cepa capaz de producir altamente L-treonina al bloquear la expresión del gen fadR en su cromosoma y han obtenido de manera exitosa rendimiento notablemente mejorado de L-treonina mediante fermentación con dicha cepa. En el primer aspecto, la presente invención provee un microorganismo de producción de L-treonina en donde el gen fadR presente en el cromosoma de microorganismo ha sido bloqueado en cuanto a su expresión.

En el segundo aspecto, la presente invención provee un método para producir un microorganismo de producción de L-treonina que comprende construir un cartucho con expresión bloqueada del gen fadR o fragmento de ADN del mismo, introduciendo en la construcción en el microorganismo de producción de L-treonina de referencia de manera que la recombinación ocurre entre la construcción extraña y el gen fadR presente en el cromosoma del microorganismo, y seleccionando un microorganismo mutado en donde el gen fadR ha sido bloqueado en cuanto a su expresión. En el tercer aspecto, la presente invención provee un procedimiento para producir L-treonina mediante la fermentación que comprende cultivar el microorganismo en donde el gen fadR presente en el cromosoma del microorganismo ha sido bloqueado en cuanto a su expresión, y purificando la L-treonina del cultivo. En el cuarto aspecto, la presente invención provee un cartucho con expresión bloqueada del gen fadR o fragmento de ADN del mismo construido al insertar un marcador antibiótico flanqueado mediante el sitio loxp en ambos extremos del gen fadR, y el sitio loxp es utilizado para remover el marcador antibiótico del cromosoma de mutantes integrados al expresar el gen ere que codifica para la recombinasa de sitio-específico loxp.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra una construcción de plásmido recombinante pT7Blue/fadR de la presente invención. La figura 2 muestra una construcción del fragmento de ADN AfadR::loxpcat de plásmido recombinante pT7fadR::loxpcat. La figura 3 muestra una recombinación cromosomal del gen fadR de la presente invención mediante análisis Southern blot.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION De acuerdo con la presente invención, el microorganismo utilizado para la fermentación se caracteriza por la expresión bloqueada del gen fadR, factor regulador para expresión del operón fad y del operón aceBAK. Específicamente, la presente invención utiliza el microorganismo mutado para la producción de L-treonina mediante fermentación, en donde el gen fadR presente en el cromosa del microorganismo ha sido bloqueado en cuanto expresión mediante recombinación homologa de manera que la expresión del operón aceBAK no se reprime mediante la proteína fadR y procede favorablemente durante biosíntesis de L-treonina. Algunos microorganismos procarióticos y eucarióticos con la capacidad de producir L-treonina pueden ser utilizados por la presente invención. Ejemplos representativos de microorganismos apropiados incluyen, pero no se limitan a, cepas mutadas que pertenecen al género Escheríchia, Coryneform bacteria, Seratia y Procidencia que han sido utilizados para producir L-treonina mediante fermentación en la técnica anterior. En una modalidad preferida de la presente invención, los microorganismos incluyen, pero no se limitan a, cepa de producción de L-treonina de Escheríchia coli que es resistente a los análogos de L-metionina, L-treonina y L-lisina y ácido a-aminobutiríco y tiene un requerimiento nutricional para metionina y un requerimiento permeable para isoleucina. En otra modalidad preferida de la presente invención, los microorganismos incluyen mutantes en los cuales, además de los genes intrínsecos que codifican para la fosfoenol piruvato carboxilasa (ppc) y enzimas incluidas en el operón de treonina, al menos una copia del gen seleccionado del gen ppc exógeno, y los genes thrA, thrB y thrC incluidos en el operón de treonina han sido introducidos adicionalmente en el ADN cromosomal. Una expresión bloqueada del gen fadR presente en el cromosoma del microorganismo productor de L-treonina puede lograrse mediante una técnica de mutación con expresión bloqueada apropiada conocida por los expertos en la técnica. "Mutación con expresión bloqueada" como se utiliza en la presente se refiere a un rompimiento técnicamente diseñado in vitro de ADN cromosomal puro, típicamente dentro de una región que codifica una proteína, de manera que una pieza extraña de ADN convenientemente pero no necesariamente proveyendo un marcador seleccionable dominante se inserte dentro de la secuencia pura. Una mutación con expresión bloqueada dentro de una región que codifica una proteína evita la expresión de la proteína tipo silvestre, que generalmente conduce a la pérdida de la función provista por la proteína. El procedimiento de expresión bloqueada puede llevarse a cabo al mezclar un cartucho con expresión bloqueada con un cultivo de microorganismo productor de L-treonina competente para captación de ADN. Aunque el microorganismo se transforma naturalmente, se prefiere que las células puedan ser competentes para la captación de ADN mediante cualquier método adecuado (véase por ejemplo, LeBlanc et.al. Plasmid 28, 130-145, 1992; Pozzi et al. J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996). Un "cartucho con expresión bloqueada" se refiere a un fragmento de ADN cromosomal puro que tiene una pieza de ADN extraña que puede proveer un marcador seleccionable. En una modalidad los "cartuchos de mutación con expresión bloqueada" se crean al interrumpir un fragmento de ADN genómico con una pieza extraña de ADN, y reemplazando la copia cromosomal de tipo silvestre de la secuencia con el cartucho con expresión bloqueada. En esta modalidad, el protocolo de expresión bloqueada implica clonar una pieza de ADN extraña en un ADN objetivo de manera que los "extremos" que comprenden el sitio de ADN objetivo permanezcan en los extremos 5' y 3' del cartucho con expresión bloqueada. Los extremos deben ser al menos 50 pares base y preferiblemente más de 200 a 500 pares bases para recombinación eficiente y/o conversión del gen. Por conveniencia, el ADN extraño clonado en el ADN objetivo también provee un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen de resistencia antibiótica. En donde se interrumpe el ADN objetivo con un gen de resistencia al antibiótico, la selección de los transformantes se lleva a cabo en placas de agar que contienen niveles adecuados de un antibiótico apropiado. Después de la transformación, una fracción de las células que han recogido el cartucho con expresión bloqueada sufrirán recombinación homologa o conversión de gen a través de los extremos de ADN genómico del cartucho, dando como resultado el reemplazo de la secuencia genómica de tipo silvestre, mediante el cartucho con expresión bloqueada. Los casos de recombinación con expresión bloqueada se confirman fácilmente mediante, por ejemplo, hibridación de Southern blot, o más convenientemente mediante PCR. En una modalidad, una mutación con expresión bloqueada de la presente invención comprende los siguientes procedimientos. Se aisla el ADN genómico de la cepa que es capaz de producir la L-treonina y PCR se realiza de conformidad con técnicas convencionales utilizando el ADN genómico como un molde para amplificar el gen fadR. El producto de PCR así obtenido, el gen fadR se clona en un plásmido adecuado u otros vectores y el vector recombinante resultante se introduce mediante la transducción en una célula hospedero tal como E. Colí. Después de que crece el transformante para proliferar en el medio de cultivo, el vector recombinante que tiene los genes fadR se extrae. El fragmento del gen resistente al antibiótico se inserta dentro del gen fadR del vector o vectores recombinantes extraídos para ser construidos como un vector recombinante con expresión bloqueada, y el vector recombinante con expresión bloqueada se introduce mediante transformación en una célula hospedero y la célula hospedero se cultiva en un medio de cultivo adecuado. Posteriormente, el vector recombinante propagado se aisla del transformante resultante, y el fragmento del cartucho con expresión bloqueada del gen fadR se obtiene mediante tratamiento de enzima por restricción apropiada. De aquí en adelante, este fragmento se introduce en un hospedero que es capaz de producir L-treonina mediante una técnica convencional tal como electroporación. Como resultado, el hospedero que tiene características de un gen fadR con expresión bloqueada durante el crecimiento repetido se aisla utilizando resistencia al antibiótico y un gen fadR tipo silvestre en el cromosoma del hospedero se reemplaza con un fragmento del gen fadR que comprende el marcador antibiótico. Los expertos en la técnica reconocerán que los cartuchos con expresión bloqueada y los segmentos de ADN de esta invención o fragmentos de los mismos pueden generarse mediante métodos de clonación generales. Los métodos de amplificación de PCR utilizando iniciadores de oligonucleótidos dirigidos a cualquier región adecuada de cualesquiera de las secuencias descritas en la presente se prefieren. Los métodos para amplificación de PCR se conocen ampliamente en la técnica. Véase, por ejemplo, PCR Protocols: A. Guide to Method and Application, Ed. M. Innis et al., Academic Press (1990) o la patente de E.U.A. No. 4,889,818, que se incorpora en la presente por referencia. El PCR comprende ADN genómico, enzimas adecuadas, iniciadores y reguladores de pH, y se lleva a cabo de manera conveniente en un ciclado térmico de ADN (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn. USA). Un resultado de PCR positivo se determina mediante, por ejemplo, la detección de un fragmento de ADN de tamaño apropiado después de la electroforésis en gel de agarosa. En modalidades preferidas, la presente invención utiliza, como microorganismo para producir la L-treonina, cepas de producción de L-treonina de Escherichia coli que son resistentes a los análogos de L-metionina, L-treonina y L-lisina y ácido a-amino butírico y tienen un requerimiento nutricional para metionina y requerimiento permeable para isoleucina. El análogo de L-metionina incluye, pero no se limita a, D,L-etionina, norleucina, a-metilmetionina y L-metionina-D,L-sulfoximina. El análogo de L-treonina incluye, pero no se limita a ácido a-amino-p-hidroxilamonio valérico y D,L-treonina hidroxamato. El análogo de L-lisina incluye, pero no se limita a, S-(2-aminoetil)-L-cisteína y d-metil-L-lisina. En una modalidad especialmente preferida, la presente invención utiliza, como un microorganismo de producción de L-treonina, un mutante novedoso de Escherichia coli KCCM 10236 que tiene un gen fadR bloqueado en cuanto a su expresión en su cromosoma y es capaz de producir L-treonina superior que la cepa de origen KCCM 10236. Este mutante se produjo mediante el cartucho con expresión bloqueada de transformación AfadR::loxpact en Escherichia coli KCCM 10236, que es resistente a los análogos de L-metion¡na, L-treonina y L-I¡sina y ácido a-amino butírico y tiene un requerimiento nutricional para la metionina y un requerimiento permeable para isoleucina, mediante electroporación. El cartucho con expresión bloqueada AfadR::loxpact se segmenta desde la construcción de plásmido recombinante pT7AfadR::loxpact que se deriva de una construcción de plásmido recombinante pT7blue/fadR. El mutante novedoso se designó como Escherichia coli FTR1201 y se depositó en el Korean Culture Center of Microorganisms bajo el número de acceso KCC -10422 el 13 de septiembre del 2002 de conformidad con el tratado de Budapest. Escherichia coli KCCM 10236 se mutó a partir de Escherichia coli KCCM TF4076 (KFCC 10718) que requiere la metionina y tiene resistencia al análogo de L-treonina (por ejemplo, ácido a-amino-p-hidroxi valérico), análogo de L-lisina (por ejemplo, S-(2-aminometil-L-cisteína), análogo de L-isoleucina (por ejemplo, ácido a-amino butírico), análogo de metionina (por ejemplo, etionina) y similares. Escherichia coli KCCM TF4076 se describe en la solicitud de patente coreana No. 92-8365 que se incorpora en su totalidad en la presente por referencia. Escherichia coli KCCM 10236 difiere de Escherichia coli KCCM TF4076 en que posee dos genes fosfoenoilpurivato carboxilasa (ppc) y dos operones de L-treonina (thr). El gen ppc y el operón thr originados de los cromosomas de Escherichia coli KCCM TF4076 se amplificaron mediante la reacción en cadena de polimerasa y se integraron adicionalmente en los cromosomas de Escherichia coli KCCM TF4076 para generar Escherichia coli KCCM 10236. El gen ppc cataliza la formación de oxaloacetato de fosfoenoilpiruvato. Como tal, el fosfoenoilpiruvato es un precursor del oxaloacetato que es un intermediario para la trayectoria biosintética de treonina. Escherichia coli KCCM 10236 es por lo tanto caracterizada porque mejora la expresión del gen ppc y los tres genes implicados en la biosíntesis de treonina de aspartato, thrA, thrB y thrC, que codifican la aspartocinasa l/homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa y treonina sintasa, respectivamente, dando como resultado un incremento de la producción de L-treonina. El ADN genómico se extrae de Escherichia coli KCCM 10236. PCR se realiza utilizando el ADN genómico como modelo para amplificar el gen fadR. Los productos de PCR se cargan en gel de agarosa y se someten a electroforesis. El gen fadR o fragmento de ADN del mismo se aisla de este modo se clona en un vector apropiado. Un fragmento de ADN del gen confiere resistencia a un antibiótico que se inserta dentro de la región del gen fadR del vector recombinante construido para inducir la expresión bloqueada del gen fadR. El cartucho del gen fadR con expresión bloqueada que incluye el fragmento de ADN para resistencia antibiótica se aisla del vector recombinante resultante. El cartucho del gen fadR con expresión bloqueada se transforma en el microorganismo de producción de L-treonina tal como Escheríchia coli KCCM 10236 mediante métodos convencionales tales como electroporación para producir una cepa mutada con la capacidad de producir altamente L-treonina. Como se utiliza en la preparación del gen o fragmentos de fadR con expresión bloqueada de los mismos, ei término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar el gen fadR extraño o fragmento de ADN del mismo al cual se une e introduce el gen de fadR o fragmento de ADN en las células hospedero. Ejemplos del vector son plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos originados de fuentes naturales o recombinantemente sintetizados. La producción de L-treonina al utilizar el microorganismo de producción de L-treonina mutada de la presente invención, en donde el gen fadR presente en el cromosoma del microorganismo ha sido bloqueado en cuanto a expresión, puede llevarse a cabo por un método ordinario para células hospedero de cultivo tales como bacterias y levadura. Como el medio utilizado para la producción de L-treonina, cualquier medio sintético y medio natural puede emplearse siempre que contenga de manera apropiada fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sustancias inorgánicas y cantidades traza de nutrientes que la sepa requiere. Ejemplos de las fuentes de carbono incluyen carbohidratos tales como glucosa, fructosa, lactosa, molasas, hidrolizado de celulosa, hidrolizado de azúcar cruda e hidrolizado de almidón, ácidos orgánicos tales como ácido purúvico, ácido acético, ácido fumárico, ácido málico y ácido láctico, y alcoholes tales como glicerina y etanol. Ejemplos de las fuentes de nitrógeno incluyen amoníaco, varias sales inorgánicas (tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio), sales de amonio de ácidos orgánicos, aminas, peptona, extracto de carne, solución de infusión de maíz, hidrolizado de caseína, hidrolizado de torta de soya, varias células fermentadas y materias digeridos de los mismos. Ejemplos de las sustancias inorgánicas incluyen dihidrogenfosfato de potasio, dihidrogenfosfato de dipotasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, cloruro de calcio y carbonato de calcio. El cultivo se lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas, por ejemplo, al agitar el cultivo o cultivo giratorio bajo ventilación. La temperatura de cultivo se encuentra en la escala de 20 a 40°C, preferiblemente 28 a 37°C. El pH del medio se encuentra en la escala de un pH de 5 a 9, preferiblemente alrededor de la neutralidad. El ajuste de pH se lleva a cabo al utilizar carbonato de calcio, un ácido orgánico o inorgánico, una solución alcalina, amoníaco, o un regulador de pH, etc. Generalmente, la L-treonina se forma y se acumula en el cultivo durante 1 a 7 días de cultivo. Un procedimiento opcional para cultivo incluye, por ejemplo, cualquier operación continua, operación semi-continua y operación en lotes.

Después de que se completa el cultivo, se precipita de manera que las células se remuevan, del cultivo, y la L-treonina pueda recuperarse del cultivo por medio de cromatografía de intercambio iónico, concentración, precipitación añadiendo sal, etc. en combinación. Por ejemplo, la recuperación de L-treonina del caldo de cultivo se lleva a cabo mediante el siguiente método. El caldo de cultivo a partir del cual se remueven las células se ajusta a un pH 2 con ácido clorhídrico. Posteriormente la solución del caldo se hace pasar a través de la resina de intercambio iónico fuertemente ácida, y el adsorbente se eluye mediante amoníaco acuoso diluido. El amoníaco se evapora y posteriormente la solución resultante se condensa. Se agrega alcohol al concentrado, y posteriormente los cristales formados bajo enfriamiento se recolectan, y posteriormente se obtiene la L-treonina. La presente invención se explicará ahora con base en algunos ejemplos específicos, sin embargo no se consideran limitantes.

EJEMPLQ1 Construcción de plásmido recombinante y expresión bloqueada del gen fadR El ADN genómico se extrajo a partir de KCCM 10236 de cepa Escherichia coli de producción de treonina al utilizar el sistema QIAGEN Genomic-tip. El fragmento de ADN (aproximadamente 0.8 kb) que incluye ORF (estructura de lectura abierta) del gen fadR se amplificó mediante PCR utilizando el ADN genómico extraído como un modelo y un par de oligonucléotidos 5'-TCG CGG AAG AGT ACA TTA TTG-3' (iniciador directo) y 5' -ATC GGC GCA AAG AAG TCC-3' (iniciador reverso). Se realizó PCR por medio de 30 ciclos, cada uno consistiendo en desnaturalización durante 30 segundos a 94°C, alineamiento durante 30 segundos a 55°C y extensión durante 60 segundos a 72°C en orden. El producto PCR se cargó en un gel de agarosa al 1.0% y se sometió a electroforesis. La banda del gen fadR de 0.8 kb se cortó del gel y se eluyó. El gen fadR resultante se ligó al sitio EcoRV del vector de clonación pT7Blue (Novagen Inc., USA) durante la noche a la temperatura de 16°C para construir el plásmido recombinante pT7Blue/fadR (véase Fig.1 ). La construcción de plásmido resultante se transformó en Escheríchia coll NM522. La cepa transformada se colocó en placas en un medio sólido que contiene 50 mg/l de carbenicilina y se cultivó durante la noche a una temperatura de 37°C. Las colonias formadas se recogieron con un bucle de platino y se inocularon en 3 mi de un medio líquido que contiene carbenicilina. Después de cultivo durante la noche, los ADN plásmidos se extrajeron del cultivo utilizando el equipo QIAGEN Mini Prep. El extracto de ADN plásmido se digirió con una enzima Sacll de restricción y se confirmó la clonación del gen fadR. El plásmido confirmado pT7Blue/fadR se segmentó con Sacll y los fragmentos de ADN formados de esta manera se hicieron correr en un gel de agarosa al 0.8%. Una banda de alrededor de 3.8 kb se cortó del gel y se eluyó. El fragmento de ADN de 3.8 kb tenía extremos rasurados mediante el tratamiento de la enzima Kienow. El fragmento de ADN resultante se unió con extremos rasurados con alrededor de un fragmento de 1.1 kb del gen para resistencia al cloranfenicol incluyendo la región loxp, que se obtuvo al digerir el plásmido ploxpcat2 (Gosset et al, una familia de cartuchos desprendibles designados para obtener modificaciones genómicas libres de resistencia a Ab de E. col, Gene 247, pp255-264) con enzima de restricción Hincll, para construir un plásmido recombinante pT7AfadR::loxpcat de alrededor de 5.0 kb (véase figura 2). Escherichia coli NM522 se transformó con el plásmido recombinante pT7AfadR::loxcap. El transformante resultante se pasó rápido en una placa de medio sólido que contiene 50 mg/l de carbenicilina y 15 mg/l de cloranfenicol y se cultivó durante la noche a 32°C. Las colonias formadas se recogieron con un bucle de platino y se inocularon en 3 mi de medio líquido que contiene carbenicilina y cloramfenicol. Después del cultivo durante la noche, los ADN plásmidos se extrajeron utilizando el equipo QIAGEN Mini Prep. El extracto de ADN plásmido se digirió con Kpnl y enzimas de restricción Pstl y fragmentos de ADN formados así se hicieron correr sobre el gel de agarosa al 0.7%. Una banda de aproximadamente 2.2 Kb se cortó del gel y se eluyó (véase figura 2). El fragmento de ADN resultante, aproximadamente 2.2 kb, AfadR::loxpcat se transformó en Escherichia coli KCCM 10236 mediante electroporación y el Escherichia coli KCCM 10236 transformado se pasó rápido en un medio de agar que contiene cloranfenicol. Las colonias seleccionadas se experimentaron en su producción de L-treonina en un matraz.

EJEMPLO 2 Producción de L-treonina en un matraz Erlenmeyer mediante cepas seleccionadas Treinta colonias seleccionadas en el ejemplo 1 se cultivaron en un matraz Erlenmeyer al cual se cargó un medio de titulación de treonina que se da en el cuadro 1 a continuación, y se comparó la producción de L-treonina.

CUADRO 1 Cada colonia se cultivó en un medio de agar LB en una incubadora de agitación a 32°C. Un bucle de platino del cultivo se inoculó en 25 mi de medio de titulación y se agitó el cultivo a 32°C y 250 rpm durante 48 horas. Los resultados de la titulación se dan en el cuadro 2 a continuación.

CUADRO 2 Puede observarse de los resultados que los transformantes de la presente invención producen alrededor de 24-25 g/L de L-treonina. Por lo tanto, el Escheríchia coli KCCM 10236 transformado de la presente invención en donde el gen fadR se bloqueó en cuanto expresión mejoró sobre la cepa prototipo KCCM 10236 que produce 23 g/L de L-treonina. Además, se observó que los microorganismos transformados de la presente incrementaron la salida de L-treonina en el medio de fermentación hasta alrededor de 8% en comparación con la cepa prototipo. Un transformante entre los mismos se designó como Escheríchia coli FTR 20 (KCCM 10422).

EJEMPLO 3 Confirmación de la expresión bloqueada del gen fadR mediante Southern Blotting Se realizó un Southern blot para confirmar si el gen fadR había sido bloqueado en cuanto a expresión en las cepas seleccionadas en el ejemplo 2. La cepa prototipo KCCM 0236 y las cepas presentes FTR 1201 se cultivaron durante la noche en 3 mi de medio líquido que contiene cloranfenicol. El ADN genómico se extrajo del cultivo utilizando un equipo QIAGEN Genomic. El ADN genómico extraído durante la noche se segmentó con una enzima de restricción Xmml. Una electroforesis se realizó sobre gel de agarosa al 0.7% para separar los fragmentos de ADN resultante en cuanto a tamaño. Después de terminar la electroforesis, las moléculas de ADN en el gel de agarosa se transfirieron a la membrana de nilón. (YOUNG Sci. Biodyne B Membrane) utilizando un método de transferencia capilar (Molecular Cloning vol. 1. pp6. 31-6.38) I membrana se secó y posteriormente las moléculas de ADN se inmovilizaron en la membrana seca mediante irradiación de UV (120 mJ/cm2, SpectroLinker™). La membrana se trató con solución de prehibridación I (Roche #1093657) a 55°C durante 2 horas. Después de la adición de la sonda de ADN desnaturalizada, se realizó la hibridación durante la noche en un horno a 55°C (BAMBINO 230300). La sonda de ADN desnaturalizada utilizada se preparó de la siguiente manera. El plásmido aislado ploxpcat2 se digirió con una enzima de restricción Hincll utilizando un equipo QIAGEN para obtener un fragmento de ADN de alrededor de 1.1 kb del gen para resistencia al cloramfenicol que incluye la región loxp. El fragmento de ADN resultante se calentó en agua a 100°C durante 5 minutos y pronto se enfrió en hielo durante 5 minutos para dar una molécula de ADN con una sola rama que se marcó DIG a 37°C utilizando un marcado DIG y equipo de detección (Roche #1093657) para producir la sonda de ADN marcada con DIG-UDP. Después de terminar la hibridación, las moléculas de ADN hibridadas de manera no específica en la membrana se removieron utilizando soluciones de lavado I y II (Roche #1093657). La membrana se enmascaro con la solución reguladora de pH de prehibridación 2 (Roche #1093657) a temperatura ambiente durante 30 minutos y se hizo reaccionar con un anticuerpo anti-DIG, que se une específicamente a DIG-UTP, a temperatura ambiente durante 30 minutos. El anticuerpo anti-DIG unido de manera no específica en la membrana se removió con la solución de lavado III (Roche #1093657) y la membrana se cromatizó con al etiqueta anterior y el equipo de detección (Roche #1093657) para mostrar la banda. Las imágenes se exploraron utilizando un sistema de imagen FLA-5000 (FUJIFLIM). Los resultados se dan en la figura 3. La cepa de prototipo KCCM 10236 (campo 3) no mostró bandas ya que no posee el gen para resistencia a cloramfenicol. Como contraste, la cepa de la presente FTR1201 (KCCM 10422) (campo 2) mostró una banda de alrededor de 2.8 kb como se esperaba. Se entiende que la banda consiste en una porción de 1.7 kb del gen fadR y alrededor de 1.1 kb del fragmento de ADN del gen para resistencia al cloramfenicol.

EJEMPLO 4 Producción de L-treonina en un fermentador La producción de L-treonina mediante la cepa de la presente FTR1201 (KCCM-10422) en un fermentador de 5 L se comparó con esa mediante la cepa prototipo KCCM 10236. Los contenidos del medio inoculo se muestran en el cuadro 3 a continuación.

CUADRO 3 Un medio LB complementado con 10 g/L de glucosa y 0.1 g/L de L-metionina se utilizó para el cultivo de semilla. El volumen inoculo inicial en el fermentador se ajustó de 3% a 5% del volumen de cultivo inicial. La glucosa se añadió seis veces cada una en su punto de depleción. Después de cada adición, la concentración de glucosa fue del 5%. En el momento de añadir la glucosa, 1 % en peso del fosfato mono-potásico (KH2P04) también se agregó. Los volúmenes de cultivo iniciales y finales fueron 1.5 L y 3.0 L, respectivamente, y la concentración de glucosa total agregada hasta terminar la fermentación fue de 250 g/L La fermentación se realizó con ventilación de 0.5 vvm y agitación de 1 ,000 rpm a una temperatura de 32°C. El pH se mantuvo a 7.0 mediante una entrada automática proveyendo de 25% a 28% de gas de amonio. Los resultados se dan en el cuadro 4 a continuación.

CUADRO 4 La cepa prototipo 10236 produjo 93.5 g/L de L-treonina como rendimiento al 37.4% a la glucosa consumida. En contraste, la cepa de la presente FTR 201 produjo 102 g/L de L-treonina como rendimiento al 41% a la glucosa consumida y de esta manera incrementó alrededor de 9% del rendimiento de L-treonina en comparación con la cepa prototipo. El microorganismo mutado de producción de L-treonina de la presente invención en donde el gen fadR se bloqueo en cuanto a expresión mejora la producción de L-treonina.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. - Un microorganismo de producción de L-treonina mutado caracterizado porque el gen fadR presente en el cromosoma del microorganismo ha sido bloqueado en cuanto a expresión.

2. - El microorganismo mutado de conformidad con la reivindicación 1 es Escherichia coli.

3. - El microorganismo mutado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque es resistente a los análogos de L-metionina, L-treonina y L-lisina y ácido a-amino butírico y tiene requerimiento nutricional para metionina y un requerimiento permeable para isoleucina.

4. - El microorganismo mutado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es la cepa cuyo ADN cromosonal contiene adicionalmente, al menos una copia de genes, gen ppc, y genes thrA, thrB y thrC incluidos en el operan de treonina.

5. - El microorganismo mutado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque es Escherichia coli FTR 1201 (KCC -10422).

6. - Un método para desarrollar un microorganismo mutado de producción de L-treonina que comprende construir una expresión bloqueada del gen fadR o fragmento de ADN del mismo, introduciendo la construcción de ADN en la cepa de producción de L-treonina de referencia para provocar recombinación homologa entre la construcción de ADN extraña y el gen fadR presente en el cromosoma del microorganismo, y seleccionar el microorganismo mutado en donde el gen fadR ha sido bloqueado en cuanto a expresión. 7.- Un cartucho con expresión bloqueada del gen fadR o fragmento de ADN del mismo caracterizado porque el marcador antibiótico se inserta dentro del gen fadR de manera que se bloquea en cuanto a expresión. 8.- El cartucho de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el fragmento de ADN del gen fadR con expresión bloqueada es AfadR::loxpcat. 9.- Un método para producir L-treonina que comprende cultivar el microorganismo mutado de conformidad con la reivindicación 1 y aislar la L-treonina del cultivo.