KR20040033174A

KR20040033174A - 염색체 상의 ｆａｄＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌생성 변이 미생물과 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법

Info

Publication number: KR20040033174A
Application number: KR1020020062103A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 이진호; 이병춘; 김대철; 조재용
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2004-04-21
Also published as: US20090093030A1; WO2004033671A1; AU2003224490A1; CN100378215C; MXPA03009345A; EP1408123A1; JP2004129666A; ATE442459T1; EP1408123B1; RU2305132C2; JP4309223B2; US20040132145A1; CN1500863A; KR100505797B1; DE60329153D1; RU2005114011A

Abstract

본 발명은 아미노산 L-쓰레오닌을 생성할 수 있는 미생물의 염색체 중에 존재하는fadR유전자가 불활성화되어 있음을 특징으로 하는 아미노산 L-쓰레오닌의 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 변이 미생물은 L-쓰레오닌의 증가된 수율을 제공한다.

Description

염색체 상의 ｆａｄＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 변이 미생물과 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법{A Mutated Microorganism Having A Knockout fadR Gene On Chromosome And A Process For Producing L-Threonine Using Said Mutant}

본 발명은 L-쓰레오닌 생산 미생물과 이를 이용한 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 L-쓰레오닌 생산 미생물의 염색체 상에 존재하는fadR유전자를 불활성화시켜 L-쓰레오닌의 생합성 과정에서 aceBAK 오페론의 발현이 억제되지 않도록 하여 고수율로 L-쓰레오닌을 생성하는 변이 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. L-쓰레오닌은 발효법으로 제조하는데 대장균, 코리네형 세균, 세라티아속 세균, 프로덴시아(Providencia)속 균주의 야생주로부터 유도된 인공변이주를 사용하고 있다. 예를 들면, 일본국 공고특허출원 제10037/81호에는 에스케리키아(Escherichia)속에 속하며 디아미노피메릭산 및 메치오닌을 요구하며, 그의 생합성계가 쓰레오닌의 피이드백 억제작용(feedback inhibition)을 저지하는 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있다. 일본국 공개특허출원 제224684/83호에는 브레비박테리움(Brevihacterium)속에 속하며 S-(2-아미노에칠)-L-시스테인 및α-아미노-β-히드록시 발렉릭산에 대한 내성을 지니며 L-이소루이신 및 L-라이신 영양요구성 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있다. 한국 공개특허출원 제8022/87호에는 에스케리키아속에 속하며 디아미노피메릭산, 메치오닌요구성, α-아미노-β-히드록시발레릭산 내성을 지니며 리팜피신, 라이신, 메치오닌, 아스파르트산 및 호모세린중 최소한 1가지 물질에 대한 내성을 갖거나 또는 저하된 L-쓰레오닌 분해능을 갖는 미생물을 이용한 방법이 기술되어 있다. 일본국 공개특허출원 제219582/90호에는 프로비덴시아(Providencia)속에 속하며 α-아미노-β-히드록시 발레릭산, L-에치오닌, 치아이소루이신(thiaisoleucine), 옥시치아민(oxythiamine) 및 설파구아니딘(sulfaguanidine) 내성을 지니며, L-루이신 요구성, L-이소루이신 리키(leaky)형 요구성 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있다.

그러나 상술한 공지의 방법들은 L-쓰레오닌 생산성이 높지 못하거나 또는 디아미노피메릭산 요구성 또는 이소루이신 요구성과 같은 값비싼 물질들을 첨가해야 하는 단점들이 있다. 즉, 디아미노피메릭산 요구성 균주를 사용할 경우 디아미노피메릭산을 부발효해야 하므로 원가부담 요인이 크며, 이소루이신 요구성 균주를 사용할 경우에도 이소루이신을 발효배지에 첨가하여 주어야 하는데, 이 경우 이소루이신의 가격이 고가이므로 원가상승 요인이 된다.

이러한 문제점을 극복하기 위하여 본 발명자들은 이소루이신 리키(leaky)형 요구성 균주를 사용하여 발효배지내에 이소루이신을 첨가할 필요가 없으며, 라이신 합성의 중간 매체인 디아미노피메릭산 요구성 균주를 사용하지 않으면서도 종래의 균주들보다 발효법에 의해 고농도의 L-쓰레오닌을 생성할 수 있는 균주로서 L-메치오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메치오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티릭산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 에스케리키아 콜리(대장균)에 속하는 미생물을 개발하고 이러한 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 제조방법을 특허받은 바 있다(한국 특허공고 제92-8365호).

본 발명자들은 L-쓰레오닌의 생산 수율을 더욱 높일 수 있는 균주를 개발하기 위하여 계속적으로 연구해 왔고, 지방산 분해 관련 오페론(fad operon)과 글리옥실레이트 우회(bypass) 오페론(aceBAK operon)의 발현 조절인자인fadR유전자를표적으로 하여 L-쓰레오닌의 생산량 향상을 도모하였다. FadR 단백질은 세포 내 지방산 농도가 높을 경우 fad 오페론과 aceBAK 오페론의 발현을 억제하며, 지방산 농도가 낮을 경우 지방산 생합성 관련 오페론의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다(J. E. Cronan Jr, and D. Lapore, E. coli and Salmonella, vol 1, pp211-214). aceBAK 오페론은 시트르산 회로(TCA cycle)의 중간체인 이소시트레이트를 글리옥실레이트로 전환시키고, 글리옥실레이트를 말레이트로 전환시키고, 말레이트는 옥살로아세테이트로 전환시키는 5 단계 반응을 통해 PEP(phosphoenol pyruvate)로부터 옥살로아세테이트를 합성한다. 반면, 시트르산 회로는 8 단계 반응을 통하여 PEP로부터 옥살로아세테이트를 합성하며 이 과정에서 중간체들이 이산화탄소를 포함하여 다른 대사중간체로 전환된다. 따라서 aceBAK 오페론의 발현이 감소하면, 글리옥실레이트 회로반응이 억제되므로 시트르산 회로를 통해 탄소원이 다른 대사중간체로 전환되는 비율이 높아지고, 동량의 탄소원에 대해 쓰레오닌 생산 수율은 감소하게 된다. 또한, 이 과정에서 쓰레오닌 생합성 과정에 효율적인 aceBAK 오페론의 발현까지 억제하게 된다. 따라서 aceBAK 발현을 높여 고농도의 쓰레오닌 생산 균주를 개발하기 위해서는fadR유전자는 필수적으로 불활성화 시켜야 한다.

이에 본 발명자들은 불활성 돌연변이 기술(Knockout Mutation Technology)을 이용하여 L-쓰레오닌 생성 미생물의 염색체 상에 존재하는fadR유전자를 재조합에 의해 불활성화시킴으로써 고농도의 L-쓰레오닌 생성 균주를 개발하고 실질적으로 이 균주를 발효에 이용하여 현저히 증가된 수율로 L-쓰레오닌을 얻을 수 있었다.

따라서, 한 가지 관점으로서, 본 발명은 아미노산 L-쓰레오닌을 생성할 수있는 미생물의 염색체 중에 존재하는fadR유전자가 불활성화되어 있음을 특징으로 하는 아미노산 L-쓰레오닌의 생성용 변이 미생물을 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 불활성화된fadR유전자 또는 이의 DNA 절편을 제조하고 L-쓰레오닌 생성 미생물에 유입시켜 미생물의 염색체 상에 존재하는fadR유전자와 재조합시키고,fadR유전자가 불활성화된 변이 미생물을 선별함을 특징으로 하여, 아미노산 L-쓰레오닌의 생성용 변이 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 아미노산 L-쓰레오닌을 생성할 수 있는 미생물의 염색체 중에 존재하는fadR유전자가 불활성화된 L-쓰레오닌의 생성용 변이 미생물을 배양하고, 배양물로부터 아미노산 L-쓰레오닌을 분리함을 특징으로 하여, 아미노산 L-쓰레오닌을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 미생물의fadR유전자 내부에 항생제 마커를 삽입하여 불활성화된fadR유전자 또는 이의 DNA 절편을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pT7Blue/fadR의 작제도이다.

도 2는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pT7ΔfadR::loxpcat로부터 DNA 절편 ΔfadR::loxpcat를 얻는 작제도이다.

도 3은 본 발명에 따른 불활성화된fadR유전자의 염색체상에서의 재조합을 보여주는 써던 블로팅 분석(Southern blotting analysis) 결과이다.

본 발명은 지방산 분해 관련 오페론(fad operon)과 글리옥실레이트 우회 오페론 (aceBAK operon)의 발현 조절인자인fadR유전자를 표적으로 하여 L-쓰레오닌의 생산량 향상을 특징으로 한다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 불활성화 돌연변이 기술(Knockout Mutation)을 이용하여 L-쓰레오닌 생성 미생물의 염색체 상에 존재하는fadR유전자를 재조합에 의해 불활성화시킴으로써 쓰레오닌 합성 과정에서 aceBAK 오페론의 발현이 fadR 단백질에 의해 방해 받지 않고 원활히 이루어지도록함으로써 L-쓰레오닌의 생산량을 증대시키는 것이다.

이러한 본 발명의 아이디어는 원핵 및 진핵을 포함한 L-쓰레오닌을 생성할 수 있는 모든 미생물에 적용될 수 있으며 대표적인 미생물로는 종래에 L-쓰레오닌을 생성하기 위해 사용되어 온 것으로 대장균, 코리네형 세균, 세라티아속 세균, 프로덴시아 세균 속에 속하는 변이 균주 등을 들 수 있다. 바람직하게는, L-메치오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메치오닌 영양요구성, L-스레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티릭산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균에 속하는 미생물이다. 또 다른 바람직한 미생물 군은 원래의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자와 쓰레오닌 오페론에 함유된 효소 외에 추가로 1 카피 이상의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈 유전자와 쓰레오닌 오페론에 함유된 유전자thrA, thrB및thrC가 염색체 DNA 중에 삽입된 변이 미생물이다.

본 발명에 따라 L-쓰레오닌 생성 미생물의 염색체에 존재하는fadR유전자를 불활성화시키는 방법은 불활성화 돌연변이 기술에 의해 수행될 수 있다. 이 불활성화 돌연변이는 시험관내에서 반드시 필요한 것은 아니지만 편리하게는 우성 선별 마커를 제공하는 외래 DNA 조각이 천연 염색체 DNA의 특정 단백질 암호화 영역내에 삽입되고 그 서열이 불활성화된 것을 가리킨다. 단백질 암호화 영역내에서의 불활성화 돌연변이는 야생형 단백질의 발현을 억제하고 보통 그 단백질에 의해 제공되는 기능을 상실시킨다.

불활성화 절차는 불활성화 유전자 카세트를 균주의 배양물과 혼합하여 수행할 수 있다. 천연적으로 균주는 DNA 유입에 대해 컴피턴트하여 형질전환할 수 있으나 사전에 균주를 적절한 방법에 의해 DNA 유입을 위해 컴피턴트하도록 만드는 것이 바람직하다(참조: LeBlanc et al., Plasmid 28, 130-145, 1992; Pozzi et al., J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996). 불활성화 유전자 카세트는 선별 마커를 제공할 수 있는 외래 DNA 조각이 클로닝된 천연 염색 DNA의 절편을 가리킨다. 불활성화 유전자 카세트는 게놈 DNA의 절편내에 외래 DNA 조각을 도입하고 이 서열의 야생형 염색체 카피를 불활성화 카세트로 치환시킴으로 형성된다. 한 양태로서 불활성화 프로토콜은 표적 부위 DNA를 포함한 "테일"이 불활성화 카세트의 5' 및 3' 말단에 남아 있도록 표적 DNA내로 외래 DNA 조각을 클로닝하는 것을 포함한다. 테일은 적어도 50개의 염기쌍이어야 하고 바람직하게는 효율적인 재조합 및/또는 유전자 전환을 위해 200 내지 500개 염기쌍이어야 한다. 편리상 표적 DNA내로 클로닝된 외래 DNA는 또한 선별 마커, 예를 들면 항생제 내성 유전자를 제공한다. 표적 DNA가 항생제 내성 유전자에 의해 불활성화되는 경우 형질전환체의 선별은 적절한 항생물질이 함유된 한천 평판상에서 실시한다. 형질전환 후 불활성화 카세트가 유입된 세포 분획은 그 카세트의 게놈 DNA 테일을 따라 동종 재조합 또는 유전자 전환을 겪게 되고 결국 야생형 게놈 서열은 불활성화 카세트로 치환된다. 불활성화 재조합이 이루어졌는지의 여부는 예를 들면 써던 블로팅 하이브리드화에 의해 쉽게 확인할 수 있으며, 더욱 편리하게는 PCR에 의해 검증할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명의 불활성화 돌연변이는 다음의 과정을 포함한다. L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 하여 통상적인 기술을 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해fadR유전자를 증폭한다. 이에 따라 얻은fadR유전자를 적합한 플라스미드 또는 기타 벡터내로 클로닝하고 형성된 재조합 벡터를 형질전환에 의해 대장균과 같은 숙주 세포내로 도입한다. 형질전환체를 배양 증식한 후 이들로부터fadR유전자를 갖는 재조합 벡터를 추출한다. 추출된 재조합 벡터내의fadR유전자에 항생제 내성 유전자 절편을 삽입하여fadR유전자가 불활성화된 재조합 벡터를 제작하고 이 재조합 벡터를 위와 같이 형질전환에 의해 숙주 세포내로 도입하고 배양한다. 얻은 형질전환체로부터 증식된 재조합 벡터를 분리하고 적절한 제한효소의 처리에 의해fadR유전자의 불활성화 카세트 절편을 얻는다. 이들 절편을 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 균주에 전기충격법과 같은 통상의 기술에 의해 유입시킨 후 항생제 내성을 이용하여, 항생제 마커를 포함하는fadR유전자의 절편이 염색체 상의 야생fadR유전자와 재조합하여 생장을 거듭해도 계속fadR유전자의 불활성화 특성을 갖는 균주를 분리한다.

당업자는 본 발명의 불활성화 카세트 및 DNA 절편을 일반적인 클로닝 방법에 의해 제조될 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명에 따른fadR유전자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR 증폭 방법이 바람직하다. PCR 증폭 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다(참조: PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis et al., Academic Press (1990)). PCR은 게놈 DNA, 적합한 효소, 프라이머 및 완충액을 포함하고 편리하게는 DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn. USA)에서 실시한다. 양성 PCR 결과는 예를 들면 적절한 크기의 DNA 절편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 검출함으로써 결정한다.

바람직한 양태로서, 본 발명은 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 변이 균주로서 L-메치오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메치오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 α-아미노 부티릭산 내성을 갖는 균주를 사용한다. L-메치오닌 유사체로는 D,L-에치오닌, 노르루이신, α-메칠메치오닌 또는 L-메치오닌-D,L-설폭시민이 포함된다. L-쓰레오닌 유사체로는 α-아미노-β-히드록시 발레릭산 또는 D,L-쓰레오닌 히드록사메이트가 포함된다. L-라이신 유사체로는 S-(2-아미노에칠)-L-시스테인 또는 δ-메칠-L-라이신이 포함된다.

특히 바람직한 양태로서, 본 발명자들은 재조합 플라스미드 pT7blue/fadR 및 pT7fadR::loxpcat를 제작하여 이로부터 불활성화 카세트 ΔfadR::loxpcat를 수득하고 이 절편을 L-메치오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메치오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 α-아미노 부티릭산 내성을 갖는 대장균 KCCM 10236에 전기충격법으로 유입시켜 야생fadR유전자가 불활성화 되어 모균주 KCCM 10236에 비해 고농도의 L-쓰레오닌을 생성하는 신균주를 개발하였다. 이 신균주는 대장균 FTR1201로 명명하였고 2002년 9월 16일에 부다페스트협약하에 국제기탁기관 Korean Culture Center of Microorganisms에 기탁번호 KCCM-10422로 기탁되었다.

본 발명의 신균주는 균주 KCCM 10236으로부터 유도된 것으로 균주 KCCM 10236은 대장균 TF4076으로부터 유도된 것이다. L-쓰레오닌 생산균주인 TF4076(KFCC10718, 한국 특허공고 제92-8365호)는 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체(예, α-아미노-β-하이드록시 발레릭산, AHV)에 대한 내성, 라이신 유사체(예, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인, AEC)에 대한 내성, 이소루이신 유사체(예, α-아미노부티릭에시드) 대한 내성, 메티오닌의 유사체(예, 에티오닌)에 대한 내성 등의 특성을 가지고 있다. 상기 한국특허의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다. L-쓰레오닌을 생산하는데 있어 포스포에놀 피루베이트(phosphoenol pyruvate, PEP)는 쓰레오닌의 대사경로의 중간체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)의 전구체이다. KCCM 10236 균주는 L-쓰레오닌의 생산 균주인 상기 대장균 TF4076의 염색체로부터 중합효소 연쇄반응을 통해 얻은 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈 유전자(phosphoenol pyruvate carboxylase gene,ppc유전자)와 쓰레오닌 오페론(thr operon)을 다시 모균주인 TF4076의 염색체에 삽입시킴으로써 TF4076의 염색체 DNA 중에ppc유전자와 쓰레오닌 오페론의 수를 2개로 증가시켰다. 따라서 KCCM 10236 균주는 PEP로부터 쓰레오닌 생합성의 중간체인 옥살로아세테이트로 전환해 주는 효소인ppc유전자의 발현량과 아스파테이트(aspartate)로부터 쓰레오닌을 합성하는 경로 관련 유전자들(thrA: aspartokinase I-homoserine dehydrogenase,thrB: homoserine kinase,thrC: threonine synthase)의 발현량을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산량을 향상시키는 것을 특징으로 한다.

쓰레오닌 생산균주 KCCM 10236으로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출한다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하여fadR유전자를 증폭한다. PCR 산물을 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분리하고 분리된fadR유전자 또는 이의 절편을 적절한 벡터내로 삽입시킨다. 형성된 재조합 벡터내의fadR유전자에 항생제 내성 유전자 절편을 삽입시켜fadR유전자가 불활성화된 재조합 벡터를 형성한다. 이 재조합 벡터로부터 항생제 내성 유전자 절편을 포함한 불활성된fadR유전자 또는 이의 절편을 분리한다. 분리된 불활성된fadR유전자 또는 이의 절편을 대장균 KCCM 10236과 같은 L-쓰레오닌 생산 균주에 전기충격법과 같은 통상적인 수단에 의해 유입시켜 L-쓰레오닌을 고수율로 생성하는 균주를 수득한다.

본 발명에서 벡터는fadR유전자의 불활성화 카세트 또는 이의 절편을 제조하는 과정에서 외래 DNA를 숙주 세포로 도입하는데 사용되는 핵산 화합물이다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파아지를 들 수 있다.

본 발명에 따라fadR유전자가 불활성화되고 L-쓰레오닌을 생성할 수 있는 본 발명의 변이 균주로부터 L-쓰레오닌을 대량 생산하기 위해 그 균주를 발효시키고, 발효액으로부터 목적하는 L-쓰레오닌을 분리하는 모든 공정은 본 분야 잘 알려져 있다.

본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예 1

재조합 플라스미드 제작과 이를 이용한fadR유전자의 불활성화(knock-out)

게노믹-팁 시스템(QIAGEN Genomic-tip system)을 이용하여 쓰레오닌 생산균주 KCCM 10236 균주로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였고, 이 게놈 DNA 주형(template)으로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여fadR유전자의 ORF(Open Reading Frame)를 포함하는 DNA 절편, 약 0.8kb를 증폭하였다. 사용된 프라이머들은 5'-tcg cgg aag agt aca tta ttg-3'과 5'-atc ggg ggc gca aag aag tcc-3'이며 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초간, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초간, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분간 실시하였고, 30 주기를 수행하였다.

이 PCR 결과물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 0.8kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었고, pT7Blue 클로닝 벡터(Novagen Co.)의 EcoR V에 16℃에서 밤새 연결시켰다(도 1). 이에 따라 형성된 재조합 플라스미드 pT7Blue/fadR를 대장균 NM522에 형질전환시키고 카베니실린(50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 카베니실린이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 Sac II로 처리한 후fadR유전자의 클로닝 여부를 확인하였다. 확인된 플라스미드 pT7Blue/fadR를 제한 효소 Sac II로 처리한 후, 0.8% 아가로즈 겔에서 약 3.8kb 크기의 밴드를 용출하고, 다시 클레노우(Klenow) 효소를 처리하여 평활말단(blunt end)으로 만들었다. 여기에 플라스미드 ploxpcat2 (Gosset et al, A family of removable cassettes designed to obtain Ab-resistance-free genomic modifications ofE. col,Gene 247, pp255-264)를 제한효소 Hinc II로 처리하여 얻은 loxp부분을 포함하는 클로람페니콜 내성 유전자 절편(약 1.1 kb)을 평활말단 연결시켜 재조합 플라스미드 pT7ΔfadR::loxpcat(약 5.0kb)를 얻었다(도 2).

이 재조합 플라스미드 pT7ΔfadR::loxpcat를 NM522에 형질전환시키고, 카베니실린과 클로람페니콜(각각 50 mg/L과 15 mg/L)이 포함된 고체배지에 도말하여 32℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 카베니실린과 클로람페니콜이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이 플라스미드 DNA를 제한효소 Kpn I, Pst I로 처리하여 0.7% 아가로즈 겔에서 약 2.2kb 크기의 DNA 절편 ΔfadR::loxpcat을 용출하였다 (도 2). 이 DNA 절편 ΔfadR::loxpcat을 쓰레오닌 생산균주(KCCM 10236)에 전기충격요법(electroporation)으로 유입하여 클로람페니콜이 포함된 고체배지에 도말한 후 선발한 콜로니에 대하여 플라스크 역가 확인 실험을 수행하였다.

실시예 2

선별 균주에 대한 삼각 플라스크에서 쓰레오닌 생산 역가 비교 실험

항생제 클로람페니콜이 함유된 고체배지에 도말하여 선별한 콜로니 30주를 선발하여 표 1에 나타낸 쓰레오닌 역가배지를 사용하여 삼각 플라스크에서 쓰레오닌 생산성을 비교하였다.

표 1. 쓰레오닌 역가배지

조성물	농도(리터당)
포도당	70g
황산암모늄	28g
KH₂PO₄	1.0g
MgSO₄.7H₂O	0.5g
FeSO₄.7H₂O	5mg
MnSO₄.7H₂O	5mg
탄산칼슘	30g
L-메티오닌	0.15g
효모엑기스	2g
pH (7.0)

32℃의 배양기에서 LB 고체배지 중에 밤새 배양한 단일 콜로니들을 25 ml의 역가배지에 1 백금이씩 접종하여 32℃에서 250rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었으며 콘트롤 균주인 KCCM 10236 균주는 23g/L인 반면fadR유전자가 파괴된 재조합 균주들은 모두가 콘트롤 균주에 비해 우수한 성적을 보였으며, 이들 균주 모두는 비슷하게 약 24-25g/L의 수득율을 보였다. 이 결과를 바탕으로 농도가 콘트롤 균주 대비 약 8% 정도 향상되었음을 관찰하고, 그 중 한 균주를 대장균 FTR1201 (KCCM -10422 )로 명명하였다.

표 2. 재조합 균주들의 플라스크 역가 시험 결과

23g/L	24g/L	25g/L	26g/L
1	23	5	1

실시예 3

써던 블로팅 분석을 이용한fadR유전자의 불활성화 확인 실험

실시예 2에서 선별한 균주의fadR유전자가 특이적으로 재조합되었는 지 여부를 확인하기 위해 써던블로팅 분석을 수행하였다. 콘트롤 균주인 KCCM 10236 균주와 위에서 선별된 FTR1201 (KCCM-10422)균주를 클로람페니콜이 함유된 3ml 액체배지에서 밤새도록 배양한 다음, 게놈 키트(QIAGEN genomic kit 20)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다.

이 게놈 DNA를 제한효소 Xmn I을 이용하여 밤새 절단하고, 0.7% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 DNA 절편의 크기대로 분리하였다. 전기영동이 끝난 겔을 모세관 전달(capillary transfer)(Molecular Cloning vol 1. pp6.31~6.38)방법을 이용하여, DNA를 나이론 막(nylon membrane)(YOUNG Sci. Biodyne B Membrane)에 부착시켰다. 이 막을 건조시킨 다음, UV(120mJ/cm², SpectroLinker^TM)를 조사하여 붙어 있던 DNA를 막에 고정시켰다(Molecular Cloning, vol 1. pp6.45). 이 막을 55℃에서 2시간동안 예비하이브리드화 용액(prehybdization solution I)(Roche #1093657)으로 처리하여 예비하이브리드화시키고, 변성된 DNA 탐침을 넣은 후 55℃로 고정된 하이브리드화 오븐(BAMBINO 230300) 안에서 밤새 하이브리드화시켰다.

위에서 사용한 탐침은 다음과 같이 준비하였다. QIAGEN 키트를 이용하여 분리한 플라스미드 ploxpcat2를 제한효소 Hinc II로 처리하여 loxp 부분을 포함하는 클로람페니콜 내성 유전자 조각(약 1.1 kb)을 얻었다. 이 DNA 조각을 100℃의 끓는 물에서 5분 동안 가열한 후, 곧바로 얼음에서 다시 5분간 냉각하여 일본쇄 DNA로만들었다. 이 DNA를 DIG 표지 및 검출 키트(Roche #1093657)을 사용하여 37℃에서 밤새 반응시켜 DIG-UDP가 끼어 들어간 DNA 탐침을 제조하였다.

하이브리드화가 끝나면 세척 용액 I, II(Roche #1093657)를 이용하여 막에 비특이적으로 부착된 DNA를 제거하였다. 예비하이브리드화 완충액 2(Roche #1093657)를 이용하여 상온에서 30분 동안 막을 마스킹한 후, DIG-UTP에 특이적으로 결합하는 항-DIG 항체를 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 세척 용액 III(Roche #1093657)을 이용하여 비특이적으로 막에 부착되어 있는 항-DIG 항체를 제거하고, 상기 표지 및 검출 키트(Roche #1093657)을 사용하여 밴드가 나타날 때까지 상온에서 발색 반응시켰다. FLA-5000 이미지 시스템(FUJIFLIM)을 사용하여 이미지를 스캐닝하였다. 그 결과는 도 3에 나타낸 바와 같다. 콘트롤 균주인 KCCM 10236 (레인 3)에서는 클로람페니콜 내성 유전자가 없기 때문에 아무 밴드도 나타내지 않았다. 반면, 본 발명에서 선별된 FTR1201(KCCM-10422)균주(레인 2)에서는 예상했던 대로 약 2.8kb 정도의 밴드를 볼 수 있었다. 이는fadR유전자의 일부 1.7kb와 클로람페니콜 내성 유전자 약 1.1kb을 합쳐서 약 2.8kb 크기가 얻어진 것이다.

실시예 4

발효조를 이용한 쓰레오닌 비교시험

실시예 2에서 선별되고 실시예 3에서 유전자 파괴가 확인된 균주 FTR1201(KCCM-10422) 와 KCCM 10236 콘트롤 균주를 사용하여 5L 발효조에서 쓰레오닌 생산성을 비교하여 보았다. 초기 배지 조성은 표 3에 나타내었다. 종균 배양은 LB 배지에 포도당 10g/L와 L-메티오닌을 0.1g/L 되게 첨가해 준 배지를 사용하였고, 발효조의 초기 접종 부피는 초기 배양 부피의 3% 내지 5%에서 조정하였다. 추가당은 6회에 걸쳐 첨가하였으며 추가한 후의 포도당 농도가 5%되게 하였으며 추가시점은 포도당이 고갈된 시점이다. 또한, 포도당을 추가할 때 제일인산칼륨(KH2PO4)을 중량기준으로 1%되게 같이 첨가해주었다. 초기 배양 부피는 1.5L이고 최종 부피는 3.0L이며 발효종료 후 투입된 총 포도당의 농도는 250g/L이었다. 교반속도는 700 내지 1000rpm으로 해주고 pH와 온도는 각각 7.0과 32℃로 맞추어 주었다. 배양 중 pH의 조절은 25 내지 28%의 암모니아수를 사용하였다. 또한, 통기량은 0.5vvm으로 조정하였다.

이 결과는 아래 표 4에 나타나 있다. 콘트롤 균주는 93.5 g/L의 쓰레오닌을 생산하여 소비한 포도당에 대해 37.4%의 수율을 보인 반면 본 발명에 따른 재조합 신균주 FTR1201은 102g/L의 쓰레오닌을 생산하여 41%의 수율을 보임으로써 콘트롤 균주의 농도 대비 9%의 수율 향상을 보여주었다.

표 3. 5리터 발효조의 초기 배지 조성

조성물	농도(리터당)
포도당	50g
KH₂PO₄	4g
(NH₄)₂SO₄	6g
효모엑기스	3g
MgSO₄.7H₂O	2g
L-메티오닌	1g
FeSO₄.7H₂O	40mg
MnSO₄.8H₂O	10mg
CaCl₂.2H₂O	40mg
CoCl₂.6H₂O	4mg
H₃BO₃	5mg
Na₂MoO₄.2H₂O	2mg
ZnSO4.7H₂O	2mg
pH 7.0

표 4. 재조합 신균주의 5리터 발효조에서의 발효 성적

균주명	쓰레오닌 농도 (g/L)	수율(%)
콘트롤 균주	93.5	37.4
FTR1201 신균주	102	41

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에 따라 fadR 유전자가 불활성화된 L-쓰레오닌 생성 미생물은 L-쓰레오닌의 수율을 증대시킨다.

Claims

아미노산 L-쓰레오닌을 생성할 수 있는 미생물의 염색체 중에 존재하는fadR유전자가 불활성화되어 있음을 특징으로 하는 아미노산 L-쓰레오닌의 생성용 변이 미생물.
제1항에 있어서, 미생물이 대장균인 변이 미생물.
제2항에 있어서, 대장균이 L-메치오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메치오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노부티릭산 내성을 가짐을 특징으로 하는 변이 미생물.
제1항에 있어서, 미생물이 원래의 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈 유전자와 쓰레오닌 오페론에 함유된 효소 외에 추가로 1 카피 이상의 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈 유전자와 쓰레오닌 오페론에 함유된 유전자thrA, thrB및thrC가 염색체 DNA 중에 삽입된 균주인 변이 미생물.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 변이 미생물이 대장균 FTR1201(KCCM-10422)인 변이 미생물.
불활성화된fadR유전자 또는 이의 DNA 절편을 제조하고 L-쓰레오닌 생성 미생물에 유입시켜 미생물의 염색체 상에 존재하는fadR유전자와 재조합시키고,fadR유전자가 불활성화된 변이 미생물을 선별함을 특징으로 하여, 아미노산 L-쓰레오닌의 생성용 변이 미생물을 제조하는 방법.
미생물의fadR유전자 내부에 항생제 마커를 삽입하여 불활성화된fadR유전자 또는 이의 DNA 절편.
제7항에 있어서, 불활성화된fadR유전자의 DNA 절편이 ΔfadR::loxpcat인 불활성화된fadR유전자 또는 이의 DNA 절편.
제1항에 따른 변이 미생물을 배양하고, 배양물로부터 아미노산 L-쓰레오닌을 분리함을 특징으로 하여, 아미노산 L-쓰레오닌을 제조하는 방법.