CN114317389B - 一种利用重组大肠杆菌共培养发酵产l-苏氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌共培养发酵产L‑苏氨酸的方法，即利用重组大肠杆菌△bluF+nMagHigh和重组大肠杆菌△bluF+pMagHigh共培养发酵产L‑苏氨酸。本发明中nMagHigh与pMaghigh的表达共培养，对重组菌的生物膜形成有促进作用，对大肠杆菌发酵产L‑苏氨酸有促进作用，同时缩短了发酵周期、实现了细胞的可循环使用，节约了成本。同时本发明是第一次将光遗传学元件Magnet系统应用到基于生物膜固定化发酵产氨基酸当中。

Description

一种利用重组大肠杆菌共培养发酵产L-苏氨酸的方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种利用过表达nMagHigh基因的重组大肠杆菌和过表达pMagHigh基因的重组大肠杆菌共培养发酵产L-苏氨酸的方法。

背景技术

苏氨酸(L-threonine)是人体所必需的八种氨基酸中的之一。苏氨酸在人体内和动物体内不能合成，但是在生命过程中发挥重要的作用。现如今，L-苏氨酸已经成为了继甲硫氨酸、赖氨酸和色氨酸以外第四种重要的氨基酸。在食品产业、医疗制药行业和化妆品行业中L-苏氨酸已被广泛应用，需求量逐年增加。在食品行业中，L-苏氨酸作为一种食品添加剂，主要用作食品强化剂，提高食品中的营养成分，补充被破坏的营养元素，同时，L-苏氨酸用于人们常食用的糕点、乳化食品和牛奶之中，发挥抗氧化作用，并且L-苏氨酸与葡萄糖可以发生反应产生巧克力香味和焦香味道，可以用作食品的增香剂。L-苏氨酸在医疗行业领域中可以存进T淋巴细胞成熟发育，也可以提高人体免疫功能。L-苏氨酸除了是重要的食品强化剂外，也是一种重要的饲料添加剂，主要添加到家禽和猪饲料之中。

光对大肠杆菌生物膜的形成是有影响的。环二鸟苷酸(c-di-GMP)是细菌中形成的第二信使，参与大肠杆菌运动性、生物膜形成、毒力、细胞周期等有关。c-di-GMP由双鸟苷酸环化酶合成，并被磷酸二酯酶降解，这两种酶分别含有GGDEF(Gly-Gly-Asp-Glu-Phe)和EAL(Glu-Ala-Leu)结构域。除了LOV蛋白是蓝光感受器外，还包括光活性黄色蛋白(PYP)和FAD(BLUF)结构域蛋白的蓝光感应器。其中BLUF-EAL蛋白BluF(YcgF)是大肠杆菌的感知蓝光蛋白，在蓝光的作用下，通过双组分信号通路，不仅控制调节大肠杆菌中c-di-GMP浓度，进而控制生物膜调节器CsgD，调节卷曲菌毛的合成，还通过Ymg/Rcs途径控制糖类表面成分colanic acid，调控生物膜的形成和功能。因此，BLUF蛋白在大肠杆菌中，通过蓝光调节转录因子活性，控制大肠杆菌生物膜的形成。

生物膜的扩散是可以通过遗传学以及合成生物学等工具等进行操作。光遗传学通常利用光控制基因的表达、调控蛋白质与蛋白质之间的相互作用、启动系统等。光遗传学工具和传统化学方法相比，操作简单便捷，实现了高时空控制，具有可编程性，可调性等。目前，各种光遗传学工具在不同模式生物中的应用已经成为一大研究热点。其中光遗传学元件Magnet系统的应用引起了研究人员的关注，它是由两种不同的活性蛋白变体组成，一种带正电，一种带负电，分别指定为正磁铁(pMag)和负磁铁(nMag)，这两种蛋白质通过静电作用相互结合，提供了具有选择性和可逆性的光诱导异二聚化，并通过磁铁系统操纵细胞功能，例如蛋白质-蛋白质的相互作用与基因组编辑。因此，本发明提供了一种利用过表达nMagHigh与pMagHigh基因的重组大肠杆菌的构建方法及应用。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供三株不同的重组大肠杆菌。

微生物的发酵过程与生物膜的形成密切相关。近年来，有研究人员发现，光对大多数微生物的生活方式存在影响，光遗传学工具的有效使用也成为微生物研究中的一大热点。然而，蓝光对大肠杆菌生物膜的形成存在抑制作用，进而减少大肠杆菌的发酵产量。L-苏氨酸发酵已在单批次游离发酵中进行，发酵后不能重复使用的模式。批量发酵和一次性使用细胞会增加操作成本并降低生产率。同时，分散在发酵培养基中的游离细胞在有氧发酵过程中受到应力条件(例如剪切力)的挑战，导致在发酵过程中细胞活力降低。基于生物膜的固定发酵具有更高的代谢活性以及细胞重复利用以达到节约成本。因此，本发明还要解决的技术问题是提供一种发酵产L-苏氨酸的方法。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株重组大肠杆菌，即在出发菌中敲除bluF基因，即为重组大肠杆菌△bluF。

本发明还公开了第二种重组大肠杆菌，即在出发菌中敲除bluF基因，过表达nMagHigh基因，即为重组大肠杆菌△bluF+nMagHigh。

本发明还公开了第三种重组大肠杆菌，即在出发菌中敲除bluF基因，过表达pMagHigh基因，即为重组大肠杆菌△bluF+pMagHigh。

其中，所述出发菌均为大肠杆菌。

其中，所述bluF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其中，所述nMagHigh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

其中，所述pMagHigh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种发酵产L-苏氨酸的方法，L-苏氨酸是人体最重要的氨基酸之一，它的需求是由于其在食品，化学和制药行业的广泛应用而急剧增加。目前，微生物发酵已广泛用于工业以大肠杆菌为最佳候选菌株生产L-苏氨酸。

其中，所述方法为利用上述重组大肠杆菌△bluF+nMagHigh和上述重组大肠杆菌△bluF+pMagHigh共培养发酵产L-苏氨酸。

其中，所述重组大肠杆菌△bluF+nMagHigh和所述重组大肠杆菌△bluF+pMagHigh分别按照2％～8％的体积比接入到发酵培养基中。

其中，所述发酵为固定化发酵，所述固定化发酵过程中，载体的用量优选为10～50g/L发酵培养基，进一步优选为30g/L发酵培养基。

其中，所述发酵的温度为30～44℃。

其中，所述发酵为在波长为450～480nm、光照度为400～600lux的蓝光下进行发酵。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)本发明构建了一株敲除bluF基因的重组大肠杆菌，实验结果表明，bluF基因的敲除解除了蓝光对大肠杆菌生物膜形成的抑制，同时对菌株的生长能力、发酵能力没有产生影响，并将蓝光影响生物膜形成相关基因进行验证。同时，本发明是第一次将大肠杆菌感应蓝光基因进行敲除，解除蓝光对大肠杆菌生物膜形成的抑制，探究其在生物膜形成中的应用，为后续光遗传学工具的利用奠定了基础。

(2)本发明在W1688-BluF菌株的基础上构建了两株过表达nMagHigh与pMagHigh基因的重组大肠杆菌，实验结果表明，nMagHigh与pMaghigh的表达共培养，对重组菌的生物膜形成有促进作用，对大肠杆菌发酵产L-苏氨酸有促进作用，同时缩短了发酵周期、实现了细胞的可循环使用，节约了成本。同时本发明是第一次将光遗传学元件Magnet系统应用到基于生物膜固定化发酵产氨基酸当中。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为sgRNA与Donor DNA的构建。

图2为大肠杆菌W1688-pCas的构建。

图3为bluF敲除的电泳结果。

图4为敲除菌株△bluF在无抗LB平板以及含有Kan的LB平板的生长结果。

图5为结晶紫染色结果。

图6为结晶紫染色读数结果。

图7为DAPI染色的结果。

图8为Swarming。

图9为RT-qPCR的结果。

图10为原始菌W1688和△bluF菌株的生长曲线。

图11为原始菌W1688和敲除菌△bluF游离发酵产L-苏氨酸的发酵周期。

图12为构建重组的表达pET28a-EGFP-nMagHIgh质粒示意图。

图13为构建重组的表达pET28a-mcherry-pMagHIgh质粒示意图。

图14为提取质粒pET28a-EGFP与pET28a-mcherry。

图15为重组质粒的转化pET28a-EGFP-nMagHigh与pET28a-mcherry-pMagHigh。

图16为菌落PCR验证。

图17为荧光吸附实验。

图18为SEM载体电镜。

图19为固定化连续发酵。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明中所述敲除菌株△bluF、△bluF、bluF敲除菌株、E.coli W1688-bluF、W1688-bluF所表达的含义相同，均指敲除菌株△bluF。

本发明中所述△bluF+nMagHigh、E.coli W1688-bluF+EGFP、△bluF+EGFP+nMagHigh所表达的含义相同，均指敲除△bluF，且过表达nMagHigh的重组菌株。

本发明中所述△bluF+pMagHigh、E.coli W1688-bluF+mcherry+pMagHigh、△bluF+mcherry+pMagHigh所表达的含义相同，均指敲除△bluF，且过表达pMagHigh的重组菌株。

实施例1构建bluF敲除菌株△bluF

1、提取质粒

(1)将E.coli DH5α甘油菌(含质粒pTarget与pCas)接于液体LB(卡那抗性浓度：50μg/mL)，37℃培养12小时；

(2)收集上一步骤所培养的细胞，离心，去上清；

(3)依照Takara质粒提取试剂盒，提取出质粒pTarget与pCas。

2、制备W1688化学感受态

(1)将大肠杆菌W1688划线培养后，在液体LB中进行活化；

(2)取活化好的菌液1mL转接100mL液体LB，培养至OD600约为0.6后，分装菌液，冷却至0℃，离心，弃上清；

(4)每管加入预冷的0.1M的氯化钙5mL重悬细胞，插入冰中冷却20min，然后4℃、4000rpm离心10min，弃去上清；

(5)重复步骤(4)，插入冰中静置30min；

(6)加入2.5mL 0.1M预冷的氯化钙和2.5mL 30％预冷的甘油轻轻重悬细胞后置于冰上5min；

(7)分装至无菌的1.5mL离心管，每管100μL。

3、将pCas质粒导入大肠杆菌W1688

(1)取10μL pCas质粒加入到100μL冰上解冻的大肠杆菌W1688化学感受态中，混匀后于冰上静置30min；

(2)42℃水浴热激90s，冰中冷却2min；

(3)加入900μL无抗液体LB，30℃摇菌1h；

(4)5000rpm离心6min，弃800μL上清，剩余液体重悬菌体，涂于LB固体平板(Kan 50μg/mL)，30℃倒置培养12h；

(5)挑取Kan平板上的单菌落提质粒，酶切验证，酶切体系：1μL XbaI、1μL XhoI、7μL质粒、1μL 10×QuickCut Buffer，37℃反应1h；pCas质粒12545bp，质粒条带大小正确，大肠杆菌W1688-pCas菌株构建成功，pCas电泳如图2，第一泳道为15k DNA marker，第二、第三泳道为pCas质粒电泳条带；

(6)验证正确后保藏带有pCas质粒的大肠杆菌W1688-pCas。

4、制备W1688-pCas的电转感受态

(1)将大肠杆菌W1688-pCas涂布于LB固体平板上(Kan 50μg/mL)，30℃培养12h；

(2)挑取单菌落于含有相应抗性的液体LB中30℃培养12h，并取5mL活化后的菌液接于50mL含有相应抗性的培养基中培养至OD600约为0.2后，加入1M的L-阿拉伯糖1.5mL，继续培养至OD600约为0.6后，将培养液转入50mL离心管中，每管装25mL，插入冰中冷却20min；

(3)4℃下5000rpm离心10min，弃上清，收集细胞；用25mL预冷的无菌水重悬细胞；重复一遍该步骤；

(4)弃上清，用20mL预冷的10％甘油重悬，4℃下5000rpm离心10min；

(5)弃上清，用初始菌液体积的3‰预冷的10％甘油重悬细胞，以每管50μL分装于预冷的1.5mL离心管中，-80℃保存。

5、构建突变pTarget质粒

(1)找出待敲除基因的N20序列(不在上下同源臂内)，设计的引物序列包含需要突变的20bp，然后对整个pTarget质粒进行PCR，将整个环状质粒PCR成线性。PCR引物序列、测序验证序列如表1所示；

表1用于构建突变pTarget质粒的引物序列

(2)PCR结束之后，用DpnI对产物进行消化，37℃反应2h。消化体系：QuickCut DpnI1μL、10×QuickCut Buffer 1μL、无菌水1μL、步骤1中PCR产物7μL。

(3)冰上解冻E.coli T1感受态细胞，取10μL反应物至100μL感受态，混匀，插入冰中20min。

(4)于水浴锅中42℃热激90秒，立刻置于冰中冷却，2min；加入900μL LB；37℃培养1h。

(5)5000rpm离心4min，去除800μL培养基，剩余培养基重悬菌体后，涂布于含40μg/mL链霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。

(6)挑取(5)中的单一菌落于含有相应抗性液体LB中活化后提质粒送测序，测序引物见上表1。若质粒突变，则构建成功。

6、构建Donor DNA

选取待敲除基因两端基因作为上下同源臂(不少于500bp，中间少去的部分即为敲除的基因)，设计引物分别将上下同源臂PCR，所需引物如表2所示。PCR体系为10×PCRbuffer 100μL，dNTPs 40μL，无菌水40μL，上游引物6μL，下游引物6μL，基因组模板4μL，KOD酶4μL。PCR的条件为：变性温度98℃，时长2min；退火温度60℃，时长30s；延伸温度68℃，1min/1kb，35个循环。胶回收后使用Overlap PCR将上下游同源臂连接起来即得到用于修复的Donor DNA片段。Overlap PCR结束后进行胶回收得到Donor DNA片段。sgRNA与DonorDNA的构建见图1。

表2用于构建Donor DNA的引物序列

7、基因敲除

(1)冰上融化W1688-pCas电转感受态细胞

(2)将10pTarget和Donor DNA片段(Donor DNA：pTarget＝5:1pTarget＝100ng/μL)加入到上述感受态，混匀，置于冰上1min；放入预冷的2mm电转杯中，置于冰上5min。

(4)将电转仪的电压设为2500V，电击5-6ms，加入1mL LB培养基，在30℃、250rpm条件下培养2h后，涂布至含50μg/mL Kan和40μg/mL S的双抗LB平板上并于30℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落，进行菌落PCR验证，验证引物如表3所示，若敲除成功，则应该出现和Donor DNA条带大小一样的片段。将片段送去测序，若和Donor一样，则确定敲除成功。

表3用于验证的引物序列

如图3，第4泳道为2000bpDNA marker，第5泳道为5000bp DNA marker，基因bluF敲除成功后长度为1101bp(对应第1、2泳道亮带)，原始菌为2313bp(对应第3泳道亮带)；由此可见bluF敲除成功，可以进行下一步实验。

(6)将步骤(5)中验证正确的菌株于无抗液体LB中30℃培养，培养至对数期后加入IPTG，使其终浓度为0.5mM，30℃诱导10h，pTarget质粒丢失。此时菌株可在含Kan的LB中生长，不可在含Kan的LB中生长则pTarget成功丢失。

接着将pTarget成功丢失的菌株于LB培养基37℃过夜培养后同时涂布于无抗LB固体培养基和含Kan(50μg/mL)的LB平板，此时大肠杆菌在无抗平板上生长，含Kan的平板上不生长则pCas质粒丢失成功。如图4，左图为无抗LB平板，在该平板上菌株能够生长；右图为含有Kan(50μg/mL)的LB平板，在该平板上菌株不生长，证明pCas质粒成功丢失。此时得到完全不留痕迹的敲除菌株△bluF，进行保菌。

实施例2原始菌W1688与△bluF菌株的生物膜表征

1.96孔板结晶紫染色

本实施例采用结晶紫染色法对比原始菌W1688与△bluF菌株在蓝光与黑暗条件下的生物膜相对表达。因此，本实施例在96孔板中，对这两株菌株进行成膜验证。

(1)将两株菌分别在37℃、200rpm培养至对数期(OD600约为0.6)。

(2)将菌液稀释至OD600为0.1，96孔板中加入180μL的LB液体培养基，然后将20μL稀释后菌液接入到培养基中，37℃下分别与蓝光与黑暗中静置培养24h，使大肠杆菌在96孔板底部成膜。

(3)倒掉LB液体培养基，用PBS冲洗2-3遍后，用多聚甲醇固定生物膜15分钟后，倒掉甲醇，加入0.1％的结晶紫染色(CV stain)20分钟。

(4)倒掉结晶紫，用PBS冲洗，加入33％的冰醋酸并于振荡器轻微震荡30分钟，使结晶紫脱色溶解。

(5)利用酶标仪在OD570下进行读数。结果如图5和图6所示。

2.DAPI

DAPI染料是一种能与细胞的DNA结合的蓝色荧光染料，它可以透过完整细胞膜，因此一般可以用于固定细胞和活细胞的染色。

(1)将原始菌W1688与△bluF菌株在无抗LB液体培养基中37℃，200rpm培养至对数生长期。

(2)将菌液稀释到OD600＝1。向24孔板中加入200μL稀释后的菌液，以及1800μL LB培养基，于蓝光和黑暗条件下37℃静置培养30h。

(3)倒去孔板中的培养基，加入PBS缓冲液清洗细胞爬片上的游离菌体。

(4)加入4％多聚甲醛固定液，4℃，避光静置20min，倒去固定液。

(5)加入PBS缓冲液洗去多余固定液，加入400μL DAPI染色液，使染色液覆盖细胞爬片，室温放置5min。

(6)吸除DAPI染色液，用PBS缓冲液清洗3次，每次3min，最后将染色过的细胞爬片放在荧光显微镜下观察结果。结果如图7所示。

3.swarming平板泳动

将过夜培养的原始菌W1688和△bluF菌株稀释到OD600＝1后点swarming泳动平板，此平板包含20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、20g/L氯化钠，0.3％的琼脂粉，点好后的平板于37℃静置培养12h后取出观察。结果如图8所示。

4.RT-qPCR

(1)将W1688菌株在LB培养基中37℃，200rpm培养至对数生长期，取200μL菌液及1800μL LB培养基至24孔板中，分别于蓝光与黑暗条件下，37℃静置培养24h。

(2)洗去孔板中的菌液，4℃，12000rpm，离心2min，收集菌体，去上清。提取RNA根据天根细菌RNA提取试剂盒(DP430)中的革兰氏阴性细菌的提取步骤进行操作，将RNA提取完成后，进行跑胶验证。

(3)验证成功后使用诺唯赞公司的

II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(R223-01)，将RNA逆转录成为cDNA。以W1688菌株在黑暗条件与蓝光条件下的cDNA为模板，16s RNA为内参基因，使用诺唯赞公司的/>

qPCR/>

GreenMaster Mix(Q141-02)酶进行qPCR操作。结果如图9所示。

利用原始菌和本发明构建的△bluF菌株通过一系列表征实验，图5和图6结晶紫结果表明，在黑暗条件下，两株菌的成膜量大致相同，在蓝光条件下原始菌W1688的成膜量减少了64.82％，△bluF则并无明显改变。同时，图7DAPI的染色结果也能明显观察到原始菌W1688在蓝光下成膜量大量减少的现象。图8可以观察到在蓝光条件下原始菌浮游能力减弱，敲除菌没有改变，这些都是改造菌株解除了蓝光对生物膜形成抑制的表现。图9RT-qPCR结果表明，蓝光抑制了原始菌株W1688中与生物膜形成相关基因的表达，说明了蓝光对大肠杆菌的生物膜的形成确实存在抑制作用。

实施例3原始菌W1688和△bluF菌株生长能力的研究

1.生长曲线

(1)将原始菌与敲除菌△bluF在LB培养基中37℃，200rpm培养12h。

(2)将培养好的菌液OD600稀释至0.1，按照5％的接种量接入新鲜LB培养基中，37℃，200rpm培养14h，每隔2h取样

(3)使用分光光度计读取样品的OD600，绘制生长曲线。结果如图10所示，从该生长曲线可以观察到，将bluF敲除后，其生长能力和生长趋势几乎没有发生改变。

实施例4原始菌W1688和△bluF菌株发酵产L-苏氨酸性能研究

1.恢复菌株活力

取保菌管，置于冰盒中等待解冻，解冻后，取适量菌液接入LB摇管，37℃恒温培养。

2.接发酵液

(1)在100mL摇瓶中加入已经恢复活力的菌液1ml，放入37℃培养箱恒温培养12h。

(2)将100mL发酵培养基倒入500mL三角烧瓶中，取10mL步骤(1)中培养完成的菌液接入三角烧瓶中；

其中，所述发酵培养基含有30g/L葡萄糖，2g/L酵母粉，1g/L KH₂PO₄，20g/L(NH₄)₂SO₄，0.8g/L MgSO₄·7H₂0，0.2g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/L MnSO₄·5H₂O，15g/L CaCO₃。

(3)于37℃的摇床中进行恒温发酵，每6小时检测发酵液中的残余葡萄糖量和L-苏氨酸产量。

3.测定葡萄糖含量

取不同时间段的发酵液各2ml，离心，取上清液，稀释相应倍数后用测糖仪进行葡萄糖含量测定

4.L-苏氨酸产量测定

使用Agilent 1260仪器，色谱柱使用Sepax AAA(4.6*250mm)；HPLC法测L-苏氨酸产量，参数如表4所示。

表4液相色谱参数

5.结果

发酵性能比较实验结果如表5和图11所示，可以观察到，将bluF基因敲除后，菌株的发酵产量与发酵周期基本没有发生改变。

表5游离发酵中L-苏氨酸产量g/L

发酵时间h	0	6	12	18	24	30	36
								W1688	0	1.38	2.84	6.21	8.34	9.22	10.3
△bluF	0	1.56	3.09	6.13	8.18	9.08	10.12

综上，将bluF基因敲除后，不仅解除了蓝光对大肠杆菌生物膜形成的抑制，还对菌株的生长能力及发酵性能没有产生影响，为后续光遗传学工具的应用奠定了基础。

实施例5构建△bluF+nMagHigh菌株与△bluF+pMagHigh菌株

1.合成目的基因

查阅文献，委托擎科生物公司合成基因nMagHigh与pMagHigh，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

2.重组质粒的构建

2.1提质粒

(1)将E.coli DH5α甘油菌(含质粒pET28a-EGFP与pET28a-mcherry)接于液体LB(卡那抗性浓度：50μg/mL)，37℃培养12小时。

(2)用1.5mL的离心管收集上一步骤所培养的细胞，以10,000rpm，离心2min，去上清。

(3)按照Takara试剂盒(9760)，提取出质粒pET28a-EGFP与pET28a-mcherry；所述EGFP和mcherry的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示。

(4)验证：结果如图14所示，第1泳道为pET28a-EGFP 6074bp；第3泳道为pET28a-mcherry 6052bp，第2泳道为5000DNA marker；由此可见，质粒pET28a-EGFP与pET28a-mcherry提取成功

2.2载体的线性化

为了将nMagHigh连接到质粒pET28a-EGFP，将pMagHigh连接到质粒pET28a-mcherry，需要将载体进行酶切，利用酶切的反应体系为(20μL)0.1％BSA 2μL，1*M buffer2μL，BglII酶1μL，质粒pET28a-EGFP或pET28a-mcherry 10μL，无菌水5μL。酶切反应与37℃条件下反应2h。酶切后进行胶回收，用于后续的实验。

2.3构建质粒pET28a-EGFP-nMagHigh与pET28a-mcherry-pMagHigh

将上述nMagHigh或pMagHigh片段与纯化后线性载体按照Vazyme公司

II一步克隆试剂盒的说明书的步骤相连接，得到重组质粒pET28a-EGFP-nMagHigh与pET-28a-mcherry-pMagHigh。一步克隆反应体系如表6所示，37℃水浴30分钟后，立即冰浴5分钟，-20℃保存。构建重组的表达质粒示意图如下图12(pET28a-EGFP-nMagHIgh)、图13(pET28a-mcherry-pMagHIgh)所示。将所构建的质粒pET28a-EGFP-nMagHigh与pET-28a-mcherry-pMagHigh进行PCR验证，结果如图15所示，第1、2泳道为pET28a-mcherry-pMagHigh 8434bp；第3、4泳道为pET28a-EGFP-nMagHigh 8451bp；第5泳道为10000DNA marker。由此可见，重组质粒pET28a-mcherry-pMagHigh与pET28a-EGFP-nMagHigh构建成功。

表6一步克隆反应体系

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3.重组质粒的转化与筛选

取出DH5α感受态细胞冰上解冻至液态，预冷离心管中加入比例为10:1的感受态细胞和质粒。冰上放置30min，于42℃水浴锅进行热激，热激90秒。冰盒中冷却3分钟，加入1mLLB后于摇床37℃、200rpm培养1小时，离心去除大部分上清后重悬菌液并涂布于卡那霉素抗性平板。

挑取平板上的单点，接入摇管中(50μg/mL卡那霉素)，37℃培养箱过夜培养，然后提质粒pET28a-EGFP-nMagHigh与pET28a-mcherry-pMagHigh。设计测序引物如表7。

表7用于测序的实验引物序列

测序验证成功后，构建过表达菌株E.coli W1688-bluF+EGFP+nMagHigh与W1688-bluF+mcherry+pMagHigh。将构建的质粒以相同的转化方法转入到大肠杆菌W1688-bluF感受态中。挑取单菌落进行菌落PCR并提质粒测序验证，引物同表7。将转化至W1688-bluF菌株中的质粒进行菌落PCR验证。结果图16所示，第1泳道为5000DNA marker，第5、6泳道为pET28a-mcherry-pMagHigh，第7、8泳道为pET28a-EGFP-nMagHigh质粒验证，第2泳道是10000DNA marker。由图可见，菌落PCR的条带正确，两种改造菌株(△bluF+nMagHigh菌株与△bluF+pMagHigh菌株)构建成功。

实施例6生物膜的表征实验

1.吸附实验

将△bluF+EGFP+nMagHigh与△bluF+mcherry+pMagHigh菌株在含有Kan(50mg/L)抗性的LB液体培养基中37℃，200rpm培养至其OD600＝0.6，加入IPTG和L-阿拉伯糖，25℃，200rpm诱导培养12h。在24孔板中加入OD600稀释为0.15的两种菌液各300μL，于蓝光与黑暗条件下静置培养4h，接着加入200μL 10％戊二醛固定液，静置30min后在荧光显微镜下观察结果，结果如图17所示。

2.SEM电镜拍摄

将固定化连续发酵过程中的载体取出，进行SEM电镜拍摄。用PBS浸洗载体3次,加入2.5％的戊二醛，4℃固定12h,再用PBS浸洗载体2次。接着分别使用0％、50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇进行梯度脱水，每种浓度酒精脱水2次，每次15min。再用叔丁醇浸泡10min，离心去除叔丁醇后于-80℃冰箱放置过夜，最后使用真空冻干机将样品冻干，送样使用扫描电镜(SEM)Hitachi日本日立SU 8020进行拍摄，结果如图18所示。

本实施例利用敲除菌△bluF与本发明构建的重组菌进行了表征实验。如图17的荧光蛋白吸附实验结果表明在蓝光下，改造菌株菌体聚集成簇，大量聚集叠加，生物膜形成量明显增加。同时，图18SEM电镜拍摄结果可以观察到，在蓝光条件下共培养的改造菌株相互吸引，聚集成簇，生物膜量明显增多。

实施例7△bluF+nMagHigh菌株与△bluF+pMagHigh菌株发酵产L-苏氨酸性能研究

1、固定化连续发酵

(1)载体处理

将载体的大小裁剪为10mm×10mm×10mm。将裁剪好的载体用适量1M NaOH浸泡1h，用超纯水将其清洗干净后，用1M HCl溶液浸泡1h，使用无菌水清洗载体使其pH＝7.0，放入烘箱中烘干水分。按照30g/L的量接入发酵液中，115℃，20min灭菌后进行冷却。

其中，所述的载体为聚氨酯多孔泡沫，密度为1.5g/cm³，孔径0.2-0.6mm，载体大小为10mm×10mm×10mm。

(2)恢复菌株活力

取保菌管，置于冰盒中等待解冻，解冻后，取适量△bluF菌株、△bluF+nMagHigh菌株和△bluF+pMagHigh菌株接入LB摇管，37℃恒温培养。

(3)接发酵液

(i)在100mL摇瓶中分别加入已经恢复活力的三种菌液1ml，放入37℃培养箱恒温培养12h。

(ii)将100mL发酵培养基，发酵培养基中含有30g/L葡萄糖，2g/L酵母粉，1g/LKH₂PO₄，22g/L(NH₄)₂SO₄，0.8g/L MgSO₄·7H₂O，0.02g/L MnSO₄·5H₂O，0.02g/L FeSO₄·7H₂O，0.002g/L维生素B1，30g/L CaCO₃，30g/L处理过的固定化载体。倒入500mL三角烧瓶中，分别取步骤(1)中的△bluF+nMagHigh与△bluF+pMagHigh各5mL菌液接入三角烧瓶中进行共培养发酵。

另外，取步骤(1)中的△bluF菌液10mL按照上述方法进行发酵。

另外，取步骤(1)中的△bluF+nMagHigh菌液10mL按照上述方法进行发酵。

另外，取步骤(1)中的△bluF+pMagHigh菌液10mL按照上述方法进行发酵。

(iii)于37℃的摇床中进行蓝光(465nm，500lux)恒温发酵，每6小时检测发酵液中的残余葡萄糖量和L-苏氨酸产量。当发酵液中葡萄糖含量低于0.1g/L时，第一批发酵结束，开始下一批次发酵。每一次发酵结束后，从容器中吸出部分发酵液，保留载体，并加入同等体积的无菌发酵液，进行下一批次的发酵，直至L-苏氨酸产量稳定时停止固定化发酵。将样品4℃，12000rpm离心5min，取上清液测定L-苏氨酸与葡萄糖含量，直至发酵液中葡萄糖耗尽时停止取样。

2、测定葡萄糖含量

取不同时间段的发酵液各2ml，离心，取上清液，稀释相应倍数后用测糖仪进行葡萄糖含量测定。

3、L-苏氨酸产量测定

使用Agilent 1260仪器，色谱柱使用Sepax AAA(4.6*250mm)HPLC法测L-苏氨酸产量，参数如表4所示。

4、结果分析

通过7批固定化连续发酵实验，发酵结果见表8和图19，由表4中数据可以看出，在原始菌连续发酵到第5批的时候发酵产量趋于稳定，改造菌共培养发酵在第3批时产量趋于稳定，且改造菌第二批的产量就已接近原始菌第7批次的产量。原始菌与改造菌都在第7批次时产量达到最高，分别为11.54g/L与16.57g/L，均比出发菌的初始产量高。从图19中可以看出，原始菌与改造菌共培养的发酵周期分别为33h与27h。改造后的菌株固定化产量比原始菌高出了43.59％，改造菌固定化发酵周期比原始菌缩短了18.18％，且在较短批次就能达到原始菌较多批次的产量。另外，在△bluF+nMagHigh与△bluF+pMagHigh单独固定化发酵的时候，其发酵效果与△bluF单独发酵处于基本相同的水平。

表8固定化连续发酵数据/g/L

本发明提供了一株过表达nMagHigh与pMagHigh基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种利用重组大肠杆菌共培养发酵产L-苏氨酸的方法

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1212

<212> DNA

<213> bluF

<400> 1

atgcttacca cccttattta tcgtagccat atacgtgacg acgaacctgt caaaaaaatc 60

gaagaaatgg tttcgatagc aaatcgcagg aacatgcagt ctgacgtaac agggatctta 120

ctgtttaatg gttctcattt tttccagctt ctggaaggtc cggaagaaca ggttaaaatg 180

atatatcggg ctatatgcca ggatccacgg cactataata ttgttgagct gctgtgcgat 240

tacgcgcctg ctcgccgttt tggcaaagcg ggaatggaat tatttgattt gcgcctgcac 300

gagcgagatg acgttttaca ggccgtattc gacaaaggca catcaaaatt tcagctaact 360

tatgatgaca gagcgctaca attttttcgt acttttgtcc ttgcaaccga acaatcaacc 420

tatttcgaga tccctgccga agactcctgg ctttttatcg ctgacggatc tgataaagaa 480

cttgattcct gtgccctttc accaactata aacgaccact ttgcctttca tcctattgtc 540

gatcccttat cgcggcggat aatcgctttt gaagccattg tgcaaaaaaa tgaagatagc 600

ccatcagcca tagcggttgg gcagcgtaaa gacggggaaa tctacacagc ggatctcaaa 660

agtaaggcgc ttgcattcac gatggcacac gcacttgagc tcggtgataa aatgatttca 720

atcaatctat tacctatgac cctggttaac gaacctgacg cagtctcttt tttacttaat 780

gaaataaagg ccaatgctct ggtgcctgaa caaatcatcg ttgaatttac tgaaagtgaa 840

gtcatatctc ggtttgatga gtttgccgaa gcgattaaat cgctaaaggc tgctggtatc 900

agtgtagcaa ttgatcattt tggcgcaggt tttgctggtt tgttactcct gtcacgcttc 960

cagcctgaca gaattaaaat cagtcaggaa ttgattacca atgttcataa aagtgggcca 1020

cggcaggcaa ttattcaggc gatcataaaa tgctgtacat cacttgaaat tcaagtcagt 1080

gctatgggcg tggcaacacc agaagagtgg atgtggcttg aatccgcagg aattgagatg 1140

tttcagggag atctgtttgc taaagctaaa ttgaatggta tcccttccat agcgtggcca 1200

gagaaaaaat aa 1212

<210> 2

<211> 462

<212> DNA

<213> nMagHigh

<400> 2

atgcacacac tatatgctcc cggagggtat gatataatgg gatacctaga tcaaataggc 60

aaccgtccga acccgcaagt ggagctgggc ccggtggaca ccagctgcgc gctgatcctg 120

tgcgacctga agcagaaaga taccccgatt gtgtacgcga gcgaggcgtt cctgtacatg 180

accggttata gcaacgcgga agttctgggc cgtaactgcc gttttctgca aagcccggat 240

ggtatggtga agccgaaaag cacccgtaag tatgttgaca gcaacaccat caacaccatt 300

cgtaaagcga tcgatcgtaa cgcggaagtg caggttgaag tggttaactt caagaaaaac 360

ggccaacgtt tcgtgaactt tctgaccatc attccggttc gtgatgagac cggcgaatat 420

cgttatagca tgggttttca atgcgagacc gaaggcggta gc 462

<210> 3

<211> 462

<212> DNA

<213> pMagHigh

<400> 3

atgcacacac tatatgctcc cggagggtat gatataatgg gatacctacg tcaaatacgc 60

aaccgtccga acccgcaagt ggagctgggc ccggtggaca ccagctgcgc gctgatcctg 120

tgcgacctga agcagaaaga taccccgatt gtgtacgcga gcgaggcgtt cctgtacatg 180

accggttata gcaacgcgga agttctgggc cgtaactgcc gttttctgca aagcccggat 240

ggtatggtga agccgaaaag cacccgtaag tatgttgaca gcaacaccat caacaccatt 300

cgtaaagcga tcgatcgtaa cgcggaagtg caggttgaag tggttaactt caagaaaaac 360

ggccaacgtt tcgtgaactt tctgaccatc attccggttc gtgatgagac cggcgaatat 420

cgttatagca tgggttttca atgcgagacc gaaggcggta gc 462

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> bluF-sg-F

<400> 4

agacggggaa atctacacag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagt 59

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> bluF-sg-R

<400> 5

ctgtgtagat ttccccgtct actagtatta tacctaggac tgagctagct g 51

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> bluF-up-F

<400> 6

gtttctgttc ctcttcccca gtcg 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> bluF-up-R

<400> 7

taacaatcca gggtaatggg tgagg 25

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> bluF-dn-F

<400> 8

ttttcagcac attctttcac atgatttcag t 31

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> bluF-dn-R

<400> 9

ccagtgaaat aattctcgcg cg 22

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> bluF check-F

<400> 10

cctgttaaat aatcaggctg ttgcatt 27

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> bluF check-R

<400> 11

cgctggcgaa caggaaggta 20

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> nMagHigh-F

<400> 12

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg g 31

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> nMagHigh-R

<400> 13

atttgtccta ctcaggagag cgtt 24

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> pMagHigh-F

<400> 14

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg 30

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> pMagHigh-R

<400> 15

atttgtccta ctcaggagag cgtt 24

<210> 16

<211> 720

<212> DNA

<213> EGFP

<400> 16

ttacttgtac agctcgtcca tgccgagagt gatcccggcg gcggtcacga actccagcag 60

gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc tttgctcagg gcggactggg tgctcaggta 120

gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc gccgatgggg gtgttctgct ggtagtggtc 180

ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc 240

gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt 300

gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac 360

cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa 420

gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg 480

cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca ctgcacgccg taggtcaggg tggtcacgag 540

ggtgggccag ggcacgggca gcttgccggt ggtgcagatg aacttcaggg tcagcttgcc 600

gtaggtggca tcgccctcgc cctcgccgga cacgctgaac ttgtggccgt ttacgtcgcc 660

gtccagctcg accaggatgg gcaccacccc ggtgaacagc tcctcgccct tgctcaccat 720

<210> 17

<211> 711

<212> DNA

<213> mcherry

<400> 17

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711

Claims (5)

1.一株重组大肠杆菌，其特征在于，在出发菌中敲除bluF基因，过表达nMagHigh基因，即为重组大肠杆菌△bluF+nMagHigh；或在出发菌中敲除bluF基因，过表达pMagHigh基因，即为重组大肠杆菌△bluF+pMagHigh；所述出发菌均为大肠杆菌 W1688；

所述bluF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述nMagHigh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述pMagHigh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种发酵产L-苏氨酸的方法，其特征在于，利用权利要求1所述重组大肠杆菌△bluF+nMagHigh和所述重组大肠杆菌△bluF+pMagHigh共培养发酵产L-苏氨酸。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌△bluF+nMagHigh和所述重组大肠杆菌△bluF+pMagHigh分别按照2%~8%的体积比接入到发酵培养基中。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述发酵的温度为30~44 ℃。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述发酵为在波长为450~480 nm、光照度为400~600 lux的蓝光下进行发酵。

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