CN104862329B - L-苏氨酸基因工程生产菌 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株L‑苏氨酸基因工程生产菌，保藏号为CCTCC M 2015233。本发明所构建的L‑苏氨酸基因工程生产菌能够实现发酵过程中发酵液中L‑苏氨酸的有效积累，提高了L‑苏氨酸的产量及糖酸转化率，发酵过程中不需要添加任何氨基酸，生产成本低，具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种L-苏氨酸基因工程生产菌。
背景技术
L-苏氨酸作为人类和动物必需的八种氨基酸之一，在人和动物的生长发育中起着重要的作用，L-苏氨酸被广泛用于饲料添加剂、食品工业及医药产品等方面。
L-苏氨酸的合成主要由蛋白质水解法、化学合成法、酶法和发酵法，前三种方法都由于存在着种种弊端，不能满足工业生产的目的。而直接发酵法由于成本低、污染小等优点，已被作为合成L-苏氨酸的主要方法。
上世纪50年代，日本最早采用添加前体物的方法发酵生产苏氨酸，至60年代已有直接发酵法合成L-苏氨酸的报道，是利用诱变育种的方法改造的黄色短杆菌直接发酵生产L-苏氨酸。上世纪70年代末，苏联已开始用基因工程菌大规模生产L-苏氨酸。
传统多用诱变黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌等，解除菌体自身的反馈调节，切断之路代谢，增加前体物的合成等，以提高L-苏氨酸产量。Shiio(Isamu Shiio and ShigeruNakamori.Agr Bio Chem.1969,33(8):1152)等利用黄色短杆菌，经α-氨基-β-羟基戊酸处理后，获得了L-苏氨酸生产菌株，苏氨酸测产量累积13.58g/L。Nakamori等(ShigeruNakamori and Isamu Shiio.Agr Bio Chem.1972,36(7):1209)在此菌株基础上，选育出了L-蛋氨酸缺陷型变异株，产量提高到了18g/L。但传统诱变育种由于随机性较强，获得高产突变株的难度较大。
利用合理的代谢工程的方法构建L-苏氨酸工程菌，是目前获得高产菌株的首选方法。2002年日本味之素申请的中国专利CN01137078.5中，利用大肠杆菌，通过增强苏氨酸合成代谢途径上相关基因的表达，苏氨酸产率达0.43g/g(葡萄糖，糖酸转化率为43％)，但发酵过程中需要额外添加L-甲硫氨酸。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee,Jin Hwan Park,TaeYong Kim,et al.Mol Syst Biol.2007；3:149)等利用代用代谢工程手段，将编码天冬氨酸激酶I和III的thrA和lysC基因突变，解除了末端产物反馈抑制；同时失活tdh和突变ilvA基因使苏氨酸不被降解；失活metA和lysA基因，为苏氨酸合成提供了更多前体，最终通 过分配发酵培养，产酸率为0.393g/g(葡萄糖，糖酸转化率为39.3％)，但发酵过程中需要添加L-蛋氨酸和L-赖氨酸，增加了工业化生产成本。
发明内容
本发明利用基因工程技术改造大肠杆菌，通过增强相关基因，弱化分支代谢途径，获得一株高产L-苏氨酸的生产菌株，发酵过程中不需要添加任何氨基酸，能有效的积累L-苏氨酸，生产成本低，具有广泛的工业应用前景。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种L-苏氨酸基因工程生产菌的构建方法。
本发明的第二个目的在于提供一种L-苏氨酸基因工程生产菌。
本发明的第三个目的在于提供一种L-苏氨酸的生产方法。
本发明的第四个目的在于提供所述L-苏氨酸基因工程生产菌用于生产L-苏氨酸的应用。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
根据本发明的第一个方面，一种L-苏氨酸基因工程生产菌的构建方法，包括以下步骤：
A、敲除原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲除的基因选自：tdh、tdcC和thrL中的一个或多个；
B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因增强菌株，所述增强的基因选自：thrA*BC(G433R)和rhtC中的一个或多个；
C、构建包含过表达原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所述过表达的基因选自ppc、aspA、pntAB和thrA*(G433R)，lysC*(T342I)中的一个或多个；
D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤A中所述基因敲除菌株和/或步骤B中所述基因增强菌株中，获得L-苏氨酸基因工程生产菌。
根据本发明的优选实施例，所述L-苏氨酸基因工程生产菌的构建方法，包括以下步骤：
A、敲除原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲除的基因为tdh、tdcC和thrL；
B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因增强菌株，所述增强的基因为thrA*BC(G433R)和rhtC；
C、构建包含过表达原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所述过表达的基因为ppc、aspA、pntAB和thrA*(G433R)，lysC*(T342I)；
D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤B中所述基因增强菌株中，获得L-苏氨酸基因工程生产菌。
根据本发明，所述原始菌株为大肠杆菌。
根据本发明的优选实施例，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。
根据本发明的第二个方面，按照如上所述方法构建获得的L-苏氨酸基因工程生产菌。
根据本发明的优选实施例，所述的L-苏氨酸基因工程生产菌，保藏号为CCTCC NO:M 2015233。
根据本发明的第三个方面，一种L-苏氨酸的生产方法，通过发酵如上所述的L-苏氨酸基因工程生产菌生产。
根据本发明的优选实施例，所述发酵的发酵培养基组成如下：葡萄糖30g/L，NaCl0.8g/L，(NH4)2SO422g/L，K2HPO42.0g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，MnSO4·5H2O0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，盐酸硫胺0.002g/L，酵母粉1.0g/L，CaCO330g/L，pH7.0。
根据本发明的额第四个方面，如上所述的L-苏氨酸基因工程生产菌可用于生产L-苏氨酸。
本发明所构建的L-苏氨酸基因工程菌能够实现发酵过程中发酵液中L-苏氨酸的有效积累，提高了L-苏氨酸的产量及糖酸转化率，发酵过程中不需要添加任何氨基酸，具有广泛的工业应用前景。
附图说明
图1为重组质粒pThr的示意图，过表达ppc、aspA、pntAB和thrA*(G433R)基因。
图2为苏氨酸基因工程菌的产量和糖酸转化率示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明构建的L-苏氨酸高产基因工程菌大肠杆菌CIBTS1688已于2015年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，菌种的拉丁学名是Escherichia coli CIBTS1688，中文名称是大肠杆菌，保藏号为CCTCC NO: M 2015233。
本发明中涉及的基因名称解释如下：
tdh：L-苏氨酸3-脱氢酶；
thrL：苏氨酸操纵子前导肽；
thrA：天冬氨酸激酶及Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶；
rhtC：苏氨酸转运体；
lysC：天冬氨酸激酶；
tdcC：L-苏氨酸/L-丝氨酸转运体；
dacA：D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶；
thrB：高丝氨酸激酶；
thrC：苏氨酸合成酶；
yihF：DU945家族蛋白；
ppc：磷酸烯醇式羧化酶；
aspA：天冬氨酸氨裂解酶；
pntAB：吡啶核苷酸转氢酶。
根据大肠杆菌中L-苏氨酸的代谢途径，本发明在菌株MG1655的基础上构建了一系列突变体，如：tdh、tdcC和thrL等的敲除或失活，thrA*BC和rhtC的增强及lysC*的突变，其中tdh的敲除阻断了L-苏氨酸的降解，tdcC的敲除可增加L-苏氨酸的外运，thrL的敲除去除了转录衰减调控，thrA*BC的过表达增强了L-苏氨酸的合成，rhtC的过表达增强了L-苏氨酸的外排，lysC*的突变增加了前体的供应有利于L-苏氨酸的合成。在这些突变体中在合适的载体上组合表达ppc、pntAB、aspA、asd、thrA*等，构建了一系列的L-苏氨酸基因工程菌。
大肠杆菌MG1655突变菌株的构建，参考Kwang Ho Lee等报道的文献(Systemsmetabolic engineering of Escherichia coli for L-threonine production,Kwang HoLee,Jin Hwan Park,et al.Molecular Systems Biology3,2007)，利用Jiang Y等报道的文献的Crispr-Cas9方法(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome viathe CRISPR-Cas9System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl Environ Microbiol,2015)进行大肠杆菌基因组中tdh、thrL和tdcC等基因的敲除及thrA*BC、rhtC和lysC*等基因的过表达。
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml，所述壮观霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml，所述氨苄霉素在培养基中的终浓度为100μg/ml。
以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示。
表1、
实施例1：敲除tdh基因的菌株MG1655(Δtdh)的制备
(1)PCR扩增：以tdh-F/tdh-R为引物和模板，PCR扩增tdh(HR)片段，约100bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒(来源于文献：Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)转化入MG1655(购于CGSC(E.coli Genetic StockCenter,Yale University,New Haven,Connecticut,USA))感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，30℃220r/min培养，在菌浓OD600为0.4前一小时加入终浓度为10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600为0.4；
(3)tdh-N20-Spec质粒构建：以pTargetF-cadA质粒(来源于文献MultigeneEditing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System,Jiang Y,ChenB,et al.Appl Environ Microbiol,2015)为模板，tdh-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增tdh-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得tdh-N20-Spec质粒；
(4)电转：将tdh(HR)片段及tdh-N20-Spec质粒电转入MG1655/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用tdhFOU/tdhROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.4kb；
(5)质粒丢失：挑取菌落PCR验证为阳性单菌落，接种于含卡那霉素的LB试管中，同时加入终浓度为1mM IPTG，30℃过夜培养；次日试管中菌液直接划线于含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养；次日挑取单菌落转接于含壮观霉素LB平板上；若不能生长，表明tdh-N20-Spec质粒已丢失。挑取tdh-N20-Spec质粒丢失阳性菌落，接种于LB试管中，37℃过夜培养；次日菌液划线接种于LB平板上，37℃过夜培养；次日挑取单菌落转接于含卡那霉素的LB平板上，若不能生长，表明pCas质粒丢失，得到MG1655(Δtdh)菌株。
实施例2：敲除thrL基因的菌株MG1655(Δtdh,ΔthrL)的制备
(1)PCR扩增：以thrL-F/thrL-R为引物和模板，PCR扩增thrL(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例1获得的MG1655(Δtdh)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(Δtdh)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)thrL-N20-Spec质粒构建：以pTargetF-cadA质粒为模板，thrL-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增thrL-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得thrL-N20-Spec质粒；
(4)电转：将thrL(HR)片段及thrL-N20-Spec质粒电转入MG1655(Δtdh)/pCas 感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用thrLFOU/thrLROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(5)，去除thrL-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(Δtdh,ΔthrL)。
实施例3：突变thrA*(G433R)基因的菌株MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R)的制备
(1)PCR扩增：以thrAMU-F/thrAMU-R为引物和模板，PCR扩增thrA*(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例2获得的MG1655(Δtdh,ΔthrL)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(Δtdh,ΔthrL)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)thrA*-N20-Spec质粒构建：以pTargetF-cadA质粒为模版，thrA*-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增thrA*-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得thrA*-N20-Spec质粒；
(4)电转：将thrA*(HR)片段及thrA*-N20-Spec质粒电转入MG1655(Δtdh,ΔthrL)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用thrAFOU/thrAROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约600bp；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(5)，去除thrA*-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R))。
实施例4：过表达rhtC基因的菌株MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC)的制备
(1)PCR扩增：以PtacrhtC-F/rhtC-R为引物和模板，PCR扩增PtacrhtC(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例3获得的MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R))感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参 照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R))/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)PtacrhtC-N20-Spec质粒构建：以pTargetF-cadA质粒为模版，PtacrhtC-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增PtacrhtC-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得PtacrhtC-N20-Spec质粒；
(4)电转：将PtacrhtC(HR)片段及PtacrhtC-N20-Spec质粒电转入MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R))/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用rhtCFOU/rhtCROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约400bp；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(5)，去除PtacrhtC-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC)。
实施例5：突变lysC*(T342I)基因的菌株MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I))的制备
(1)以lysCMU-F/lysCMU-R为引物和模板，PCR扩增lysC*(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例4获得的MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)lysC*-N20-Spec质粒构建：以pTargetF-cadA质粒为模版，lysC*-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增lysC*-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得lysC*-N20-Spec质粒；
(4)电转：将lysC*(HR)片段及lysC*-N20-Spec质粒电转入MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用lysC*FOU/lysC*ROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约400bp；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(5)，去除lysC*-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I))。
实施例6：敲除tdcC基因的菌株MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC)的制备
(1)PCR扩增：以tdcC-F/tdcC-R为引物和模板，PCR扩增tdcC(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例5获得的MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I))感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I))/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)tdcC-N20-Spec质粒构建：以pTargetF-cadA质粒为模版，tdcC-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增tdcC-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得tdcC-N20-Spec质粒；
(4)电转：将tdcC(HR)片段及tdcC-N20-Spec质粒电转入MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I))/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用tdcCFOU/tdcCROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.5kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(5)，去除tdcC-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC)。
实施例7：过表达thrA*BC基因的菌株MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC,ΔdacA::thrA*BC)的制备
(1)PCR扩增：以实施例3构建的MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R))基因组为模版，thrA*BC(dacA)-F/thrA*BC(dacA)-R为引物，PCR扩增thrA*BC(dacA)片段(thrA基因的第443位的氨基酸G突变成R)，约5.2kb；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例6获得的MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC)/pCas单菌落于4ml 含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)dacA-N20-Spec质粒构建：以pTargetF-cadA质粒为模板，dacA-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增dacA-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得dacA-N20-Spec质粒；
(4)电转：将thrA*BC(dacA)片段及dacA-N20-Spec质粒电转入MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用dacAFOU/dacAROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约5.7kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(5)，去除dacA-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC,ΔdacA::thrA*BC)。
实施例8：过表达thrA*BC基因的菌株MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC,ΔdacA::thrA*BC,ΔyihF::thrA*BC)的制备
(1)PCR扩增：以实施例3构建的MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R))基因组为模板，thrA*BC(yihF)-F/thrA*BC(yihF)-R为引物，PCR扩增thrA*BC(yihF)片段(thrA基因的第443位的氨基酸G突变成R)，约5.2kb；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例7获得的MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC,ΔdacA::thrA*BC)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC,ΔdacA::thrA*BC)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)yihF-N20-Spec质粒构建：以pTargetF-cadA质粒为模版，yihF-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增yihF-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得yihF-N20-Spec质粒；
(4)电转：将thrA*BC(yihF)片段及yihF-N20-Spec质粒电转入MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC,ΔdacA::thrA*BC)/p Cas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用yihFFOU/yihFROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约5.8kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(5)，去除yihF-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(Δtdh,ΔthrL,thrA*(G433R),Ptac-rhtC,lysC*(T342I),ΔtdcC,ΔdacA::thrA*BC,ΔyihF::thrA*BC)。
实施例9：重组质粒pThr的构建
9.1、 pMWK的构建
以pPIC3.5K载体(购自Invitrogen公司)为模板，Kandn/Kanup为引物，PCR扩增Kan片段，约0.9kb；pMW118载体(购自Nippon Gene公司)利用ApaLI/EcoO109I双酶切，回收2.7kb片段并补平；上述片段连接，涂布于含卡那霉素LB平板，转化子利用KanF/M13F-47验证，能获得500bp片段者，即为正确连入方向，得到pMWK质粒。
9.2、 pMW-ppc的构建
(1)以MG1655基因组为模板，ppcdn/ppcup为引物，PCR扩增ppc片段，约3kb，ppc片段利用AflII酶切补平；pBR322载体(购自Takara公司)利用EcoO109I酶切补平并去磷；两片段连接，涂布于含氨苄霉素LB平板上，转化子利用ampR/ppcF验证，得到500bp片段则为正确连入方向，命名为pBR-ppc。
(2)pBR-ppc利用SmaI/ScaI酶切，回收3.6kb片段；插入到pMW118载体的SmaI位点，转化子利用ppcF/M13F-47验证，得到pMW-ppc质粒。
9.3、 pMW-aspA的构建
以MG1655基因组为模板，aspAup/aspAdn为引物，PCR扩增aspA片段，约2.1kb；aspA片段插入到pMW118载体的SmaI位点，涂布于含氨苄霉素LB平板上，转化子利用aspAR/M13R-48引物验证，扩增出约500bp片段，即为正确，得到pMW-aspA质粒。
9.4、 pMW-pntAB的构建
以MG1655基因组为模板，pntABdn/pntABup为引物，PCR扩增pntAB片段，约3.2kb，pntAB片段利用HindIII/BamHI插入到pMW118载体的HindIII/BamHI位点，涂布于含氨苄霉素LB平板筛选，转化子利用pntB-F/M13F-47验证，能扩增出约400bp片段即为正确，得到pMW-pntAB质粒。
9.5、 pMW-ppc-aspA的构建
pMW-aspA质粒先利用SacI酶切并补平，再用HindIII酶切，获得2kb片段；pMW-ppc质粒先利用XbaI酶切并补平，再用HindIII酶切，获得6kb片段；两片段连接，涂布于含氨苄霉素的LB平板上，转化子利用aspAR/ppcF验证，能扩增出1.5kb片段，即得到pMW-ppc-aspA质粒。
9.6、 pMW-ppc-aspA-pntAB的构建
pMW-ppc-aspA质粒先利用XbaI酶切并补平，再利用HindIII酶切，回收约9kb片段；pMW-pntAB质粒利用HindIII/SmaI酶切，回收约3.2kb片段；两片段连接，涂布于含氨苄霉素LB平板上，得到pMW-ppc-aspA-pntAB质粒。
9.7、 pMWK-ppc-aspA-pntAB的构建
pMW-ppc-aspA-pntAB质粒利用HindIII/SmaI酶切，回收约9kb片段并补平；pMWK质粒利用EcoRI酶切并补平、去磷；两片段连接，涂布于含卡那霉素的LB平板上，转化子利用pntB-F/M13F-47验证，能扩增出约400bp片段，即得到pMWK-ppc-aspA-pntAB质粒。
9.8、 pMW-thrA*的构建
(1)以MG1655基因组为模板，Pthr-F/Pthr-R为引物，PCR扩增Pthr片段，约300bp，Pthr片段利用XbaI/SacI酶切，插入到pMW118的XbaI/SacI位点，得到pMW-Pthr质粒。
(2)以MG1655基因组为模板，thrA-F/thrA-R2为引物，PCR扩增thrA-1片段，约1.3kb；同时以MG1655基因组为模板，thrA-F2/thrA-R为引物，PCR扩增thrA-2片段，约1.2kb；以前述获得的thrA-1/thrA-2片段为模板，over-lap PCR扩增thrA*片段(即将thrA定点突变为G433R)，约2.5kb，thrA*片段利用XbaI酶切；pMW-Pthr 质粒先用HindIII酶切补平，再用XbaI酶切；两片段连接，得到pMW-thrA*质粒。
9.9、 pThr的构建
pMW-thrA*质粒利用SacI/SpeI酶切，胶回收2.9kb片段，插入到pMWK-ppc-aspA-pntAB质粒的SacI/XbaI位点，得到pThr质粒，质粒图谱如图1所示。
实施例10：L-苏氨酸重组表达菌株的获得
将实施例1-8中获得的多种敲除/过表达基因的大肠杆菌宿主菌MG1655突变体制备成感受态细胞，然后用化学转化方法或电转化方法将实施例9获得的重组表达质粒pThr转入感受态细胞(感受态细胞制备及转化具体方法参考《分子克隆III》第1章96页)，获得了L-苏氨酸发酵生产基因工程菌，如表2所示。
表2、本发明构建的基因工程菌
实施例11：L-苏氨酸基因工程菌发酵生产L-苏氨酸
L-苏氨酸基因工程菌发酵生产L-苏氨酸的方法如下：
挑取单菌落接种于400μl含卡那霉素发酵培养基的96孔板中，37℃，290rpm培养24小时。
发酵结束，利用HPLC测定发酵液上清中的L-苏氨酸含量，结果如表4和图2所示。
其中，发酵培养基组成如下：葡萄糖30g/L，NaCl 0.8g/L，(NH4)2SO422g/L，K2HPO42.0g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，MnSO4·5H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，盐酸硫胺0.002g/L，酵母粉1.0g/L，CaCO330g/L，pH7.0。
HPLC检测方法如下：
色谱条件：Agilent XDB-C8(150mm)中性柱子、检测波长334nm、柱温：35℃。
衍生剂配置：取0.3430g邻苯二甲醛+5ml无水乙醇+0.1472g N-乙酰-L半胱氨酸，用0.05mol/L硼酸缓冲液(pH＝9.5)定溶到50ml，避光备用。
流动相A：称取一定量的醋酸钠，配成0.05mol/L的缓冲液1000ml；
流动相B：甲醇；
梯度洗脱程序如表3所示。
表3、 HPLC梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相B(％) | 流动相A(％) | 流速(ml/min) |
| 0 | 30 | 70 | 1.0 |
| 6 | 30 | 70 | 1.0 |
| 7 | 95 | 5 | 1.0 |
| 13 | 95 | 5 | 1.0 |
| 14 | 30 | 70 | 1.0 |
数据采集时间18min。
表4、 基因工程菌L-苏氨酸产量比较
| 编号 | L-苏氨酸(g/L) | 糖酸转化率(％) |
| MG1655 | 0 | 0 |
| CIBTS1699 | 0.20±0.03 | 0.67±0.10 |
| CIBTS1702 | 3.65±0.41 | 15.62±1.74 |
| CIBTS1705 | 10.78±0.20 | 35.71±0.63 |
| CIBTS1706 | 11.88±0.17 | 39.15±0.56 |
| CIBTS1688 | 14.59±0.53 | 44.20±1.61 |
从表4和图2的结果可见，MG1655空白菌96孔板发酵L-苏氨酸产量为零，将重组质粒pThr转入MG1655后CIBTS1菌株96孔板发酵L-苏氨酸产量最高为0.23g/L，表明构建的pThr质粒实现了利用大肠杆菌发酵法生产L-苏氨酸；当tdh、tdcC和thrL基因缺失及thrA*BC、rhtC和lysC*基因过表达或突变后，CIBTS1688菌株96孔板发酵L-苏氨酸产量最高达15.12g/L，糖酸转化率达45.81％，是CIBTS1699的近66倍，表明对基因的缺失/过表达或突变起到了明显的效果。
综上所述，本发明所构建的L-苏氨酸基因工程菌能够实现发酵过程中发酵液中L-苏氨酸的有效积累，提高了L-苏氨酸的产量及糖酸转化率，发酵过程中不需要添加任何氨基酸，生产成本低，具有广泛的工业应用前景。
Claims (9)
1.一种L-苏氨酸基因工程生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、敲除原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲除的基因为：tdh、tdcC和thrL；
B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因增强菌株，所述增强的基因为：thrA*BC(G433R)和rhtC；
C、构建包含过表达原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所述过表达的基因为ppc、aspA、pntAB、thrA*(G433R)和lysC*(T342I)；
D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤A中所述基因敲除菌株和/或步骤B中所述基因增强菌株中，获得L-苏氨酸基因工程生产菌。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、敲除原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲除的基因为tdh、tdcC和thrL；
B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因增强菌株，所述增强的基因为thrA*BC(G433R)和rhtC；
C、构建包含过表达原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所述过表达的基因为ppc、aspA、pntAB、thrA*(G433R)和lysC*(T342I)；
D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤B中所述基因增强菌株中，获得L-苏氨酸基因工程生产菌。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述原始菌株为大肠杆菌。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。
5.如权利要求1-4中任一项方法构建获得的L-苏氨酸基因工程生产菌。
6.如权利要求5所述的L-苏氨酸基因工程生产菌，其特征在于，保藏号为CCTCC M2015233。
7.一种L-苏氨酸的生产方法，其特征在于，通过发酵如权利要求5或6所述的L-苏氨酸基因工程生产菌生产。
8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述发酵的发酵培养基组成如下：葡萄糖30g/L，NaCl 0.8g/L，(NH4)2SO4 22g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，MnSO4·5H2O0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，盐酸硫胺0.002g/L，酵母粉1.0g/L，CaCO3 30g/L，pH7.0。
9.如权利要求5或6所述的L-苏氨酸基因工程生产菌用于生产L-苏氨酸的应用。
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