CN110272857B - β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种β‑丙氨酸生产菌及其制备方法和用途，所述β‑丙氨酸生产菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC NO：17830。本发明所构建的β‑丙氨酸生产菌在发酵过程中不需要添加天冬氨酸，就能够实现发酵过程中发酵液中β‑丙氨酸的有效积累，提高了β‑丙氨酸的产量及糖转化率，β‑丙氨酸的产量高达50g/L，糖酸转化率达40%，具有大规模生产的应用潜力。

Description

β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种β-丙氨酸基因工程生 产菌。
背景技术
β-丙氨酸是迄今为止在自然界中发现的唯一种β-氨基酸。它是一种天然的 非蛋白氨基酸，在生物体内是泛酸的重要前体。β-丙氨酸及其衍生物广泛应用 于医药、食品、化工等行业。在医药应用中，它是许多b族维生素药物中的中 间体。在化学工业中可用于电镀缓蚀剂的制备.由于能够增强肌肉耐力的能力， β-丙氨酸经常被补充到一些功能饮料中。
β-丙氨酸的主要生产方法有化学法、酶法和发酵法。化学法包括丙烯腈法、 β-氨基丙腈法、琥珀酰亚胺降解法等，但由于成本高、工艺条件苛刻、副产物 多、生产环境不友好等缺点，其市场竞争力逐渐丧失。为了避免化学方法的缺 点，人们在酶法方面做出了很大的努力。其中，L-天冬氨酸α脱羧酶(ADC)， 因其具有催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸的能力，正成为研究的热点。大量的 研究发现，一些ADC具有较高的转化率。在此基础上，β-丙氨酸的生产取得 了很大进展。然而，由于受到酶活性、产物浓度、转化率、生产周期长等因素的影响，主要是由于该方法需要添加昂贵的天冬氨酸前体，酶法的大规模的工 业化应用受到了很大的限制。
葡萄糖等可再生原料被认为是降低生产成本的最有效途径。因此利用全细 胞生物催化生产氨基酸因其成本低、操作方便而受到越来越多的关注。最近的 许多研究都发现，该方法能有效地生产氨基酸。最近的一项研究报道，在一株 产富马酸的工程菌中过量表达ADC，获得的工程菌能够以葡萄糖为原料生产β- 丙氨酸，其产量达到32.3g/L。然而该菌株由于利用质粒转化，因此需要加入 相应的抗生素，否则容易引起质粒丢失。这在一定程度上增加了生产的成本， 限制了产品的应用。
因此，获得无需添加合成前体和抗生素的生产菌株是β-丙氨酸生产的目 标，这样通过直接发酵就可以获得高产率的β-丙氨酸，大大降低生产成本。
发明内容
为了克服现有β-丙氨酸生产技术上的缺陷，得到高效的β-丙氨酸发酵菌 株，本发明利用基因工程技术改造大肠杆菌，依据设计合理的代谢途径，通过 增强合成途径中关键基因的表达，阻断分支代谢途径，获得一株β-丙氨酸的生 产菌株。利用该菌株，在发酵生产β-丙氨酸的过程中，不需要添加前体天冬氨 酸，利用葡萄糖为原料，就能高效生产β-丙氨酸，该方法有效地降低了生产成 本，具有大规模生产β-丙氨酸的应用潜力。
因此，本发明的目的之一在于提供一种β-丙氨酸生产菌。
本发明的目的之二在于提供一种β-丙氨酸生产菌的构建方法。
本发明的目的之三在于提供所述β-丙氨酸生产菌用于生产β-丙氨酸的应 用。
本发明的技术解决方案是：
一种β-丙氨酸生产菌(Escherichia coli)，其特征是:保藏编号为CGMCC NO：17830。分类命名：大肠埃希氏菌，拉丁文学名：Escherichia coli，保藏 单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，保藏日期2019年5月20日。
该β-丙氨酸生产菌是通过以下步骤的方法构建出来的：
A.敲除原始菌株中的基因ldhA、ilvBN、pta、adhE、akI、akIII、gdh获 得基因敲除菌株；
B.增强在步骤A中所述基因敲除菌株中的基因PEPC和AspA，使这些基 因表达量增加，获得基因增强菌株；
C.在步骤B中所述的基因增强菌株中引入外源基因ADC、AspDH和PC， 获得的β-丙氨酸的生产菌。
根据本发明目的，提供上述β-丙氨酸生产菌在生产中的应用。
在上述应用中，利用上述基因工程生产菌直接发酵生产β-丙氨酸，无需在 培养基或发酵液中添加β-丙氨酸的合成前体。
在优选的实施方式中，培养基或发酵液中不添加天冬氨酸。
根据本发明的优选实施例，发酵培养基组成如下：葡萄糖2％、NaCl 0.08％, 硫酸铵0.3％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉2％、KH2PO4 1.25％、MgSO4 0.1％、 柠檬酸0.15％，pH7.0。
本发明所构建的β-丙氨酸生产菌在发酵过程中不需要添加天冬氨酸，就能 够实现发酵过程中发酵液中β-丙氨酸的有效积累，提高了β-丙氨酸的产量及糖 转化率，β-丙氨酸的产量高达50g/L，糖酸转化率达40％，具有大规模生产的 应用潜力。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅限于说明 本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明中涉及的基因名称解释如下：
ldhA：乳酸脱氢酶
ilvBN：乙酰羟酸合成酶
pta：磷酸转乙酰酶
adhE：乙醇脱氢酶
akI：天冬氨酸激酶I
gdh：谷氨酸脱氢酶
PEPC：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
AspA：天冬氨酸酶
ADC：天冬氨酸脱羧酶
AspDH：天冬氨酸脱氢酶
PC：丙酮酸羧化酶
本发明在设计基因工程菌的构建方案中，根据大肠杆菌中β-丙氨酸的代谢 途径，在大肠杆菌W3110构建了一系列突变体，如基因ldhA、ilvBN、pta、 adhE、akI、akIII、gdh等的敲除，内源基因PEPC和AspA的过表达，外源基 因如ADC、AspDH和PC的插入。其中ldhA的敲除阻断了丙酮酸生产D-乳酸 途径，ilvBN的敲除阻断了丙酮酸生产乙酰羟酸途径，pta的敲除阻断了乙酰辅 酶A生产磷酸乙酰进而合成乙酸的途径。adhE的敲除阻断了乙酰辅酶A生成 乙醇的途径，gdh的敲除阻断了α-酮戊二酸生成谷氨酸的途径，akI、akIII的 敲除阻断了天冬氨酸的分支代谢；大肠杆菌内源基因PEPC和AspA通过启动 子代换的方式增强表达，PEPC的增强表达增加了反应前体物草酰乙酸生产的 产生，AspA的增强表达增加了反应前体物天冬氨酸的产生；外源高活性基因 引入到工程菌的染色体中，ADC的引入直接催化天冬氨酸生成β-丙氨酸，PC 的引入增加了反应前体物草酰乙酸生产的产生，AspDH的引入增加了反应前 体物天冬氨酸的产生。最后获得β-丙氨酸生产的基因工程菌ZF008。
大肠杆菌β-丙氨酸的生产工程菌ZF009(保藏编号为CGMCC NO：17830。 分类命名：大肠埃希氏菌，拉丁文学名：Escherichia coli，)的构建方法，参 考Poteete AR和FentonAC报道的文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediated genereplacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182 (8):2336-2340)进行大肠杆菌基因组中基因的敲除、启动子代换、外源基因插 入。
实施例
以下实施例中，所述卡那霉素的使用终浓度为50ng/μL。所述氨苄青霉素 的使用终浓度为100ng/μL。所述氯霉素的使用终浓度为35ng/μL。
以下实施例中使用的引物序列信息表如表1所示。
实施例1：pET28a(+)的启动子突变体pET28am的制备
本实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌DH5α，重组 反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公 司。测序反应在华大公司测序，但不局限于此公司。
(1)PCR扩增：以PpET28am-F/PpET28am-R为引物，以质粒pET28a (+)为模板，PCR扩增获得pET28am片段，约5300bp，胶回收。
(2)重组反应：利用DpnI对胶回收片段进行处理，消除可能混入的原 pET28a(+)质粒，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应， 反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上。
(3)测序鉴定：阳性克隆送测序公司进行测序，确定突变成功的质粒 pET28am。
实施例2：pET28am-gene质粒的制备
本实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌DH5α，重组 反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公 司。测序反应在华大公司测序，但不局限于此公司。此处所指的gene为外源 基因ADC、AspDH和PC。
(1)全基因合成：根据来源于特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)的 基因ADC(KY123117)的序列(NO：3)，全基因合成该基因，并命名为BtADC， 并在序列两端加入NdeI和HindIII的酶切位点；根据来源于谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)的基因PC(CP025534.1)的序列(NO：4)， 全基因合成该基因，并命名为CgPC，并在序列两端加入NdeI和HindIII的酶 切位点；根据来源于(Pseudomonas aeruginosa)的基因AspDH(NP_252195.1) 的序列(NO：5)，全基因合成该基因，并命名为PaeAspDH，并在序列两端加 入NdeI和HindIII的酶切位点。
(2)将实施例1(1)中获得的基因分别用NdeI/HindIII双酶切，胶回收 的基因片段，分别与经过同样双酶切的质粒pET28am的酶切片段进行连接， 连接产物经过转化、菌落PCR鉴定、测序鉴定后获得三个质粒载体 pET28am-BtADC、pET28am-CgPC、pET28am-PadAspDH。
实施例3：pET28am-gene-Kana质粒的制备
本实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌DH5α，重组 反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公 司。测序反应在华大公司测序，但不局限于此公司。本实施例中，来源于质粒 pKD4的Kana片段分别插入实施例2中获得的pET28am-gene载体的T7终止 子下游。此处所指的gene为外源基因BtADC、PaeAspDH和CgPC。
(1)PCR扩增：以28amF1/28amR1为引物，分别以实施例2中获得的 三个质粒载体pET28am-BtADC、pET28am-CgPC、pET28am-PadAspDH为模 板，PCR扩增获得pET28am-BtADC片段(约5800bp)、pET28am-CgPC片段 (约8806bp)、pET28am-PadAspDH片段(约6184bp)，胶回收。以 28am-Kana-F1/28am-Kana-R1为引物，以质粒pKD4为模板，PCR扩增获得 28am1-Kana片段，约1600bp，胶回收。
(2)重组反应：利用DpnI分别对胶回收的pET28am-BtADC片段、 pET28am-CgPC片段、pET28am-PadAspDH片段进行处理，消除可能混入的质 粒，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒分别将该处理过的pET28am-BtADC片段、pET28am-CgPC片段、pET28am-PadAspDH片段与实 施例3中(1)获得的回收片段28am1-Kana片段进行重组反应，反应产物转化 大肠杆菌感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上。
(3)测序鉴定：阳性克隆送测序公司进行测序，确定获得在质粒 pET28am-geneT7终止子下游Kana片段的载体质粒pET28am-gene-Kana。此处 的基因分别是BtADC、PaeAspDH、CgPC，获得pET28am-BtADC-Kana、 pET28am-PaeAspDH-Kana、pET28am-CgPC-Kana质粒。
实施例4：插入ADC基因的菌株ZF001(PpET28am:BtADC,ΔakI)的制 备。
(1)PCR扩增：以akI-PpET28am-F/akI-Kana-R为引物，以质粒 pET28am-BtADC-Kana为模板，PCR扩增获得PpET28am-BtADC-Kana片段， 约2000bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入起始菌株大肠杆菌W3110 制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实 验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例4中(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨 苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3 左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediated gene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将PpET28am-BtADC-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例4中(3) 获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含 有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用akIUp/akIDown 引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为2000bp。
(5)挑取实施例4(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》 制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用akIUp/akIDown引物进行菌 落PCR验证，阳性片段长度为600bp。
(6)挑取实施例4(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含 有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明基因BtADC已 经插入到菌株ZF001的染色体中，得到ZF001(PpET28am:BtADC,ΔakI)菌 株。
实施例5：敲除ldhA基因的菌株ZF002(PpET28am:BtADC,ΔakIΔldhA) 的制备。
(1)PCR扩增：以ldhA-kana-F/ldhA-kana-R为引物，以质粒pKD4为模 板，PCR扩增获得ldhA-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例4获得的ZF001菌 株制备的感受态细胞中(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克 隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的 三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入 10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediated genereplacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将ldhA-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例5(3)中获得的感受 态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素 的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用ldhAUP/ldhADown引物进 行菌落PCR验证，阳性片段约为1600bp；
(5)挑取实施例5(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指 南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉 素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用ldhAUP/ldhADown引 物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(6)挑取实施例5(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含 有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明ldhA基因突变 成功，得到ZF002(PpET28am:BtADC,ΔakIΔldhA)菌株。
实施例6：敲除ilvBN基因的菌株ZF003(PpET28am:BtADC, ΔakIΔldhAΔilvBN)的制备。
(1)PCR扩增：以ilvBN-kana-F/ilvBN-kana-R为引物，以质粒pKD4为 模板，PCR扩增获得ilvBN-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例5获得的ZF002菌 株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆 实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例6(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青 霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右 加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将ilvBN-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例6(3)中获得的感 受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉 素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用ilvBNUp/ilvBNDown引物 进行菌落PCR验证，阳性片段约为1600bp。
(5)挑取实施例6(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指 南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉 素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用ilvBNUp/ilvBNDown 引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(6)挑取实施例6(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含 有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明ilvBN基因突变 成功，得到ZF003(PpET28am:BtADC,ΔakIΔldhAΔilvBN)菌株。
实施例7：敲除pta基因的菌株ZF004(PpET28am:BtADC, ΔakIΔldhAΔilvBNΔpta)的制备。
(1)PCR扩增：以pta-kana-F/pta-kana-R为引物，以质粒pKD4为模板， PCR扩增获得pta-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例6获得的ZF003菌 株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆 实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例7(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青 霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右 加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将pta-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例7(3)中获得的感受态 细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的 LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用ptaUp/ptaDown引物进行菌落 PCR验证，阳性片段约为1600bp。
(5)挑取实施例7(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指 南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉 素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用ptaUp/ptaDown引物进 行菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(6)挑取实施例7(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含 有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明pta基因突变成 功，得到ZF004(PpET28am:BtADC,ΔakIΔldhAΔilvBNΔpta)菌株。
实施例8：敲除adhE基因的菌株ZF005(PpET28am:BtADC, ΔakIΔldhAΔilvBNΔptaΔadhE)的制备。
(1)PCR扩增：以adhE-kana-F/adhE-kana-R为引物，以质粒pKD4为模 板，PCR扩增获得adhE-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例7获得的ZF004菌 株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆 实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例8(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青 霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右 加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将adhE-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例8(3)中获得的感受 态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素 的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用adhEUp/adhEDown引物进 行菌落PCR验证，阳性片段约为1600bp。
(5)挑取实施例8(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》 制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的 LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用adhEUp/adhEDown引物进行 菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(4)挑取实施例8(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含 有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明pta基因突变成 功，得到ZF005(PpET28am:BtADC,ΔakIΔldhAΔilvBNΔptaΔadhE)菌株。
实施例9：pET28am-Kana质粒的制备
本实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌DH5α，重组 反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公 司。测序反应在华大公司测序，但不局限于此公司。本实施例中，来源于质粒 pKD4的Kana片段插入pET28am载体的突变启动子上游。
(1)PCR扩增：以28amF2/28amR2为引物，以实施例5中获得的启动 子突变质粒pET28am为模板，PCR扩增获得pET28am2片段，约5300bp， 胶回收。以28am-Kana-F2/28am-Kana-R2为引物，以质粒pKD4为模板，PCR 扩增获得28am2-Kana片段，约1600bp，胶回收。
(2)重组反应：利用DpnI对胶回收的pET28am2片段进行处理，消除 可能混入的pET28am质粒，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒将该处 理过的pET28am2片段与实施例9(1)获得的回收片段28am2-Kana片段进行 重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB 平板上。
(3)测序鉴定：阳性克隆送测序公司进行测序，确定获得在质粒 pET28am突变启动子上游插入Kana片段的载体质粒pET28am-Kana。
实施例10：替换PEPC基因启动子的菌株ZF006(PpET28am:PEPC, PpET28am:BtADC,ΔakIΔldhAΔilvBNΔptaΔadhE)的制备。
(1)PCR扩增：以Ppepc-Kana-F/Ppepc-PpET28am-R为引物，以质粒 pET28am-Kana为模板，PCR扩增获得Ppepc-Kana-PpET28am片段，约1700bp， 胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例8获得的ZF005菌 株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆 实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例10(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄 青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左 右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediated gene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将Ppepc-Kana-PpET28am抗性盒片段电击转化进入实施例10(3) 中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于 含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用 PpepcUp/PpepcDown引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1700bp。
(5)挑取实施例10(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》 制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的 LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用PpepcUp/PpepcDown引物进 行菌落PCR验证，阳性片段长度为200bp。
(6)挑取实施例10(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含 有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明基因PEPC的启 动子被pET28am突变载体的启动子替换，得到ZF006(PpET28am:PEPC, PpET28am:BtADC,ΔakIΔldhAΔilvBNΔptaΔadhE)菌株。
实施例11：插入PC基因的菌株ZF007(PpET28am:CgPC,PpET28am:PEPC, PpET28am:BtADC,ΔakIΔldhAΔilvBNΔptaΔadhE)的制备。
(1)PCR扩增：以PEPCD-PpET28am-F/PEPCD-Kana-R为引物，以质 粒pET28am-CgPC-Kana为模板，PCR扩增获得PpET28am-CgPC-Kana片段， 约5000bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例10获得的ZF006菌 株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆 实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例11(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄 青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左 右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediated gene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将PpET28am-CgPC-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例11(3) 中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于 含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用 PEPCDUp/PEPCDDown引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为5000bp。
(5)挑取实施例11(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》 制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的 LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用PEPCDUp/PEPCDDown引物 进行菌落PCR验证，阳性片段长度为3500bp。
(6)挑取实施例11(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含 有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明基因CgPC已经 插入到菌株ZF007的染色体中，得到ZF007(PpET28am:CgPC,PpET28am:PEPC, PpET28am:BtADC,ΔakIΔldhAΔilvBNΔptaΔadhE)菌株。
实施例12：替换AspA基因启动子的菌株ZF008(PpET28am:AspA， PpET28am:CgPC,PpET28am:PEPC,PpET28am:BtADC, ΔakIΔldhAΔilvBNΔptaΔadhE)的制备。
(1)PCR扩增：以PaspA-Kana-F/PaspA-PpET28am-R为引物，以质粒 pET28am-Kana为模板，PCR扩增获得PaspA-Kana-PpET28am片段，约1700bp， 胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例11获得的ZF007菌 株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆 实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例12(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄 青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左 右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediated gene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将PaspA-Kana-PpET28am抗性盒片段电击转化进入实施例12(3) 中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于 含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用 PaspAUp/PaspADown引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1700bp。
(5)挑取实施例12(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》 制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的 LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用PaspAUp/PaspADown引物进 行菌落PCR验证，阳性片段长度为200bp。
(7)挑取实施例12(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含 有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明基因AspA的启 动子被pET28am突变载体的启动子替换，得到ZF008(PpET28am:AspA， PpET28am:CgPC,PpET28am:PEPC,PpET28am:BtADC, ΔakIΔldhAΔilvBNΔptaΔadhE)菌株。
实施例13：插入AspDH基因的菌株ZF009(PpET28am:PaeAspDH, PpET28am:AspA,PpET28am:CgPC,PpET28am:PEPC,PpET28am:BtADC, ΔakIΔldhAΔilvBNΔptaΔadhE)的制备。
(1)PCR扩增：以gdh-PpET28am-F/gdh-Kana-R为引物，以质粒 pET28am-PaeAspDH-Kana为模板，PCR扩增获得PpET28am-PaeAspDH-Kana 片段，约2400bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例12获得的ZF008菌 株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆 实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例13(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄 青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左 右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediated gene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将PpET28am-PaeAspDH-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例13 (3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后 涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用 gdhUp/gdhDown引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为2400bp。
(5)挑取实施例13(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》 制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的 LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用gdhUp/gdhDown引物进行菌 落PCR验证，阳性片段长度为900bp。
(6)挑取实施例13(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中， 37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含 有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明基因PaeAspDH 已经插入到菌株ZF008的染色体中，得到ZF009(PpET28am:PaeAspDH, PpET28am:AspA,PpET28am:CgPC,PpET28am:PEPC,PpET28am:BtADC, ΔakIΔldhAΔilvBNΔptaΔadhE)菌株。
表1引物序列表
Figure BDA0002081848920000161
Figure BDA0002081848920000171
Figure BDA0002081848920000181
Figure BDA0002081848920000191
Figure BDA0002081848920000201
Figure BDA0002081848920000211
备注：黑色斜体表示同源重组序列。
表2本发明构建的基因工程菌
Figure BDA0002081848920000221
Figure BDA0002081848920000231
实施例14：β-丙氨酸基因工程菌发酵生产β-丙氨酸
β-丙氨酸基因工程菌发酵生产β-丙氨酸的方法如下：
将构建的一系列β-丙氨酸基因工程菌ZF001-ZF009分别接入装有50ml 种子培养基的500mL三角瓶中，置于摇床培养，转速为180r/min，温度37℃， 培养12h。按5％的接种量接入摇瓶种子，转速180r/min，温度37℃，用氨水 控制pH值在7.0左右，培养7～9h。按10％的接种量接入种子液，转速200 r/min，温度控制在3 4～4 0℃之间，通气量为0.4L/L·min，流加液氨控制 pH值在7.0～7.2之间，控制发酵周期在48h内。
发酵结束后，利用HPLC测定发酵液上清中的β-丙氨酸含量，结果见表3 所示。其中发酵培养基的成分如下：60g/L蔗糖,5g/L(NH4)2SO4,1g/L KH2PO4, 0.5g/L MgSO4,0.1g/LL-methionine,0.1g/L L-isoleucine,0.1g/L L-threonine, 0.1g/L L-lysine,0.2mg/L生物素,10g/L玉米浆,10g/L豆粕水解液。
表3基因工程菌的β-丙氨酸产量比较表
Figure BDA0002081848920000232
Figure BDA0002081848920000241
HPLC检测方法如下：
色谱条件：Agillent ODS C18柱。
衍生剂配置：1％2,4-二硝基氟苯(DNFB)乙腈溶液
流动相A：乙腈：水(1:1)，相同体积的乙腈与水混合，超声脱气10-15min。
流动相B：称取醋酸钠8.2g加水约1800mL，用醋酸调pH至6.4，加水至 2000mL，超声脱气10-15min。
梯度洗脱程序如下表：
表4 HPLC梯度洗脱程序表
Figure BDA0002081848920000242
数据采集时间35.5min。
从表中可以看出，起始菌株W3110不生产β-丙氨酸，
转入BtADC基因的基因工程菌株ZF001，发酵液上清中开始出现微量β- 丙氨酸；
随着丙酮酸和乙酰辅酶A的代谢支路的阻断，构建的基因工程菌株 ZF002-ZF005发酵所得的β-丙氨酸的产量逐渐增加，说明在β-丙氨酸的合成过 程中，中间产物的流失是产量提高的限制因素；
当在基因工程菌ZF006中过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，在基因工程 菌ZF007中转入外源的丙酮酸羧化酶，所得的基因工程菌ZF006和ZF007的 发酵液中β-丙氨酸的产量较基因工程菌ZF005有一个较大的提高；
当在基因工程菌ZF007中过量表达天冬氨酸酶(AspA)，所得的基因工程 菌ZF008发酵液中的β-丙氨酸产量进一步提高，说明天冬氨酸酶的过量变大 增加了前提底物天冬氨酸的量
当在基因工程菌ZF008转入外源天冬氨酸脱氢酶基因，同时缺失谷氨酸脱 氢酶基因，所得的基因工程菌ZF009发酵液中的产量达到最高50g/L，糖酸转 化率达40.0％，且产量稳定，外源天冬氨酸脱氢酶的表达，催化草酰乙酸产生 天冬氨酸，增加了前体底物天冬氨酸的合成途径，同时阻断了三羧酸循环中中 间产物的流失，使合成途径汇聚于天冬氨酸的生成，进而催化合成β-丙氨酸， 因此ZF009可以作为β-丙氨酸生产菌。
综上所述，本发明所构建的β-丙氨酸基因工程菌在发酵过程中能够实现发 酵液中β-丙氨酸的有效积累，降低了生产成本，具有很大的应用潜力。
NO：3
Atgtatcgaacaatgatgagcggcaagcttcacagggcaactgttacggaagcaaacctgaactatgtgggaa gcattacaattgatgaagatctcattgatgctgtgggaatgcttcctaatgaaaaagtacaaattgtgaataataataatgga gcacgtcttgaaacgtatattattcctggtaaacggggaagcggcgtcatatgcttaaacggtgcagccgcacgccttgt gcaggaaggagataaggtcattattatttcctacaaaatgatgtctgatcaagaagcggcaagccacgagccgaaagtg gctgttctgaatgatcaaaacaaaattgaacaaatgctggggaacgaacccgcccgtacaattttgtag
NO：4
gtgtcgactcacacatcttcaacgcttccagcattcaaaaagatcttggtagcaaaccgcggcgaaatcgcggtc cgtgctttccgtgcagcactcgaaaccggtgcagccacggtagctatttacccccgtgaagatcggggatcattccacc gctcttttgcttctgaagctgtccgcattggtaccgaaggctcaccagtcaaggcgtacctggacatcgatgaaattatcg gtgcagctaaaaaagttaaagcagatgccatttacccgggatacggcttcctgtctgaaaatgcccagcttgcccgcga gtgtgcggaaaacggcattacttttattggcccaaccccagaggttcttgatctcaccggtgataagtctcgcgcggtaac cgccgcgaagaaggctggtctgccagttttggcggaatccaccccgagcaaaaacatcgatgagatcgttaaaagcgc tgaaggccagacttaccccatctttgtgaaggcagttgccggtggtggcggacgcggtatgcgttttgttgcttcacctga tgagcttcgcaaattagcaacagaagcatctcgtgaagctgaagcggctttcggcgatggcgcggtatatgtcgaacgt gctgtgattaaccctcagcatattgaagtgcagatccttggcgatcacactggagaagttgtacacctttatgaacgtgact gctcactgcagcgtcgtcaccaaaaagttgtcgaaattgcgccagcacagcatttggatccagaactgcgtgatcgcatt tgtgcggatgcagtaaagttctgccgctccattggttaccagggcgcgggaaccgtggaattcttggtcgatgaaaagg gcaaccacgtcttcatcgaaatgaacccacgtatccaggttgagcacaccgtgactgaagaagtcaccgaggtggacc tggtgaaggcgcagatgcgcttggctgctggtgcaaccttgaaggaattgggtctgacccaagataagatcaagaccc acggtgcagcactgcagtgccgcatcaccacggaagatccaaacaacggcttccgcccagataccggaactatcacc gcgtaccgctcaccaggcggagctggcgttcgtcttgacggtgcagctcagctcggtggcgaaatcaccgcacacttt gactccatgctggtgaaaatgacctgccgtggttccgactttgaaactgctgttgctcgtgcacagcgcgcgttggctga gttcaccgtgtctggtgttgcaaccaacattggtttcttgcgtgcgttgctgcgggaagaggacttcacttccaagcgcatc gccaccggattcattgccgatcacccgcacctccttcaggctccacctgctgatgatgagcagggacgcatcctggatt acttggcagatgtcaccgtgaacaagcctcatggtgtgcgtccaaaggatgttgcagctcctatcgataagctgcctaac atcaaggatctgccactgccacgcggttcccgtgaccgcctgaagcagcttggcccagccgcgtttgctcgtgatctcc gtgagcaggacgcactggcagttactgataccaccttccgcgatgcacaccagtctttgcttgcgacccgagtccgctc attcgcactgaagcctgcggcagaggccgtcgcaaagctgactcctgagcttttgtccgtggaggcctggggcggcgc gacctacgatgtggcgatgcgtttcctctttgaggatccgtgggacaggctcgacgagctgcgcgaggcgatgccgaa tgtaaacattcagatgctgcttcgcggccgcaacaccgtgggatacaccccgtacccagactccgtctgccgcgcgttt gttaaggaagctgccagctccggcgtggacatcttccgcatcttcgacgcgcttaacgacgtctcccagatgcgtccag caatcgacgcagtcctggagaccaacaccgcggtagccgaggtggctatggcttattctggtgatctctctgatccaaat gaaaagctctacaccctggattactacctaaagatggcagaggagatcgtcaagtctggcgctcacatcttggccattaa ggatatggctggtctgcttcgcccagctgcggtaaccaagctggtcaccgcactgcgccgtgaattcgatctgccagtg cacgtgcacacccacgacactgcgggtggccagctggcaacctactttgctgcagctcaagctggtgcagatgctgttg acggtgcttccgcaccactgtctggcaccacctcccagccatccctgtctgccattgttgctgcattcgcgcacacccgtc gcgataccggtttgagcctcgaggctgtttctgacctcgagccgtactgggaagcagtgcgcggactgtacctgccattt gagtctggaaccccaggcccaaccggtcgcgtctaccgccacgaaatcccaggcggacagttgtccaacctgcgtgc acaggccaccgcactgggccttgcggatcgtttcgaactcatcgaagacaactacgcagccgttaatgagatgctggg acgcccaaccaaggtcaccccatcctccaaggttgttggcgacctcgcactccacctcgttggtgcgggtgtggatcca gcagactttgctgccgatccacaaaagtacgacatcccagactctgtcatcgcgttcctgcgcggcgagcttggtaaccctccaggtggctggccagagccactgcgcacccgcgcactggaaggccgctccgaaggcaaggcacctctgacggaagttcctgaggaagagcaggcgcacctcgacgctgatgattccaaggaacgtcgcaatagcctcaaccgcctgctgt tcccgaagccaaccgaagagttcctcgagcaccgtcgccgcttcggcaacacctctgcgctggatgatcgtgaattctt ctacggcctggtcgaaggccgcgagactttgatccgcctgccagatgtgcgcaccccactgcttgttcgcctggatgcg atctctgagccagacgataagggtatgcgcaatgttgtggccaacgtcaacggccagatccgcccaatgcgtgtgcgt gaccgctccgttgagtctgtcaccgcaaccgcagaaaaggcagattcctccaacaagggccatgttgctgcaccattcg ctggtgttgtcaccgtgactgttgctgaaggtgatgaggtcaaggctggagatgcagtcgcaatcatcgaggctatgaa gatggaagcaacaatcactgcttctgttgacggcaaaatcgatcgcgttgtggttcctgctgcaacgaaggtggaaggt ggcgacttgatcgtcgtcgtttcctaa
NO：5
Atgctgaatatcgtcatgatcggctgcggcgccatcggcgccggcgtcctggaactgttggagaacgatccgc aactgagggtcgatgcggtgatcgttcctcgcgactccgagacccaggtccgccatcgcctggccagcctgcgccgg ccgccgcgggtactcagcgcgctgccggccggagagcgccccgatcttctggtggagtgcgccgggcaccgcgcc atcgagcagcacgtgctgccggcgctggcccaaggcattccctgcctggtggtctcggtgggcgcgctgtccgagcc gggcctggtggagcgcctggaagccgcggcgcaggccggaggcagccgcatcgagctgctgcccggcgccatcg gcgccatcgatgcgctgtcggcggccagggtcggtggcctcgaatcggtgcgctacaccgggcgcaagccggcga gcgcctggctgggcacgccaggcgagacggtctgcgacctgcagcgcctggagaaggcgcgggtgatcttcgacg gcagcgcccgcgaggcggcgcggctctatccgaagaacgccaatgtcgccgccaccctgtcgctcgccggcctcgg cctggaccgcacccaggtgcgcctgatcgccgaccccgaaagctgcgagaacgtgcaccaggtggaagccagcgg cgccttcggcggcttcgaactgaccttgcgcggcaaaccgctggcggccaacccgaagacatcggcgctgaccgtgt acagcgtggtccgagcgttgggcaaccacgcccacgcgatttcgatctag。
SEQUENCE LISTING
<110> 鲁东大学
<120> β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途
<130> 2019.06.03
<160> 52
<170> PatentIn version 3.3
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ttaaatcacaccctgcgccagc 22

Claims (5)

1.一种β-丙氨酸生产菌(Escherichia coli)，其特征是：保藏编号为 CGMCC NO：17830。
2.一种权利要求1所述的β-丙氨酸生产菌的制备方法，其特征是：依次包括以下步骤：
A.敲除作为原始菌株的大肠杆菌W3110中的基因ldhA、ilvBN、pta、adhE、gdh,获得基因敲除菌株；
B.增强步骤A中所述基因敲除菌株中的基因PEPC、AspA；
C.将外源基因ADC、PC和AspDH插入到步骤B中所述菌株的染色体中，获得β-丙氨酸生产菌。
3.一种权利要求1所述的β-丙氨酸生产菌在生产β-丙氨酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的β-丙氨酸生产菌在生产β-丙氨酸中的应用，其特征是：通过所述β-丙氨酸生产菌的发酵来生产β-丙氨酸。
5.根据权利要求4所述的β-丙氨酸生产菌在生产β-丙氨酸中的应用，其特征是：通过所述β-丙氨酸生产菌的发酵来生产β-丙氨酸时，采用的发酵培养基组成如下：葡萄糖 2%、NaCl 0.08%,硫酸铵 0.3%、蛋白胨 0.5%、酵母浸粉2%、KH2PO4 1.25%、 MgSO4 0.1%、柠檬酸0.15%，pH7.0。
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