CN116904431A - 一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用 - Google Patents

一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用。所述乙酰羟酸合酶突变体为乙酰羟酸合酶的氨基酸序列中第17位由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸得到。本发明提供了乙酰羟酸合酶第17位氨基酸的多种突变方式，并进一步发现菌株中乙酰羟酸合酶的这些第17位氨基酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸后，其在生产支链氨基酸的效率显著提高，具体表现为主要氨基酸产物的产量大幅度提高，副产物大幅下降，这在提高菌株生产支链氨基酸的领域具有重要意义。

Description

一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用。
背景技术
现有技术中，支链氨基酸(例如：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)在各种工业应用中用于生产各种产品，例如人类营养增强剂，动物饲料添加剂，医疗产品成分和化妆品等。支链氨基酸的生物合成具有共同的前体物(丙酮酸)和相同的酶(乙酰羟酸合酶)，因此难以通过微生物发酵生物合成单一种类的支链氨基酸。
乙酰羟酸合酶是支链氨基酸生物合成的第一个酶，也是支链氨基酸生物合成的关键酶，催化两分子丙酮酸生成乙酰乳酸(乙酰乳酸是缬氨酸和亮氨酸的前体物)，同时也催化a-酮基丁酸和丙酮酸生成a-乙酰羟基丁酸(a-乙酰羟基丁酸是异亮氨酸的前体物)。因此，乙酰羟酸合酶是支链氨基酸生物合成非常重要的酶。
乙酰羟酸合酶由两个亚基组成，分别是大亚基IlvB蛋白和小亚基IlvN蛋白。大亚基IlvB蛋白由ilvB基因编码，具有催化活性；小亚基IlvN蛋白由ilvN基因编码，起到反馈抑制的调控作用，受缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的反馈抑制。
支链氨基酸的生产方法有三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产支链氨基酸最主要的方法。但因菌种的发酵性能仍较差，副产物较高，导致其转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用。
第一方面，本发明提供一种乙酰羟酸合酶突变体，所述乙酰羟酸合酶突变体为乙酰羟酸合酶的氨基酸序列中第17位由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸得到。
ilvN基因编码的乙酰羟酸合酶是支链氨基酸生物合成的第一个酶，也是支链氨基酸生物合成的关键酶，催化两分子丙酮酸生成乙酰乳酸(乙酰乳酸是缬氨酸和亮氨酸的前体物)，同时也催化a-酮基丁酸和丙酮酸生成a-乙酰羟基丁酸(a-乙酰羟基丁酸是异亮氨酸的前体物)。本发明通过对ilvN基因修饰，将乙酰羟酸合酶的第17位氨基酸由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸，实现了对乙酰羟酸合酶的突变，使得所述微生物产副产物缬氨酸和亮氨酸的能力下降，产异亮氨酸的能力与未修饰的菌株相比增强，最终提高了异亮氨酸的产量。
进一步地，所述乙酰羟酸合酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列(突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-5所示)。
本发明进一步提供用于编码所述乙酰羟酸合酶突变体的核酸。
第二方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶中第17位由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。
进一步地，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶包括如SE ID NO.3-5任一所示的氨基酸序列。
进一步地，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶由如SEQ ID NO.6-8任一所示的核苷酸序列编码得到。
进一步地，所述重组微生物以棒杆菌为出发菌株；优选以谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种为出发菌株。
进一步地，所述重组微生物中还包括表达水平提高的ppc基因和/或gnd基因。例如通过在位点cg1507处整合以Ptac为启动子的ppc基因可以强化ppc基因的表达，将gnd基因的原有启动子替换为强启动子Ptac，以强化gnd基因的表达。
其中，ppc基因编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸、HCO3-和H2O生成草酰乙酸，从而增加异亮氨酸生物合成的前体草酰乙酸的供应，达到提高异亮氨酸产量的目的。
gnd基因编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，催化6-磷酸-D-葡萄糖酸和NADP+生成5-磷酸-D-核酮糖和NADPH，从而增强还原力NADPH的供应，达到提高异亮氨酸产量的目的。
本发明进一步提供所述乙酰羟酸合酶突变体或所述核酸在提高菌株氨基酸产量中的应用。
进一步地，所述菌株为谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种；所述氨基酸为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的一种或多种。
进一步地，所述应用为提高菌株主要氨基酸产物的产量，降低其副产物的产量，例如提高异亮氨酸的产量，降低亮氨酸和缬氨酸的产量。
本发明进一步提供所述重组微生物在生产氨基酸中的应用；优选地，所述氨基酸为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的一种或多种。
本发明具备如下有益效果：
本发明提供了一种乙酰羟酸合酶突变体，针对乙酰羟酸合酶第17位氨基酸发生多种类型的突变，将该突变体应用于菌株中时，发现乙酰羟酸合酶第17位氨基酸由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸时，其生产支链氨基酸的效率显著提高，具体表现为主要氨基酸产物的产量大幅度提高，副产物大幅下降。
具体地，乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvND17L、2-ilvND17V、2-ilvND17A的异亮氨酸产量和转化率较出发菌株显著提高，且副产物缬氨酸和亮氨酸产量大幅下降，菌株的生长正常，仍能够保持较好的生长性能。其中，乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvND17A表现最为突出，异亮氨酸产量为5.6g/L，比出发菌株产量提高3.0g/L，提高了115％；副产物缬氨酸产量为3.1g/L，较出发菌株亮氨酸产量下降46.5％；副产物亮氨酸产量为1.5g/L，较出发菌株亮氨酸产量下降50％。因此可以看出，当乙酰羟酸合酶第17位氨基酸由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸后，异亮氨酸产量均有提升，缬氨酸、亮氨酸产量均有下降，尤其以天冬氨酸突变为亮氨酸后效果最好。
本发明进一步发现，在乙酰羟酸合酶突变体的基础上，叠加ppc基因增强的突变菌株，以及叠加ppc基因和gnd基因共同增加的突变菌株，异亮氨酸的产量进一步得到增加，尤其以突变菌株2-ilvND17A/ppc/gnd(乙酰羟酸合酶突变体2-ilvND17A叠加ppc基因和gnd基因)效果最佳，异亮氨酸产量为10.3g/L，比出发菌株产量提高7.7g/L，提高了近3倍；副产物缬氨酸产量为0.6g/L，较出发菌株亮氨酸产量下降89.6％；副产物亮氨酸产量为1.9g/L，较出发菌株亮氨酸产量下降36.7％。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中未注明的具体技术或条件，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器若未注明生产厂商，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
以下实施例中涉及的出发菌株MHZ-1012-2为谷氨酸棒杆菌，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13406，见专利文件CN201611250330.1。
以下实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
表1引物
实施例1构建乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvND17L、2-ilvND17V、2-ilvND17A
本实施例以MHZ-1012-2为出发菌株，将MHZ-1012-2中ilvN基因突变为编码SEQ IDNO.6-8所示的乙酰羟酸合酶突变体的基因，依次构建乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvND17L、2-ilvND17V、2-ilvND17A。具体构建方法如下。
1、质粒pK18mobsacB-ilvND17L的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以出发菌株MHZ-1012-2的基因组为模板，以ilvND17L-UP-1F/ilvND17L-UP-1R为引物，制备重组片段UP-1，以ilvND17L-DN-2F/ilvND17L-DN-2R为引物，制备重组片段DN-1；以模式菌株ATCC13032的基因组为模板，以ilvND17L-1F/ilvND17L-1R为引物，制备重组片段ilvND17L；以质粒pk18-mob-sacB为模板，以ilvND17L-pk18-3F/ilvND17L-pk18-3R为引物获得片段pk18-1，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系表2所示。
表2吉普森组装反应体系
组分 UP-1 DN-1 ilvND17L pk18-1 CE Buffer CE Exnase 无菌水
体积/μL 1 1 1 2 4 2 9
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ilvND17L。
2、质粒pK18mobsacB-ilvND17V的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以出发菌株MHZ-1012-2的基因组为模板，以ilvND17L-UP-1F/ilvND17V-UP-1R为引物，制备重组片段UP-2，以ilvND17L-DN-2F/ilvND17L-DN-2R为引物，制备重组片段DN-2；以模式菌株ATCC13032的基因组为模板，以ilvND17V-1F/ilvND17L-1R为引物，制备重组片段ilvND17V；以质粒pk18-mob-sacB为模板，以ilvND17L-pk18-3F/ilvND17L-pk18-3R为引物获得片段pk18-2，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系表3所示。
表3吉普森组装反应体系
组分 UP-2 DN-2 ilvND17V pk18-2 CE Buffer CE Exnase 无菌水
体积/μL 1 1 1 2 4 2 9
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ilvND17V。
3、质粒pK18mobsacB-ilvND17A的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以出发菌株MHZ-1012-2的基因组为模板，以ilvND17L-UP-1F/ilvND17A-UP-1R为引物，制备重组片段UP-3，以ilvND17L-DN-2F/ilvND17L-DN-2R为引物，制备重组片段DN-3；以模式菌株ATCC13032的基因组为模板，以ilvND17A-1F/ilvND17L-1R为引物，制备重组片段ilvND17A；以质粒pk18-mob-sacB为模板，以ilvND17L-pk18-3F/ilvND17L-pk18-3R为引物获得片段pk18-3，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系表4所示。
表4吉普森组装反应体系
组分 UP-3 DN-3 ilvND17A pk18-3 CE Buffer CE Exnase 无菌水
体积/μL 1 1 1 2 4 2 9
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ilvND17A。
4、乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvND17L、2-ilvND17V、2-ilvND17A的构建
将上述步骤1、2、3所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-ilvND17L、pK18mobsacB-ilvND17V、pK18mobsacB-ilvND17A分别转入出发菌株MHZ-1012-2中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。
此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h，对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，分别命名为2-ilvND17L、2-ilvND17V、2-ilvND17A。
实施例2ppc基因增强突变体的构建
在实施例1构建的乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvND17L、2-ilvND17V、2-ilvND17A中进一步在位点cg1507处整合以Ptac为启动子的ppc基因，以强化ppc基因的表达，具体方法如下。
1、质粒pK18mobsacB-ppc的构建
以出发菌株MHZ-1012-2的基因组为模板，以PI-ppc-1f/PI-ppc-1r为引物制备上同源臂重组片段UP4，以PI-ppc-2f/PI-ppc-2为引物制备ppc基因及终止子重组片段PPC，以PI-ppc-4f/I-ppc-4r为引物制备下同源臂重组片段DN4；以质粒pXMJ19为模板，以PI-ppc-3f/PI-ppc-3r为引物制备tac启动子的重组片段Ptac；以质粒pK18-mob-sacB为模板，以PI-pK18-F/PI-pK18-R为引物制备重组片段pk18-4，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系表5所示。
表5吉普森组装反应体系
组分 UP-4 PPC DN-4 Ptac pk18-4 CE Buffer CE Exnase 无菌水
体积/μL 1 1 1 1 2 4 2 8
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ppc。
2、ppc基因增强突变菌的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-ppc分别转入实施例1构建的乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvND17L、2-ilvND17V、2-ilvND17A中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。
此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定，通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，分别命名为2-ilvND17L/ppc、2-ilvND17V/ppc、2-ilvND17A/ppc。
实施例3 gnd基因增强突变体的构建
在实施例2构建的突变菌株2-ilvND17L/ppc、2-ilvND17V/ppc、2-ilvND17A/ppc中，将gnd基因的原有启动子替换为强启动子Ptac，以强化gnd基因的表达，具体方法如下。
1、质粒pK18mobsacB-gnd的构建
以出发菌株MHZ-1012-2的基因组为模板，以PI-gnd-1f/PI-gnd-1r为引物制备上同源臂重组片段UP5，以PI-gnd-3f/PI-gnd-3r为引物制备下同源臂重组片段DN5；以质粒pXMJ19为模板，以PI-gnd-2f/PI-gnd-2r为引物制备tac启动子的重组片段Ptac；利用重叠PCR将3个重组片段进行融合，并利用酶切位点BamHI/EcoRI将融合片段与pK18-mob-sacB载体连接，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-gnd。
2、gnd基因增强突变菌的构建
将上述步骤1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-gnd分别转入实施例2构建的突变菌株2-ilvND17L/ppc、2-ilvND17V/ppc、2-ilvND17A/ppc中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。
此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，分别命名为2-ilvND17L/ppc/gnd、2-ilvND17V/ppc/gnd、2-ilvND17A/ppc/gnd。
实施例4摇瓶发酵验证
将实施例1-3构建得到的突变菌株与出发菌株MHZ-1012-2一同进行摇瓶发酵，比较生产性能。
1、摇瓶发酵使用的培养基如下：
(1)固体活化平板：BHI培养基37g/L，琼脂粉20g/L。
(2)种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，尿素1.5g/L，KH2PO4 4g/L，K2HPO4 8g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，生物素100μg/L，盐酸硫胺素1000μg/L，泛酸钙2000μg/L，烟酰胺2000μg/L，pH调至7.0。
(3)发酵培养基：葡萄糖100g/L、豆粕提取物9.75g/L、玉米浆干粉14.4g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、KH2PO4·12H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、VB10.01g/L、(NH4)2SO4 50g/L，蒸馏水配制，pH调至7.0。
2、摇瓶发酵的方法如下：
(1)种子培养：在平板上刮取1环菌体接种到含有50ml种子培养基的500ml锥形瓶中，然后在30℃条件下、以110rpm振荡培养15-17h至OD值为16-18。
(2)摇瓶发酵：按10％的接种量转接至装有25ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，然后在30℃条件下、以135rpm振荡培养持续48小时。
(3)培养后使用HPLC检测发酵液中氨基酸的含量。发酵结果如表6所示。
表6摇瓶发酵结果
注：*表示与出发菌株相比具有显著差异(P＞0.05)。
以上结果表明，出发菌株MHZ-1012-2的异亮氨酸产量仅为2.6g/L，乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvND17L、2-ilvND17V、2-ilvND17A的异亮氨酸产量和转化率较出发菌株显著提高，且副产物缬氨酸和亮氨酸产量大幅下降，菌株的生长正常，仍能够保持较好的生长性能。其中，乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvND17A表现最为突出，异亮氨酸产量为5.6g/L，比出发菌株产量提高3.0g/L，提高了115％；副产物缬氨酸产量为3.1g/L，较出发菌株亮氨酸产量下降46.5％；副产物亮氨酸产量为1.5g/L，较出发菌株亮氨酸产量下降50％。
由此可见，本发明提供的乙酰羟酸合酶突变体及乙酰羟酸合酶突变菌株对目标产物异亮氨酸的产量提升具有显著的促进作用，对副产物缬氨酸、亮氨酸产量有显著的降低作用。该乙酰羟酸合酶突变体及其重组微生物为产缬氨酸异亮氨酸及以其为前体的衍生物的生产菌株的构建提供借鉴。
以上结果同时表明，在乙酰羟酸合酶突变体的基础上，叠加ppc基因增强的突变菌株，以及叠加ppc基因和gnd基因共同增加的突变菌株，异亮氨酸的产量进一步得到增加，尤其以突变菌株2-ilvND17A/ppc/gnd(乙酰羟酸合酶突变体2-ilvND17A叠加ppc基因和gnd基因)效果最佳，异亮氨酸产量为10.3g/L，比出发菌株产量提高7.7g/L，提高了近3倍；副产物缬氨酸产量为0.6g/L，较出发菌株亮氨酸产量下降89.6％；副产物亮氨酸产量为1.9g/L，较出发菌株亮氨酸产量下降36.7％。结果表明，在乙酰羟酸合酶突变体的基础上增加前体供应和还原力供应对于提高异亮氨酸的产量具有显著的促进作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 冯波
<120> 一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用
<130> KHP211121307.8
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln
1 5 10 15
Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg
20 25 30
Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr His Gly
35 40 45
Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu
50 55 60
Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val
65 70 75 80
Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys
85 90 95
Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn
100 105 110
Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile
115 120 125
Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met
130 135 140
Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu
145 150 155 160
Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile
165 170
<210> 2
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 60
atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120
tctgcaaaga ccgaaacaca cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180
ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240
cgacttgatg aagagaccac tatcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggac 300
agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360
gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420
cttgacgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480
aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519
<210> 3
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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Leu Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttgacgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480
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<211> 519
<212> DNA
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<400> 7
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<210> 14
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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<210> 16
<211> 47
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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<210> 20
<211> 50
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atcctgtccg tactcgttca ggccgtagac ggaatcattt cccgcgtatc 50
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
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<400> 21
tctagagtcg acctgcaggc caaaccaccg ctaatgatgt 40
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acggcaaagg aacattttcc acgggtactg catatgattg gg 42
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 25
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
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<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgtcaacagc tcaaacgtcc tttcggtgtt ttcgcaacaa 40
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggccagtgcc aagcttgcat ttctgtcata tgcgaagctt 40
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cggtccttga tcaacacctt 20
<210> 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cggtccttga tcaacacctt 20
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
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<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtcgactcta gaatgactaa tggagataat ctc 33
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gattatctcc attagtcatt ctagagtcga cctgcaggca 40
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cactaccccc aaatggttca ggcagccatc ggaagctgtg 40
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gatggctgcc tgaaccattt gggggtagtg gccat 35
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cgggatccga gatctgatca acagagag 28
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aacttagcgc gaatgatgca 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtctccaaag acccatccac 20

Claims (10)

1.一种乙酰羟酸合酶突变体，其特征在于，所述乙酰羟酸合酶突变体为乙酰羟酸合酶的氨基酸序列中第17位由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸得到。
2.根据权利要求1所述的乙酰羟酸合酶突变体，其特征在于，所述乙酰羟酸合酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。
3.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1或2所述的乙酰羟酸合酶突变体。
4.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶中第17位由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶包括如SE ID NO.3-5任一所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶由如SEQ ID NO.6-8任一所示的核苷酸序列编码得到。
7.根据权利要求4-6任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物以棒杆菌为出发菌株；优选以谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种为出发菌株。
8.根据权利要求4-7任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中还包括强化表达的ppc基因和/或gnd基因。
9.权利要求1或2所述的乙酰羟酸合酶突变体、或权利要求3所述核酸在提高菌株氨基酸产量中的应用；
优选地，所述菌株为谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种；和/或，所述氨基酸为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的一种或多种。
10.权利要求4-7任一项所述的重组微生物在生产氨基酸中的应用；优选地，所述氨基酸为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的一种或多种。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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