CN113969269A - D-氨基酸氧化酶突变体及其在制备l-草铵膦中的应用 - Google Patents

D-氨基酸氧化酶突变体及其在制备l-草铵膦中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及D‑氨基酸氧化酶突变体及其在制备L‑草铵膦中的应用。所述D‑氨基酸氧化酶突变体当与包含SEQ ID NO.1所示序列的D‑氨基酸氧化酶的氨基酸序列比对时，所述D‑氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列包含对应于第62位和/或第226位的氨基酸残基的替换，所述第62位和第226位是参照SEQ ID NO.1限定的，并且所述D‑氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少90％的同一性。

Description

D-氨基酸氧化酶突变体及其在制备L-草铵膦中的应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域；特别地，本申请涉及D-氨基酸氧化酶突变体，所述D-氨基酸氧化酶突变体在制备L-草铵膦中的用途，以及一种利用所述D-氨基酸氧化酶突变体制备L-草铵膦的方法。
背景技术
草铵膦(又名双丙氨膦、草丁膦，商品名包括保试达、百速顿等，英文名为phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸)是德国赫斯特公司(现属于拜耳公司)在20世纪80年代开发的一种低毒、高效、非选择性触杀型有机磷除草剂。草铵膦作用于植株后可以抑制谷氨酰胺合成酶，从而中断植物体内谷氨酸的可逆反应，造成代谢紊乱，使植物堆积过量的氨而中毒，同时导致植物无法合成叶绿素从而光合作用受到抑制，导致植物死亡。草铵膦主要用于果园、马铃薯田、非耕地等，用于防治一年生和多年生的禾本科及双子叶杂草，如马唐、狗尾草、野小麦；多年生的禾本科杂草和莎草，如羊茅、鸭芽等。
灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部已发布公告说明，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。
草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦，但只有L-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。
目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。
手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。
手性拆分法需要使用价格昂贵的手性拆分剂(例如奎宁)，拆分的步骤非常繁琐(例如需要经历成盐、诱导结晶、解盐等步骤)，并且拆分的理论收率只有50％，这导致此路线的工业价值比较低。
化学合成法包括不对称合成法和天然氨基酸手性源法等，其缺点包括需要用到昂贵的贵金属和配体或起始原料或反应路线需要剧毒物质或反应合成路线较长等。
生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下两类：(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体；(2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得，主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但是理论收率只能达到50％，造成原料浪费。
除了这两种传统的生物催化法，以D,L-草铵膦为原料的去消旋合成方法凸显了巨大的成本优势。由于市售的草铵膦为D,L-草铵膦，其工业化生产技术已十分成熟，去消旋合成方法直接以D,L-草铵膦为原料，简单易得，成本较低，能够较好对接现有草铵膦工业生产体系。
发明内容
本申请基于D-氨基酸氧化酶突变体的鉴定，这些突变体可用于改进L-草铵膦的生物酶法生产。
在第一方面，本申请涉及具有D-氨基酸氧化酶(DAAO)活性的D-氨基酸氧化酶突变体，其中，当与包含SEQ ID NO.1所示序列的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列比对时，所述D-氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列包含对应于第62位和/或第226位的氨基酸残基的替换，所述第62位和第226位是参照SEQ ID NO.1限定的，并且所述D-氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少90％的同一性。
在一些实施方式中，所述第62位的氨基酸残基的替换为F62K，即第62位的氨基酸残基由F替换为K。在一些实施方式中，所述第226位的氨基酸残基的替换为M226T，即第226位的氨基酸残基由M替换为T。
在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体当与包含SEQ ID NO.1所示序列的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列比对时包含F62K氨基酸替换，其中氨基酸的位置是参照SEQ ID NO.1限定的。在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体当与包含SEQ IDNO.1所示序列的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列比对时包含M226T氨基酸替换，其中氨基酸的位置是参照SEQ ID NO.1限定的。在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体当与包含SEQ ID NO.1所示序列的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列比对时包含F62K和M226T氨基酸替换，其中氨基酸的位置是参照SEQ ID NO.1限定的。
包含SEQ ID NO.1所示序列的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列在本申请中可以被称为具有D-氨基酸氧化酶活性的野生型酶。所述野生型酶的核苷酸序列可以为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
本申请所述的“D-氨基酸氧化酶突变体”具有D-氨基酸氧化酶活性，即将D-氨基酸转化成氨、酮酸(酮酸种类由D-氨基酸底物决定)和过氧化氢的活性，特别地，本申请所述的D-氨基酸氧化酶突变体具有将D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)的活性。
“氨基酸的位置是参照SEQ ID NO.1限定的”是指D-氨基酸氧化酶突变体中的氨基酸在与SEQ ID NO.1的氨基酸序列进行比对时与特定氨基酸位置(例如第62位、第226位)对齐。
与具有D-氨基酸氧化酶活性的野生型酶相比，本申请的D-氨基酸氧化酶突变体可以具有改进的活性，例如具有在将D,L-草铵膦中的D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的催化反应中的更高的催化效率，对氧气的利用效率高，以及任选地具有利于在生产L-草铵膦的生物催化法，特别是本申请所描述的生物催化法中使用的更佳的稳定性等。
本申请中所用的术语“催化效率”是指D-氨基酸氧化酶允许其将D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的性质。在一个实施方案中，与野生型或参照D-氨基酸氧化酶相比，本申请的D-氨基酸氧化酶突变体的催化效率得以增强。优选地，本申请的D-氨基酸氧化酶突变体的催化效率是野生型或参照D-氨基酸氧化酶的催化效率的至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或3.1倍。
在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体来源于Microbotryumintermedium。
在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体的核苷酸序列与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体包含与野生型酶相比具有一个或几个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸替换、缺失和/或插入的氨基酸序列和/或与野生型酶相比具有一个或多个截短的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体当与包含SEQ ID NO.1所示序列的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列比对时的氨基酸替换为第62位和/或第226位的氨基酸残基的替换。
在第二方面，本申请提供了包含编码上述D-氨基酸氧化酶突变体的序列的核酸或多核苷酸序列。所述核酸或多核苷酸序列可以是经分离的。
术语“核酸”或“多核苷酸”旨在指包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
在第一方面中描述的特征、定义和优选项同样适用于第二方面。
在第三方面，本申请提供了包含上述核酸或多核苷酸序列的表达载体。所述表达载体可以包含与能够指导上述D-氨基酸氧化酶突变体在合适表达宿主中表达的一种或更多种控制序列可操作的连接。
术语“可操作的连接”是指处于功能关系的多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列)的连接。当核酸序列被置于与另一核酸序列的功能关系中时，其是“可操作的连接”的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。在一些实施方式中，所述控制序列可以包括启动子、增强子、终止子等。
表达载体可以是可方便地进行重组DNA程序并且可引起D-氨基酸氧化酶突变体的多核苷酸表达的任何载体(例如质粒或病毒)。表达载体的选择通常取决于载体与待引入所述载体的细胞的相容性。所述表达载体可以作为染色体外实体而存在、其复制独立于染色体复制的载体，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。或者，表达载体可以是当被引入宿主细胞时整合至基因组中并与其已整合至其中的染色体一起复制的载体。
可将多于一个拷贝(例如2个、3个或4个)的本申请的表达载体插入宿主细胞中以增加由包含在表达载体内的核酸序列编码的D-氨基酸氧化酶突变体的产生(过表达)。
在一些实施方式中，本申请的表达载体还可以包含编码甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或醇脱氢酶的核酸序列，以实现这些脱氢酶与突变体的表达，优选与L-氨基酸脱氢酶突变体共表达。
在第一和第二方面中描述的特征、定义和优选项同样适用于第三方面。
在第四方面，本申请提供了一种重组宿主细胞，其包含本申请所述的核酸或者本申请所述的表达载体。
在一些实施方式中，所述重组宿主细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞属于酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、腐质霉属(Humicola)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、耶氏酵母属(Yarrowia)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)或埃希氏杆菌属(Escherichia)；优选地属于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolitica)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)中的一种。
可以通过常规转化或转染技术将本申请的表达载体引入原核或真核细胞中。在本文中使用时，术语“转化”和“转染”旨在指用于将外来核酸(例如DNA)引入本领域技术人员公知的宿主细胞中的多种本领域公认的技术。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版.Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)，Davis等,Basic Methods in Molecular Biology(1986)和其他实验室手册。
在一些实施方式中，所述重组宿主细胞是共表达(a)具有将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸转化为L-草铵膦活性的L-氨基酸脱氢酶和(b)选自甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或醇脱氢酶的脱氢酶的宿主细胞。
在第一、第二、第三方面中描述的特征、定义和优选项同样适用于第四方面。
在第五方面，本申请提供了本申请所述的D-氨基酸氧化酶突变体、核酸、表达载体或重组宿主细胞在制备L-草铵膦中的用途。
在第一、第二、第三、第四方面中描述的特征、定义和优选项同样适用于第五方面。
在第六方面，本申请提供了一种制备L-草铵膦的方法，其包括在酶催化体系的存在下使D-草铵膦发生转化反应生成L-草铵膦，其中所述酶催化体系包括用于将D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶突变体。
在一些实施方式中，所述D-草胺膦最初存在于D-和L-草胺膦或其盐的外消旋混合物中。外消旋的草胺膦起始原料可以以多种形式提供。可使用外消旋草胺膦的各种盐，诸如铵盐和盐酸盐，或两性离子。
在一些实施方式中，所述酶催化体系还包含用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸转化为L-草铵膦的L-氨基酸脱氢酶。在一些实施方式中，所述L-氨基酸脱氢酶是Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶。L-氨基酸脱氢酶或Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶可以为本领域已知的任何具有L-氨基酸脱氢酶或Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶活性的酶或其变体。例如，CN109750009B、CN109609475B、CN110791484B中描述的L-氨基酸脱氢酶。
在一些实施方式中，所述酶催化体系中还包括过氧化氢酶。所述过氧化氢酶用于去除副产物过氧化氢，因为过氧化氢积累会对酶催化剂有毒害作用。过氧化氢酶可以为本领域已知的任何具有过氧化氢酶活性的酶，例如购自宁夏夏盛实业集团有限公司，商品编号为CAT-400的过氧化氢酶。
在一些实施方式中，所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统选自以下中的至少一种：
(1)甲酸脱氢酶辅酶循环系统：包括甲酸脱氢酶，甲酸盐和辅酶；
(2)葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统：包括葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和辅酶；
(3)醇脱氢酶辅酶循环系统：包括醇脱氢酶，异丙醇和辅酶。
在一些优选的实施方式中，所述辅酶是NADH。本申请所述的甲酸脱氢酶(FDH)可以为本领域已知的任何具有甲酸脱氢酶活性的酶或酶变体。在一些实施方式中，所述甲酸脱氢酶来源于Lactobacillus buchneri。在一些实施方式中，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，所述甲酸脱氢酶的核苷酸序列与SEQ ID No.7所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本申请所述的葡萄糖脱氢酶(GDH)可以为本领域已知的任何具有葡萄糖脱氢酶活性的酶或酶变体。在一些实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶来源于Exiguobacteriumsibiricum。在一些实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本申请所述的醇脱氢酶(ADH)可以为本领域已知的任何具有醇脱氢酶活性的酶或酶变体。在一些实施方式中，所述醇脱氢酶来源于Lactobacillus brevis。在一些实施方式中，所述醇脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，所述醇脱氢酶的核苷酸序列与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本申请所述的酶(例如D-氨基酸氧化酶突变体、Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶、过氧化氢酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或醇脱氢酶)的形式可以为：纯化的酶；部分纯化的酶；无细胞提取物或粗细胞提取物；液体、粉末或固定形式；含有酶的可透化处理的细胞、完整细胞或完整发酵液或其他任何合适形式。在一些实施方式中，所述酶催化体系中的每种酶的形式各自独立地选自：游离酶和表达酶的重组宿主细胞。
在一些实施方式中，其中所述表达酶的重组宿主细胞各自独立地选自：酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、腐质霉属(Humicola)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、耶氏酵母属(Yarrowia)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)或埃希氏杆菌属(Escherichia)；例如选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolitica)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些实施方式中，所述转化反应在反应液中进行。优选地，所述反应液的pH为7-10，优选pH为8-9的反应液。在pH为7-10的反应液中，优选在pH为8-9的反应液中进行反应时可以获得更优的反应效率。
本申请所述的方法可以包括：发生由D-氨基酸氧化酶突变体催化的氧化反应的步骤a)和发生由Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶催化的转氨反应的步骤b)。
在一些实施方式中，步骤a)的氧化反应的温度为25-45℃，例如30-45℃，35-45℃等；时间为6-24小时，例如6-12小时，12-24小时，例如6小时、12小时等。
在步骤b)中，步骤a)中产生的PPO被L-氨基酸脱氢酶催化还原为L-草铵膦，从而实现D,L-草铵膦的原位去消旋化，得到ee值大于99％的L-草铵膦。
在一些实施方式中，步骤b)的反应体系中还包括辅酶NADH。在一些实施方式中，NADH与底物的摩尔比为1:10-1:5000。在一些实施方式中，以摩尔浓度计，NADH的添加量为0.1-2mM；更优选为0.5mM。在一些实施方式中，步骤b)的还原胺化反应的温度为25-45℃，例如30-45℃，35-45℃等；时间为6-24小时，例如6-12小时，12-24小时，例如6小时、12小时等。
在一些实施方式中，在步骤b)中，反应开始时无机铵供体与底物的摩尔比为1:1-10:1。
在一些实施方式中，在步骤b)中，无机铵供体可以为磷酸铵、氯化铵、硫酸铵、甲酸铵、乙酸铵、氨水；优选地，无机铵供体可以为磷酸铵、甲酸铵、氨水；更优选，无机铵供体可以为氨水。
在一些实施方式中，本申请的方法中不额外添加过氧化氢。本方法中D-氨基酸氧化酶或其突变体在催化反应时，对氧气的利用效率高，仅在通过通气搅拌过程所提供的氧气浓度下，即可满足实现高效催化氧化反应的需求。
本申请所述的方法可以在一个或更多个反应容器中进行。优选地，本申请所述的方法在一个反应容器中进行(即“一锅两步法”)。
在一些优选的实施方式中，步骤a)中使用的D-氨基酸氧化酶突变体由第一重组微生物表达。因此，步骤a)可以包括：在第一重组微生物和氧气的存在下，使D,L-草铵膦发生氧化反应得到2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。利用所述第一重组微生物能够赋予本申请方法更高的催化效率。可以利用本领域已知的任何方法构建所述第一重组微生物。例如，所述第一重组微生物可以如下构建：构建包含所述D-氨基酸氧化酶突变体基因的重组表达载体，将所述重组表达载体转化至微生物，对获得的重组微生物进行诱导培养，分离培养液得到含有D-氨基酸氧化酶突变体基因的第一重组微生物。优选地，按照10000rpm离心10min后的菌体湿重计，所述第一重组微生物的添加量为1g/L-200g/L反应液；更优选地，10g/L-100g/L反应液；最优选地，为30g/L反应液。
在一些优选的实施方式中，步骤b)中使用的Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶和用于辅酶循环的酶由第二重组微生物共表达。因此，步骤b)可以包括：在共表达Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶和用于辅酶循环的酶(例如甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或醇脱氢酶)的第二重组微生物和无机铵盐的存在下，使步骤a)获得的2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸发生还原胺化反应得到L-草铵膦。利用所述第二重组微生物能够赋予本申请方法更高的催化效率。可以利用本领域已知的任何方法构建所述第二重组微生物。例如，所述第二重组微生物可以如下构建：构建含所述Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶和用于辅酶循环的酶的基因的重组表达载体，将所述重组表达载体转化至微生物，对获得的重组微生物进行诱导培养，分离培养液得到含有Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶和用于辅酶循环的酶的基因的第二重组微生物。优选地，按照10000rpm离心10min后的菌体湿重计，所述第二重组微生物的添加量为1g/L-200g/L反应液；更优选地，3g/L-100g/L反应液；最优选地，为30g/L反应液。
所述第一和第二重组微生物可以是任何适用于酶表达的工程菌。在一些实施方式中，所述第一和第二重组微生物各自独立地属于以下属中的一种：酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、腐质霉属(Humicola)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、耶氏酵母属(Yarrowia)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)或埃希氏杆菌属(Escherichia)。在一些优选的实施方式中，所述第一和第二重组微生物各自独立地选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolitica)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些更优选的实施方式中，所述第一和第二重组微生物均是大肠杆菌。
本申请方法的产率可以通过本领域已知的任何方法测量。例如，可以通过手性HPLC来测量所获得的草铵膦产物中两个构型含量。在一些实施方式中，获得的L-草铵膦产物的对映体过量(e.e.)至少为99.0％、99.5％或99.9％。在一些实施方式中，获得的L-草铵膦产物的收率至少为95％、96％或97％。
本发明大写英文字母代表如本领域技术人员熟知的氨基酸，根据本申请，在此代表的是相应的氨基酸残基。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
对序列表的描述：
SEQ ID NO.1是来源于Microbotryum intermedium的注释为D-氨基酸氧化酶(DAAO)的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2是来源于Lactobacillus buchneri的注释为甲酸脱氢酶(FDH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO.3是来源于Exiguobacterium sibiricum的注释为葡萄糖脱氢酶(GDH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO.4是来源于Lactobacillus brevis的注释为醇脱氢酶(ADH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO.5是来源于Delftia acidovorans注释为Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO.6是来源于Microbotryum intermedium的注释为D-氨基酸氧化酶(DAAO)的核苷酸序列。
SEQ ID NO.7是来源于Lactobacillus buchneri的注释为甲酸脱氢酶(FDH)的核苷酸序列。
SEQ ID NO.8是来源于Exiguobacterium sibiricum的注释为葡萄糖脱氢酶(GDH)的核苷酸序列。
SEQ ID NO.9是来源于Lactobacillus brevis的注释为醇脱氢酶(ADH)的核苷酸序列。
SEQ ID NO.10是来源于Delftia acidovorans注释为Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶的核苷酸序列。
本申请的D-氨基酸氧化酶突变体使反应体系具有更好的催化效率，以外消旋D,L-草铵膦为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型，PPO产率也大幅提升。
附图说明
图1示例性示出本申请方法采用的多酶体系拆分法生产L-草铵膦的反应式。
图2示例性示出去消旋合成L-草铵膦的反应式(葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统)。
图3示例性示出去消旋合成L-草铵膦的反应式(甲酸脱氢酶辅酶循环系统)。
图4示例性示出双菌多酶一锅两步法去消旋化制备L-草铵膦的反应进程。
具体实施方式
实施例
材料和方法
上游基因工程所用试剂：实施例中使用的基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；一步克隆试剂盒购自诺唯赞有限公司；E.coli BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)等购自上海旭冠生物科技发展有限公司；DNA标记、低分子量标准蛋白、蛋白预制胶购自北京GenStar有限公司；ClonExpress II One StepCloning Kit无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；pfu DNA聚合酶和Dpn I内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；引物合成，序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成，全基因合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
下游催化工艺所用试剂2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(PPO)来自于永农生物科学有限公司；D,L-草铵膦来自于永农生物科学有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例中通过高效液相色谱(HPLC)检测反应的进行，并对PPO进行分析。HPLC分析方法为：色谱柱PBR；柱温/30℃；流速/1mL/min；检测波长/210nm；流动相：5mM(NH4)2HPO4。
通过手性HPLC分析方法检测草铵膦的两个构型的含量，手性HPLC分析方法为：色谱柱/OA-5000L；流动相/0.5g/L五水硫酸铜铵溶液，另加入0.3％v/v乙腈；检测波长/254nm；流速/1mL/min；柱温/35℃。
实施例1：基因工程菌的构建
将来源于Microbotryum intermedium的D-氨基酸氧化酶(DAAO，GenBank号：FMSP01000004.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)的基因序列进行全基因合成后，插入表达质粒pET-28a(+)，得到pET-28a-daao。测序验证无误后将pET-28a-daao转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组酶的表达。
将来源于Lactobacillus buchneri的甲酸脱氢(FDH)的序列(氨基酸序列为SEQID NO.2所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示)进行全基因合成后，插入表达质粒pET-28a(+)得到pET-28a-fdh。测序验证无误后将pET-28a-fdh转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组酶的表达。
将来源于Exiguobacterium sibiricum的葡萄糖脱氢酶(GDH)的序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示)进行全基因合成后，插入表达质粒pET-28a(+)，得到pET-28a-gdh。测序验证无误后将pET-28a-gdh转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组酶的表达。
将来源于Lactobacillus brevis的醇脱氢酶(ADH)的序列(氨基酸序列为SEQ IDNO.4所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示)进行全基因合成后，插入表达质粒pET-28a(+)，得到pET-28a-adh。测序验证无误后将pET-28a-adh转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组酶的表达。
将来源于Delftia acidovorans的L-氨基酸脱氢酶(LAADH，GenBank号：WP_012202150.1，NCBI注释为Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示)的基因序列进行全基因合成，插入表达质粒pET-28a(+)上，得到质粒pET-28a-laadh。测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组酶的表达。
实施例2：工程菌菌体的培养
分别将工程菌重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-DAAO、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LAADH、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-FDH、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-GDH和E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ADH经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃震荡培养10h。按2％的接种量转接至50mL同样含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃下震荡培养12h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。
实施例3：D-氨基酸氧化酶(DAAO)突变体(62位、226位)的构建
在实施例1中所述野生型DAAO序列的基础上突变了第62位和/或226位(具体为F62K、M226T)。针对突变的D-氨基酸氧化酶序列的第62位、第226位进行突变的突变体设计PCR的引物序列，具体如表1所示：
表1
序号 引物名 引物序列
1 F62KF gattcttgcgggtccaccttggggcaccagttcgctc
2 F62KR gagcgaactggtgccccaaggtggacccgcaagaatc
3 M226TF ggggtctgacgcatcggtagtgcacagcttgac
4 M226TR gtcaagctgtgcactaccgatgcgtcagacccc
PCR(25μL)扩增体系如下：
Pfu缓冲液12.5μL，引物2μL，模板质粒1μL，dNTP 0.5μL，Pfu 1μL，加入ddH2O补足至25μL。
PCR扩增条件：
(1)95℃预变性3min，(2)95℃变性30秒，(3)65℃退火30秒，(4)72℃延伸5min，20个循环，(5)72℃延伸10min，(6)4℃保存。
PCR后取5μL对扩增产物进行核酸凝胶电泳分析，得到的目标条带清晰，将剩余产物加入0.5μL Dpn I内切酶，放于37℃下消化模板DNA 3h。
反应完成转化至BL21感受态细胞，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑单菌落，获得突变体转化子。按照实施例2所述获得菌体。
实施例4：D-氨基酸氧化酶突变体酶活的比较
通过测定PPO的生成量来比较D-氨基酸氧化酶与其突变体的催化效率。当只有D-氨基酸氧化酶及突变体时，反应体系为：300mM外消旋草铵膦铵盐，100mM pH8.0磷酸盐缓冲液，8000U/L过氧化氢酶，20g/L D-氨基酸氧化酶或其突变体冻干细胞。反应16h后，取反应液样品进行处理，使用HPLC测定PPO的浓度并计算转化率(产物PPO浓度/底物D-PPT浓度×100％)，具体如表2所示。
表2
Figure BDA0003047178950000141
Figure BDA0003047178950000151
由表2可以看出，所得突变体的转化率均高于野生型DAAO的转化率。其中，转化率最高的为DAAO突变体4，其突变位点第62位的F突变为K，第226位的M突变为T。
实施例5：Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶突变体(91位、168位)的构建
在实施例1中所述野生型LAADH序列的基础上突变了第91位和168位(具体为V91I、N168G)。针对突变的LAADH序列的第91位、第168位进行突变的突变体PCR设计引物序列，具体如表3所示：
表3
序号 引物名 引物序列
1 V91IF cctggtggaaacggatgccgcccttgccg
2 V91IR cggcaagggcggcatccgtttccaccagg
3 N168GF gggtccgaagaatcggtcgtgcagcgcttgc
4 N168GR gcaagcgctgcacgaccgattcttcggaccc
PCR扩增体系及条件同实施例3所述步骤。
反应完成转化至BL21感受态细胞，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑单菌落，获得突变体转化子。按照实施例2所述获得菌体。
实施例6：LAADH表达菌株的构建
一、含葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统的表达菌株的构建
在载体pET-28a-LAADH V91I-N168G上，通过无缝克隆试剂盒将葡萄糖脱氢酶基因片段连接到多克隆位点上，酶切位点为Hind III，构建得到质粒pET-28a-LAADH V91I-N168G-GDH，构建得到表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LAADH V91I-N168G-GDH。
二、含甲酸脱氢酶辅酶循环系统的表达菌株的构建
在载体pET-28a-LAADH V91I-N168G上，通过无缝克隆试剂盒将甲酸脱氢酶基因片段连接到多克隆位点上，酶切位点为Hind III，构建得到质粒pET-28a-LAADH V91I-N168G-FDH，构建得到表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LAADH V91I-N168G-FDH。
三、醇脱氢酶辅酶循环系统的表达菌株的构建
在载体pET-28a-LAADH V91I-N168G上，通过无缝克隆试剂盒将醇脱氢酶基因片段连接到多克隆位点上，酶切位点为Hind III，构建得到质粒pET-28a-LAADH V91I-N168G-ADH，构建得到表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LAADH V91I-N168G-ADH。
实施例7：双菌多酶去消旋制备L-草铵膦(含葡萄糖脱氢酶GDH辅酶循环体系)
按照实施例2的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-DAAO F62K-M226和能够表达L-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LAADH V91I-N168G-GDH，离心收集菌体细胞并冻干。
在1L反应器中，加入600mL的磷酸铵缓冲液(pH8.0，100mM)，含有400mM D,L-PPT，8000U/L过氧化氢酶，5％(v/v)消泡剂、20g/L E.coli BL21(DE3)/pET-28a-DAAO F62K-M226菌体，20g/L E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LAADH V91I-N168G-GDH菌体，0.5mM NADH和250mM葡萄糖，通入空气，通气量2L/min，再加入氨水控制pH为8，温度30℃，反应24小时。反应结束后，液相检测L-PPT为388mM，产品L-草铵膦的e.e.值大于99％，L-PPT转化收率为97％。
实施例8：双菌多酶去消旋制备L-草铵膦(含甲酸脱氢酶FDH辅酶循环体系)
按照实施例2的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-DAAO F62K-M226和能够表达L-氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LAADH V91I-N168G-FDH，离心收集菌体细胞并冻干。
在1L反应器中，加入600mL的磷酸铵缓冲液(pH8.0，100mM)，含有400mM D,L-PPT，8000U/L过氧化氢酶，5％(v/v)消泡剂，20g/L E.coli BL21(DE3)/pET-28a-DAAO F62K-M226冻干菌体，20g/L E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LAADH V91I-N168G-FDH冻干菌体，0.5mM NADH和250mM甲酸铵，通入空气，通气量2L/min，氨水控制pH为8，温度30℃，反应24小时。反应结束后，液相检测L-PPT为382mM，产品L-草铵膦的e.e.值大于99％，L-PPT转化收率为95.5％。
实施例9：双菌多酶去消旋制备L-草铵膦(醇脱氢酶ADH辅酶循环体系)
按照实施例2的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-DAAO F62K-M226和能够表达L-氨基酸脱氢酶和醇脱氢酶的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LAADH V91I-N168G-ADH，离心收集菌体细胞并冻干。
在1L反应器中，加入600mL反应液(氨水调节至pH8.0)，含有400mM D,L-PPT，8000U/L过氧化氢酶，0.5％(v/v)消泡剂，20g/L E.coli BL21(DE3)/pET-28a-DAAO F62K-M226冻干菌体，20g/L E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LAADH V91I-N168G-ADH冻干菌体，0.5mM NADH和250mM异丙醇，通入空气，通气量2L/min，氨水控制pH为8，温度30℃，反应24小时。以实施例所示液相检测方法检测反应过程中D-草铵膦的消耗和L-草铵膦等的生成，反应进程曲线如图4所示。该图显示，随着时间的推移D-草铵膦的浓度逐渐降低，L-草铵膦的浓度逐渐升高。反应结束后，液相检测L-PPT为380mM，产品L-草铵膦的e.e.值大于99％，L-PPT转化收率为95％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 永农生物科学有限公司
华东理工大学
宁夏永农生物科学有限公司
<120> D-氨基酸氧化酶突变体及其在制备L-草铵膦中的应用
<130> PD210049N
<160> 10
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 384
<212> PRT
<213> Microbotryum intermedium
<400> 1
Met Ser Ser Ser Thr Ser Ser Asp Lys Gln Val Val Val Ile Gly Ala
1 5 10 15
Gly Val Ile Gly Leu Thr Ser Ala Leu Val Leu Ala Gln Ser Asn His
20 25 30
Asn Val Thr Leu Val Ala Arg Asp Leu Pro Ser Asp Val Ser Ser Gln
35 40 45
Ala Phe Ala Ser Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Cys Pro Phe Val Asp
50 55 60
Pro Gln Glu Ser Val Lys Asn Lys Arg Ile Cys Asp Trp Glu Thr Gln
65 70 75 80
Ser Phe Ala Asn Phe Gln Gln Leu Ile Arg Glu His Gly Asp Gly Lys
85 90 95
Leu Val Met Arg Leu Pro Ala Arg Arg Tyr Ala Glu Asn Glu Lys Ala
100 105 110
Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Ser Val Val Pro Arg Tyr Ser Thr Leu
115 120 125
Pro Ser Ser Glu Val Pro Asn Asn Gly Val Gly Val Glu Phe Glu Thr
130 135 140
Ile Ser Val Asn Ala Pro Leu Tyr Cys Gln Trp Leu Glu Ala Gln Leu
145 150 155 160
Leu Ser His Asn Ala Thr Ile Ile Arg Arg Ser Leu Asn Ser Leu Asp
165 170 175
Glu Ala Leu Ser Leu Ala Pro Ser Cys Ser Val Ile Val Asn Ala Thr
180 185 190
Gly Leu Gly Ala Lys Ser Leu Gly Gly Val Glu Asp Gln Thr Val Thr
195 200 205
Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Ile Lys Thr Asp Val Lys Leu Cys
210 215 220
Thr Met Asp Ala Ser Asp Pro Thr Lys Pro Ser Tyr Ile Ile Pro Arg
225 230 235 240
Pro Gly Gly Glu Ala Val Cys Gly Gly Cys Tyr Gly Leu Gly Glu Trp
245 250 255
Asn Leu Ser Thr Asp Thr Glu Leu Ala Lys Leu Ile Leu Glu Arg Cys
260 265 270
Leu Val Leu Asp Pro Arg Ile Ser Ser Asn Gly Ala Leu Asp Gly Ile
275 280 285
Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ser Arg Gly Thr Asn
290 295 300
Glu Pro Arg Leu Glu Ala Glu Arg Val Val Leu Pro Ser Tyr Ser Leu
305 310 315 320
Asn Pro His Arg Arg His Ala Leu Gly Ala Glu Gly Asn Ala Ala Thr
325 330 335
Val Ile His Ala Tyr Gly Val Gly Pro Ala Gly Tyr Gln Val Ser Trp
340 345 350
Gly Val Ala Asn Glu Val Lys Ala Leu Val Asp Glu His Phe Ala Lys
355 360 365
Phe Asp Thr Arg Thr Thr Gln Asp Gly Val His Arg Asp Ile Lys Leu
370 375 380
<210> 2
<211> 398
<212> PRT
<213> Lactobacillus buchneri
<400> 2
Met Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Thr Pro Ala Pro Val Ala Gly Pro
1 5 10 15
Pro Pro Leu Thr Val Ala Ala Ala Ile Pro Leu Ile Thr His Thr Pro
20 25 30
Ala Gly Ser Thr Val Pro Thr Pro Gly Gly Ile Ala Pro Leu Pro Gly
35 40 45
Gly Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Gly Leu Gly Leu Leu Leu Thr Leu
50 55 60
Gly Ser Leu Gly Val Gly Pro Val Val Thr Ser Ala Leu Gly Gly Pro
65 70 75 80
Ala Ser Val Pro Gly Leu Gly Leu Pro Thr Ala Ala Val Val Ile Ser
85 90 95
Gly Pro Pro Thr Pro Ala Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ile Ala Leu Ala
100 105 110
Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ile Thr Ala Gly Ile Gly Ser Ala His Val
115 120 125
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Ala Ile Thr Val Ala Gly Val Thr
130 135 140
Thr Ser Ala Ser Val Ser Val Ala Gly Ala Gly Val Met Gly Leu Leu
145 150 155 160
Ala Leu Val Ala Ala Pro Ile Pro Ala His Ala Ile Val Leu Ala Gly
165 170 175
Gly Thr Ala Ile Ala Ala Ala Val Ser Ala Ala Thr Ala Leu Gly Gly
180 185 190
Met Thr Val Gly Val Ile Gly Ala Gly Ala Ile Gly Ala Ala Val Leu
195 200 205
Gly Ala Leu Leu Pro Pro Gly Val Leu Leu Val Thr Ala Gly Ala His
210 215 220
Gly Leu Pro Ala Gly Val Gly Ala Gly Leu Gly Leu Thr Thr Pro Pro
225 230 235 240
Ala Val His Gly Met Val Leu Val Val Ala Ala Val Val Leu Ala Ala
245 250 255
Pro Leu His Ala Gly Thr Thr His Leu Pro Ala Ala Gly Val Leu Ala
260 265 270
Thr Met Leu Ala Gly Ala Thr Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly Gly Gly
275 280 285
Val Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Ala Leu Ala Ser Gly Gly Ile Gly
290 295 300
Gly Thr Ser Gly Ala Val Thr Thr Pro Gly Pro Ala Pro Leu Ala His
305 310 315 320
Pro Thr Ala Thr Met Pro Ala Gly Ala Met Thr Pro His Met Ser Gly
325 330 335
Thr Thr Leu Ser Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ile
340 345 350
Leu Gly Ala Pro Leu Gly Ala Leu Pro Ile Ala Pro Gly Thr Leu Ile
355 360 365
Ala Gly Gly Gly Ser Leu Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ser Thr Thr Val
370 375 380
Leu Leu Gly Gly Gly Thr Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Leu
385 390 395
<210> 3
<211> 262
<212> PRT
<213> Exiguobacterium sibiricum
<400> 3
Met Gly Thr Ala Ser Leu Leu Gly Leu Val Ala Ile Val Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ile Ala Ala Thr Ala Gly Gly Gly
20 25 30
Met Ala Val Val Ile Ala Thr Ala Ser His Pro Gly Gly Ala Leu Leu
35 40 45
Ile Ala Gly Ala Ile Leu Gly Ala Gly Gly Gly Ala Leu Thr Val Gly
50 55 60
Gly Ala Val Ser Leu Gly Gly Ala Met Ile Ala Leu Val Leu Gly Thr
65 70 75 80
Val Ala His Pro Gly Gly Leu Ala Val Pro Val Ala Ala Ala Gly Val
85 90 95
Gly Met Pro Ser Pro Ser His Gly Met Ser Leu Gly Ala Thr Gly Leu
100 105 110
Val Ile Ala Val Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Gly Ala
115 120 125
Leu Leu Thr Pro Val Gly His Ala Val Leu Gly Ala Ile Ile Ala Met
130 135 140
Ser Ser Val His Gly Ile Ile Pro Thr Pro Thr Pro Val His Thr Ala
145 150 155 160
Ala Ser Leu Gly Gly Val Leu Leu Met Thr Gly Thr Leu Ala Met Gly
165 170 175
Thr Ala Pro Leu Gly Ile Ala Ile Ala Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile
180 185 190
Ala Thr Pro Ile Ala Ala Gly Leu Pro Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala
195 200 205
Ala Val Gly Ser Met Ile Pro Met Gly Ala Ile Gly Leu Pro Gly Gly
210 215 220
Ile Ser Ala Val Ala Ala Thr Leu Ala Ser Ala Gly Ala Ser Thr Val
225 230 235 240
Thr Gly Ile Thr Leu Pro Ala Ala Gly Gly Met Thr Leu Thr Pro Ser
245 250 255
Pro Gly Ala Gly Ala Gly
260
<210> 4
<211> 252
<212> PRT
<213> Lactobacillus brevis
<400> 4
Met Ser Ala Ala Leu Ala Gly Leu Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Leu Pro Val Gly Gly Gly Ala
20 25 30
Leu Val Met Ile Thr Gly Ala His Ser Ala Val Gly Gly Leu Ala Ala
35 40 45
Leu Ser Val Gly Thr Pro Ala Gly Ile Gly Pro Pro Gly His Ala Ser
50 55 60
Ser Ala Gly Ala Gly Thr Thr Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gly Leu Ala
65 70 75 80
Pro Gly Pro Val Ser Thr Leu Val Ala Ala Ala Gly Ile Ala Val Ala
85 90 95
Leu Ser Val Gly Gly Thr Thr Thr Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala
100 105 110
Val Ala Leu Ala Gly Val Pro Pro Gly Thr Ala Leu Gly Ile Gly Ala
115 120 125
Met Leu Ala Leu Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Ala Met Ser Ser Ile
130 135 140
Gly Gly Pro Val Gly Ala Pro Ser Leu Gly Ala Thr Ala Ala Ser Leu
145 150 155 160
Gly Ala Val Ala Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Leu Ala Cys Ala Leu
165 170 175
Leu Ala Thr Ala Val Ala Val Ala Thr Val His Pro Gly Thr Ile Leu
180 185 190
Thr Pro Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Ala Gly Gly Ala Met Ser Gly
195 200 205
Ala Thr Leu Thr Pro Met Gly His Ile Gly Gly Pro Ala Ala Ile Ala
210 215 220
Thr Ile Cys Val Thr Leu Ala Ser Ala Gly Ser Leu Pro Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ser Gly Pro Val Val Ala Gly Gly Thr Thr Ala Gly
245 250
<210> 5
<211> 434
<212> PRT
<213> Delftia acidovorans
<400> 5
Met Gln Gln Pro Ala Ser Ala Gly Val Thr Asn His Ala Ile Pro Ser
1 5 10 15
Tyr Leu Gln Ala Asp His Leu Gly Pro Trp Gly Asn Tyr Leu Gln Gln
20 25 30
Val Asp Arg Val Thr Pro Tyr Leu Gly His Leu Ala Arg Trp Val Glu
35 40 45
Thr Leu Lys Arg Pro Lys Arg Ile Leu Ile Val Asp Val Pro Ile Glu
50 55 60
Leu Asp Asn Gly Thr Ile Ala His Tyr Glu Gly Tyr Arg Val Gln His
65 70 75 80
Asn Leu Ser Arg Gly Pro Gly Lys Gly Gly Val Arg Phe His Gln Asp
85 90 95
Val Thr Leu Ser Glu Val Met Ala Leu Ser Ala Trp Met Ser Val Lys
100 105 110
Asn Ala Ala Val Asn Val Pro Tyr Gly Gly Ala Lys Gly Gly Ile Arg
115 120 125
Val Asp Pro Lys Thr Leu Ser Arg Gly Glu Leu Glu Arg Leu Thr Arg
130 135 140
Arg Tyr Thr Ser Glu Ile Gly Leu Leu Ile Gly Pro Ser Lys Asp Ile
145 150 155 160
Pro Ala Pro Asp Val Asn Thr Asn Gly Gln Ile Met Ala Trp Met Met
165 170 175
Asp Thr Tyr Ser Met Asn Thr Gly Ala Thr Ala Thr Gly Val Val Thr
180 185 190
Gly Lys Pro Val Asp Leu Gly Gly Ser Leu Gly Arg Val Glu Ala Thr
195 200 205
Gly Arg Gly Val Phe Thr Val Gly Val Glu Ala Ala Lys Leu Thr Gly
210 215 220
Leu Ser Val Gln Gly Ala Arg Ile Ala Val Gln Gly Phe Gly Asn Val
225 230 235 240
Gly Gly Thr Ala Gly Lys Leu Phe Ala Asp Val Gly Ala Lys Val Val
245 250 255
Ala Val Gln Asp His Thr Gly Thr Ile His Asn Ala Asn Gly Leu Asp
260 265 270
Val Pro Ala Leu Leu Ala His Val Ala Ala Lys Gly Gly Val Gly Gly
275 280 285
Phe Asp Gly Ala Glu Ala Met Asp Ala Ala Asp Phe Trp Ser Val Asp
290 295 300
Cys Asp Ile Leu Ile Pro Ala Ala Leu Glu Gly Gln Ile Thr Lys Glu
305 310 315 320
Asn Ala Gly Lys Ile Lys Ala Lys Met Val Ile Glu Gly Ala Asn Gly
325 330 335
Pro Thr Thr Thr Glu Ala Asp Asp Ile Leu Thr Glu Lys Gly Val Leu
340 345 350
Val Leu Pro Asp Val Leu Ala Asn Ala Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr
355 360 365
Phe Glu Trp Val Gln Asp Phe Ser Ser Phe Phe Trp Ser Glu Asp Glu
370 375 380
Ile Asn Ala Arg Leu Val Arg Ile Met Gln Asp Ala Phe Ala Ala Ile
385 390 395 400
Trp Gln Val Ala Gln Gln His Gly Val Thr Leu Arg Thr Ala Thr Phe
405 410 415
Ile Val Ala Cys Gln Arg Ile Leu His Ala Arg Glu Met Arg Gly Leu
420 425 430
Tyr Pro
<210> 6
<211> 1155
<212> DNA
<213> Microbotryum intermedium
<400> 6
atgtcgtcaa gcacttcatc cgacaagcaa gtcgtcgtca ttggtgctgg tgttattggc 60
ctcacgtcgg cgctcgttct cgcgcagtcg aaccacaacg tcaccctcgt cgctcgggat 120
ctcccctcgg atgtatcgtc ccaagcgttt gcctcacctt gggccggagc gaactggtgc 180
ccctttgtgg acccgcaaga atcggtcaag aacaagagga tctgcgactg ggagacgcag 240
tcgttcgcaa acttccagca actcataaga gaacacggcg atggcaaact cgtcatgagg 300
cttccggcga ggagatacgc cgagaacgaa aaagccctcc tggggcattg gtacaaatca 360
gtcgtgccta gatactcgac cttgccctcg tccgaggtcc ccaacaacgg cgtcggcgtc 420
gaattcgaga ccatctcggt taacgcgccg ctctactgcc aatggctcga ggctcaactc 480
ttgtctcaca acgccaccat catccgccgc tcgctcaact ccctcgacga ggccttgtcg 540
ctcgcacctt cttgctcggt catcgtcaac gccaccgggc tcggcgccaa atcactcgga 600
ggagtcgagg atcagacggt cacccccatc cgagggcaga ccgtcttgat caagaccgac 660
gtcaagctgt gcactatgga tgcgtcagac cccaccaaac cgtcctatat cattccgagg 720
ccagggggcg aggccgtttg tggtggttgc tacggcctcg gggaatggaa tctctccacc 780
gatacggaac tggccaagct gattctcgaa cgatgcctgg tgctcgaccc ccgcatctca 840
tccaatggtg cgcttgacgg catcgaagtg cttcgacaca atgtcgggct gcggccatca 900
cgaggcacga atgaacccag gctagaggcc gaacgagtcg tccttccttc ctattctttg 960
aaccctcatc gaaggcatgc gctcggtgca gagggcaacg ccgcgacggt cattcacgcc 1020
tacggggtcg ggccggcagg atatcaagtc agctgggggg tcgcgaacga ggtgaaagcg 1080
ctagtcgacg aacacttcgc caagtttgac actcgaacga cccaagacgg cgtccaccgg 1140
gacattaaac tctag 1155
<210> 7
<211> 1197
<212> DNA
<213> Lactobacillus buchneri
<400> 7
atgaccaaag ttctggccgt gctgtatccg gatccggtgg atggttttcc gccgaaatat 60
gttcgtgatg atattccgaa aatcacccat tatccggatg gcagtaccgt tccgaccccg 120
gaaggcattg attttaaacc gggtgaactg ctgggtagcg ttagtggcgg tctgggcctg 180
aaaaaatatc tggaaagtaa aggtgtggaa tttgttgtta ccagtgataa agaaggcccg 240
gatagtgtgt ttgaaaaaga actgccgacc gccgatgtgg ttattagtca gccgttttgg 300
ccggcctatc tgaccgcaga tctgattgat aaagcaaaaa agctgaaact ggcaattacc 360
gccggtattg gcagcgatca tgtggatctg aatgccgcca atgaacataa tattaccgtt 420
gcagaagtga cctatagcaa tagtgttagt gttgcagaag cagaagtgat gcagctgctg 480
gccctggtgc gtaattttat tccggcacat gatattgtga aagccggtgg ctggaatatt 540
gcagatgcag ttagccgtgc ctatgatctg gaaggtatga ccgttggtgt gattggtgca 600
ggccgcattg gtcgtgccgt tctggaacgt ctgaaaccgt ttggcgttaa actggtgtat 660
aatcagcgcc atcagctgcc ggatgaagtt gaaaatgaac tgggcctgac ctattttccg 720
gatgttcatg aaatggtgaa agttgtggat gccgttgttc tggcagcacc gctgcatgca 780
cagacctatc atctgtttaa tgatgaagtt ctggccacca tgaaacgtgg cgcctatatt 840
gtgaataata gccgcggcga agaagttgat cgcgatgcaa ttgttcgcgc actgaatagc 900
ggtcagattg gcggttatag tggcgatgtt tggtatccgc agccggcacc gaaagatcat 960
ccgtggcgta ccatgccgaa tgaagcaatg accccgcata tgagtggcac caccctgagt 1020
gcccaggcac gctatgccgc aggtgcacgt gaaattctgg aagattttct ggaagataaa 1080
ccgattcgtc cggaatatct gattgcccag ggtggtagtc tggccggtac cggtgccaaa 1140
agttataccg tgaaaaaagg cgaagaaacc ccgggtagcg gcgaagcaga aaaataa 1197
<210> 8
<211> 789
<212> DNA
<213> Exiguobacterium sibiricum
<400> 8
atgggttata attctctgaa aggcaaagtc gcgattgtta ctggtggtag catgggcatt 60
ggcgaagcga tcatccgtcg ctatgcagaa gaaggcatgc gcgttgttat caactatcgt 120
agccatccgg aggaagccaa aaagatcgcc gaagatatta aacaggcagg tggtgaagcc 180
ctgaccgtcc agggtgacgt ttctaaagag gaagacatga tcaacctggt gaaacagact 240
gttgatcact tcggtcagct ggacgtcttt gtgaacaacg ctggcgttga gatgccttct 300
ccgtcccacg aaatgtccct ggaagactgg cagaaagtga tcgatgttaa tctgacgggt 360
gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420
attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480
gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540
ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600
ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660
aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720
accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780
cgtggttga 789
<210> 9
<211> 759
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis
<400> 9
atgagcaacc gtctggacgg caaggtggcg atcattaccg gtggcaccct gggtattggt 60
ctggcgattg cgaccaagtt cgtggaggaa ggtgcgaaag ttatgatcac cggccgtcac 120
agcgacgtgg gcgagaaggc ggcgaaaagc gttggcaccc cggaccagat tcaattcttt 180
cagcacgata gcagcgacga ggatggttgg accaagctgt tcgatgcgac cgaaaaagcg 240
tttggcccgg ttagcaccct ggttaacaac gcgggtattg cggtgaacaa gagcgttgag 300
gaaaccacca ccgcggagtg gcgtaaactg ctggcggtga acctggatgg tgttttcttt 360
ggcacccgtc tgggtatcca acgtatgaag aacaaaggtc tgggcgcgag catcattaac 420
atgagcagca ttgaaggttt cgttggtgac ccgagcctgg gtgcgtacaa cgcgagcaag 480
ggtgcggttc gtatcatgag caaaagcgcg gcgctggatt gcgcgctgaa ggactacgat 540
gtgcgtgtta acaccgtgca cccgggctat attaaaaccc cgctggttga cgatctgccg 600
ggtgcggagg aagcgatgag ccagcgtacc aagaccccga tgggtcacat cggcgaaccg 660
aacgacatcg cgtacatttg cgtttatctg gcgagcaacg agagcaaatt cgcgaccggt 720
agcgaatttg tggttgatgg tggctatacc gcgcaataa 759
<210> 10
<211> 1305
<212> DNA
<213> Delftia acidovorans
<400> 10
atgcagcaac ccgcttcggc cggcgttacc aaccacgcca tcccttccta cctgcaggcc 60
gatcacctcg gcccctgggg caactacctg cagcaggtcg atcgcgtcac gccctacctg 120
ggccatctcg cccgctgggt cgaaaccctc aagcgcccca agcgcatcct gatcgtcgat 180
gtgccgatcg agctggacaa cggcaccatc gcccactacg aaggctaccg cgtgcagcac 240
aacctgagcc gcggtcccgg caagggcggc gtgcgtttcc accaggacgt gaccctgtcc 300
gaagtcatgg ccctgtcggc ctggatgtcg gtcaagaacg cggccgtcaa cgtgccctat 360
ggtggcgcca agggcggcat ccgtgtcgat cccaagacgc tgtcgcgcgg tgagctggag 420
cgcctgacgc gccgctacac cagcgagatc ggcctgctga tcggcccctc caaggacatc 480
cccgcgcctg acgtcaacac caatggccag atcatggcct ggatgatgga cacgtactcc 540
atgaacaccg gcgccaccgc caccggcgtg gtcacgggca agcccgtgga cctgggcggc 600
tcgctgggcc gcgtcgaggc caccggccgc ggcgtgttca ccgtgggcgt ggaagcggcc 660
aagctgaccg gcctgtcggt ccagggcgcg cgcatcgccg tgcagggctt cggcaacgtg 720
ggcggcacgg cgggcaagct gttcgccgac gtgggcgcca aggtcgtggc cgtgcaggac 780
cacaccggca ccatccacaa cgccaatggc ctggacgtgc cggccctgct ggcccacgtg 840
gctgccaagg gcggcgtggg cggctttgac ggcgccgagg ccatggacgc tgccgacttc 900
tggagcgtgg actgcgacat cctgatcccc gccgcactgg aaggccagat caccaaggaa 960
aacgccggca agatcaaggc caagatggtg atcgagggcg ccaacggccc caccaccacc 1020
gaggccgacg acatcctgac cgaaaagggc gtgctggtgc tgcccgatgt gctggccaat 1080
gccggcggcg tgacggtgag ctacttcgaa tgggtgcagg acttctccag cttcttctgg 1140
agcgaggacg agatcaacgc ccgcctggtg cgcatcatgc aggacgcctt cgcggccatc 1200
tggcaggtcg cccagcagca cggcgtgacg ctgcgcaccg ccaccttcat cgtggcctgc 1260
cagcgcatcc tgcatgcgcg cgagatgcgg ggactgtatc cctga 1305

Claims (18)

1.一种D-氨基酸氧化酶突变体，其中，当与包含SEQ ID NO.1所示序列的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列比对时，所述D-氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列包含对应于第62位和/或第226位的氨基酸残基的替换，所述第62位和第226位是参照SEQ ID NO.1限定的，并且所述D-氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少90％的同一性。
2.根据权利要求1所述的D-氨基酸氧化酶突变体，其中第226位的氨基酸残基的替换为M226T；优选的，第226位的氨基酸残基的替换为M226T，第62位的氨基酸残基的替换为F62K。
3.根据权利要求1或2所述的D-氨基酸氧化酶突变体，其来源于Microbotryumintermedium。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的D-氨基酸氧化酶突变体，其氨基酸序列与SEQ IDNO.1所示序列具有至少99％的同一性。
5.核酸，其包含编码权利要求1至4中任一项所述的D-氨基酸氧化酶突变体的序列。
6.表达载体，其包含权利要求5所述的核酸。
7.重组宿主细胞，其包含权利要求5所述的核酸或者权利要求6所述的表达载体。
8.根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolitica)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、放线菌(Actinomycetes)、链霉菌(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichiacoli)中的一种。
9.权利要求1至4中任一项所述的D-氨基酸氧化酶突变体、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的表达载体、或者权利要求7-8任一项所述的重组宿主细胞在制备L-草铵膦中的用途。
10.一种制备L-草铵膦的方法，其包括在酶催化体系的存在下使D-草铵膦发生转化反应生成L-草铵膦，其中所述酶催化体系包括用于将D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的权利要求1至4中任一项所述的D-氨基酸氧化酶突变体；特别地，所述D-草胺膦最初存在于D-和L-草胺膦或其盐的外消旋混合物中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述酶催化体系还包含用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸转化为L-草铵膦的L-氨基酸脱氢酶。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述酶催化体系还包括过氧化氢酶。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统选自以下中的至少一种：
(1)甲酸脱氢酶辅酶循环系统：包括甲酸脱氢酶，甲酸盐和辅酶；
(2)葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统：包括葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和辅酶；
(3)醇脱氢酶辅酶循环系统：包括醇脱氢酶，异丙醇和辅酶。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述酶催化体系中的每种酶的形式各自独立地选自：游离酶和表达酶的重组宿主细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达酶的重组宿主细胞各自独立地选自：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolitica)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、放线菌(Actinomycetes)、链霉菌(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，以湿菌体重量计，所述重组宿主细胞的总添加量为1-200g/L反应液。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的方法，其中所述转化反应在pH为7-10的反应液中进行，优选地，所述反应液是pH为8-9的反应液。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，所述D-氨基酸氧化酶突变体催化的氧化反应的反应温度为25-45℃，时间为6-24h。
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