CN117701519A - 支链氨基酸生物合成所用酶的突变体及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及支链氨基酸生物合成所用酶的突变体及其构建方法与应用。本发明提供的突变体，包括ilvN基因编码的野生型乙酰羟酸合酶的第25位氨基酸由缬氨酸V突变为异亮氨酸I；和/或，ilvC基因编码的野生型乙酰羟酸异构还原酶的第90位氨基酸由异亮氨酸I突变为丝氨酸S。乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I和/或乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S，及其突变菌株对主产物缬氨酸产量有显著的正效果，对副产物异亮氨酸产量有显著的负效果，对产缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等三支链氨基酸，及以其为前体的衍生物的生产菌株构建提供借鉴。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及支链氨基酸生物合成所用酶的突变体及其构建方法与应用。
背景技术
支链氨基酸(branch chain amino acid，BCAA)包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。其中，L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。L-缬氨酸呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中25℃的溶解度为88.5g/L，50℃的溶解度为96.2g/L，不溶于冷乙醇、乙醚、丙酮，等电点为5.96，熔点为315℃。
L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。L-缬氨酸可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。其中，在医药工业中，L-缬氨酸可作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。在食品工业中，L-缬氨酸可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。L-缬氨酸也可用作氨基酸功能饮料与运动员饮料，具有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。在饲料工业中，L-缬氨酸对动物的乳腺组织分泌乳汁具有重要的促进作用。
目前，L-缬氨酸的生产方法主要包括三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受到限制、生产成本高、污染环境等问题，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。但目前L-缬氨酸菌种的发酵性能仍较差，且副产物亮氨酸的含量较高，导致转化率仍较低，较难满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种利用微生物生产支链氨基酸L-缬氨酸的方法，以及能够高效率生产支链氨基酸L-缬氨酸的新微生物。具体地，本发明的目的是提供一种高产L-缬氨酸且副产物亮氨酸及异亮氨酸产量低的L-缬氨酸菌种。
第一方面，本发明提供一种支链氨基酸生物合成所用酶的突变体，所述突变体包括：ilvN基因编码的野生型乙酰羟酸合酶的第25位氨基酸由缬氨酸V突变为异亮氨酸I，形成乙酰羟酸合酶突变体；
和/或，ilvC基因编码的野生型乙酰羟酸异构还原酶的第90位氨基酸由异亮氨酸I突变为丝氨酸S，形成乙酰羟酸异构还原酶突变体。
ilvN基因(在NCBI上的参考序列编号为CEY17_RS06890)编码的乙酰羟酸合酶(在NCBI上的参考序列编号为WP_003861429.1)是支链氨基酸生物合成的第一个酶，也是支链氨基酸生物合成的关键酶，催化两分子丙酮酸生成乙酰乳酸(乙酰乳酸是缬氨酸和亮氨酸的前体物)，同时也催化a-酮基丁酸和丙酮酸生成a-乙酰羟基丁酸(a-乙酰羟基丁酸是异亮氨酸的前体物)。
ilvC基因(在NCBI上的参考序列编号为CEY17_RS06895)编码的乙酰羟酸异构还原酶(在NCBI上的参考序列编号为WP_003854117.1)是支链氨基酸生物合成过程中的一种重要酶，它催化1分子的α-乙酰乳酸或α-乙酰羟丁酸生成1分子的α-二羟基异戊酸或α,β-二羟甲基戊酸(α-二羟基异戊酸是缬氨酸和亮氨酸的前体物，α,β-二羟甲基戊酸是异亮氨酸的前体物)，同时消化1分子的还原力(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH)产生1分子的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)。
在本发明所提供的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体中，野生型乙酰羟酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述乙酰羟酸合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明所提供的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体中，所述乙酰羟酸合酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明所提供的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体中，所述野生型乙酰羟酸异构还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述乙酰羟酸异构还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明所提供的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体中，所述乙酰羟酸异构还原酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第二方面，本发明提供一种生物材料，含有上述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体。
更进一步地，对本发明所述生物材料中的ppc和/或gndA基因进行修饰，强化ppc和/或gndA基因的表达。
ppc、gndA基因在NCBI上的参考序列编号分别为CEY17_RS08480、CEY17_RS07800。
具体地，本发明所提供的生物材料为微生物，所述微生物的原始菌株包括：谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；
优选地，所述原始菌株由保藏编号为CGMCC No.13406的菌株的a-异丙基苹果酸合酶基因leuA编码区第1个碱基由A突变为G后得到的。
本发明的出发菌株MHZ-1012-3为谷氨酸棒杆菌，其构建方法见专利文件CN201911370732.9，该菌为出发菌株MHZ-1012-2的a-异丙基苹果酸合酶基因leuA其编码区第1个碱基由A突变为G得到。MHZ-1012-2于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13406，见专利文件CN201611250330.1。
本发明通过对谷氨酸棒杆菌来源的ilvN基因和/或ilvC基因修饰，实现了对乙酰羟酸合酶和/或乙酰羟酸异构还原酶的突变，使得所述微生物产缬氨酸的能力与未修饰的菌株相比增强，产副产物异亮氨酸的能力下降，最终提高了缬氨酸的产量。
根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护上述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体或上述的生物材料在生物合成支链氨基酸或其衍生物中的应用。
上述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体或上述的生物材料在增加L-缬氨酸产量同时降低L-缬氨酸生物合成过程中亮氨酸或异亮氨基酸产量中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的乙酰羟酸合酶突变菌株MHZ-1012-31的缬氨酸积累量达到9.9g/L，较出发菌株MHZ-1012-3增长2.4g/L，提升幅度达到32％，且副产物异亮氨酸积累量为1.5g/L，较出发菌株MHZ-1012-3下降34.8％，亮氨酸和菌体OD无显著变化。
本发明提供的乙酰羟酸异构还原酶突变菌株MHZ-1012-35的缬氨酸积累量达到10.5g/L，较出发菌株MHZ-1012-3增长3.0g/L，提升幅度达到40％，且副产物异亮氨酸没有进一步增加，异亮氨酸的积累量为1.5g/L，较出发菌株MHZ-1012-3下降34.8％，亮氨酸增加0.2g/L，增幅22.2％，菌体OD无显著变化。
由此可见，本发明提供的乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S，及其突变菌株对主产物缬氨酸产量有显著的正效果，对副产物异亮氨酸产量有显著的负效果，对产缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸，及以其为前体的衍生物的生产菌株构建提供借鉴。
同时，在乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S的基础上，叠加ppc增强、或ppc和gndA同时增强，缬氨酸的积累量显著增加，分别达到12.1g/L和13.8g/L，提高幅度分别达到13.2％和31.4％。由此可见，乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S，与ppc增强、或ppc和gndA同时增强叠加，有显著正效果，对产缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等三支链氨基酸，及以其为前体的衍生物的生产菌株构建提供借鉴。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
表1引物
实施例1乙酰羟酸合酶突变菌株的构建
本实施例的出发菌株MHZ-1012-3为谷氨酸棒杆菌，其构建方法见专利文件CN201911370732.9，该菌为出发菌株MHZ-1012-2的a-异丙基苹果酸合酶基因leuA其编码区第1个碱基由A突变为G得到。MHZ-1012-2于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13406，见专利文件CN201611250330.1。
以MHZ-1012-3为出发菌株，将MHZ-1012-3中ilvN基因突变为编码SEQ ID NO.2的乙酰羟酸合酶突变体的基因，构建乙酰羟酸合酶突变菌株，具体构建方法如下。
1、质粒pK18mobsacB-ilvNV25I的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以出发菌株MHZ-1012-3的基因组为模板，以ilvNV25I-UP-1F/ilvNV25I-UP-1R为引物，制备重组片段UP-1，以ilvNV25I-DN-2F/ilvNV25I-DN-2R为引物，制备重组片段DN-1；以谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032的基因组为模板，以ilvNV25I-1F/ilvNV25I-1R为引物，制备重组片段ilvNV25I；以质粒pk18-mob-sacB为模板，以ilvNV25I-pk18-3F/ilvNV25I-pk18-3R为引物获得片段pk18-1，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系如表2所示。
表2吉普森组装反应体系
| 组分 | UP-1 | DN-1 | ilvNV25I | pk18-1 | CE Buffer | CE Exnase | 无菌水 |
| 体积/μL | 1 | 1 | 1 | 2 | 4 | 2 | 9 |
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ilvNV25I。
2、乙酰羟酸合酶突变菌株的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-ilvNV25I转入出发菌株MHZ-1012-3中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-31。
本实施例以野生型乙酰羟酸合酶菌株为出发菌株，将MHZ-1012-3中ilvN基因突变为编码SEQ ID NO.2的乙酰羟酸合酶突变体的基因，构建乙酰羟酸合酶突变菌株，具体构建方法如下。
实施例2乙酰羟酸异构还原酶突变菌株的构建
以MHZ-1012-3为出发菌株，将MHZ-1012-3中ilvC基因突变为编码SEQ ID NO.6的乙酰羟酸异构还原酶突变体的基因，构建乙酰羟酸异构还原酶突变菌株，具体构建方法如下。
1、质粒pK18mobsacB-ilvCI90S的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以出发菌株MHZ-1012-3的基因组为模板，以ilvCI90S-UP-1F/ilvCI90S-UP-1R为引物，制备重组片段UP-1，以ilvCI90S-DN-2F/ilvCI90S-DN-2R为引物，制备重组片段DN-1；以质粒pk18-mob-sacB为模板，以ilvCI90S-pk18-3F/ilvCI90S-pk18-3R为引物获得片段pk18-1，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系如表3所示。
表3吉普森组装反应体系
| 组分 | UP-1 | DN-1 | pk18-1 | CE Buffer | CE Exnase | 无菌水 |
| 体积/μL | 1 | 1 | 2 | 4 | 2 | 10 |
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ilvCI90S。
2、乙酰羟酸异构还原酶突变菌株的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-ilvCI90S转入出发菌株MHZ-1012-3中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-33。
实施例3乙酰羟酸异构还原酶突变叠加菌株的构建
以MHZ-1012-31为出发菌株，将MHZ-1012-31中ilvC基因突变为编码SEQ ID NO.6的乙酰羟酸异构还原酶突变体的基因，构建乙酰羟酸异构还原酶突变菌株，具体构建方法如下。
将上述实施例2所述方法构建的重组质粒pK18mobsacB-ilvCI90S转入出发菌株MHZ-1012-31中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-35。
实施例4ppc基因突变菌株的构建
1、质粒pK18mobsacB-ppc的构建
以出发菌株MHZ-1012-35的基因组为模板，以PI-ppc-1f/PI-ppc-1r为引物制备上同源臂重组片段UP4，以PI-ppc-2f/PI-ppc-2为引物制备ppc基因及终止子重组片段PPC，以PI-ppc-4f/I-ppc-4r为引物制备下同源臂重组片段DN4；以质粒pXMJ19为模板，以PI-ppc-3f/PI-ppc-3r为引物制备tac启动子的重组片段Ptac；以质粒pK18-mob-sacB为模板，以PI-pK18-F/PI-pK18-R为引物制备重组片段pk18-4，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系如表4所示。
表4吉普森组装反应体系
| 组分 | UP4 | PPC | DN4 | Ptac | pk18-4 | CE Buffer | CE Exnase | 无菌水 |
| 体积/μL | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 4 | 2 | 8 |
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ppc。
2、ppc基因增强突变菌的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-ppc，转入菌株MHZ-1012-35中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为MHZ-1012-37。
实施例5gndA基因增强突变菌株的构建
在上述实施例4所述方法构建的菌株MHZ-1012-37中，将gndA基因的原有启动子替换为强启动子Ptac，以强化gndA基因的表达，具体方法如下。
1、质粒pK18mobsacB-gndA的构建
以出发菌株MHZ-1012-37的基因组为模板，以PI-gndA-1f/PI-gndA-1r为引物制备上同源臂重组片段UP5，以PI-gndA-3f/PI-gndA-3r为引物制备下同源臂重组片段DN5；以质粒pXMJ19为模板，以PI-gndA-2f/PI-gndA-2r为引物制备tac启动子的重组片段Ptac；利用重叠PCR将3个重组片段进行融合，并利用酶切位点BamHI/EcoRI将融合片段与pK18-mob-sacB载体连接，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-gndA。
2、gndA基因增强突变菌的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-gndA，转入菌株MHZ-1012-37中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为MHZ-1012-38。
实施例6谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵产缬氨酸
1、培养基
种子培养基：豆粕抽提物15g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵7g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，尿素2g/L，余量为水，pH7.2。
发酵培养基：豆粕抽提物15g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵7g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，尿素2g/L，VB3 15μg/L，VB1·HCl 100μg/L，余量为水，pH7.2。
2、摇瓶发酵
(1)种子培养：挑取斜面种子1环，接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养10-12h。
(2)发酵培养：将5mL种子液接种至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养72h。
(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测酵液中的L-缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，分光光度法检测562nm下的OD值，不同实施例的结果如表5所示。
表5中，菌株A为将棒状杆菌ATCC14067中ilvN基因突变为编码SEQ ID NO.2的菌株；菌株B为将棒状杆菌ATCC14067中ilvC基因突变为编码SEQ ID NO.6的菌株；菌株C为将棒状杆菌ATCC14067中ilvN基因突变为编码SEQ ID NO.2并将ilvC基因突变为编码SEQ IDNO.6。
表5发酵结果
说明：*表示与对照比有显著差异(P＜0.01)。
表5结果显示，出发菌株MHZ-1012-3的缬氨酸积累量为7.5g/L，而本发明提供的乙酰羟酸合酶突变菌株MHZ-1012-31的缬氨酸积累量达到9.9g/L，增长2.4g/L，提升幅度达到32％，且副产物异亮氨酸积累量为1.5g/L，较出发菌株MHZ-1012-3下降34.8％，亮氨酸和菌体OD无显著变化。
进一步，叠加突变体ilvCI90S得到的乙酰羟酸异构还原酶突变菌株MHZ-1012-35的缬氨酸积累量达到10.5g/L，较出发菌株MHZ-1012-3增长3.0g/L，提升幅度达到40％，且副产物异亮氨酸没有进一步增加，异亮氨酸的积累量为1.5g/L，较出发菌株MHZ-1012-3下降34.8％，亮氨酸增加0.2g/L，增幅22.2％，菌体OD无显著变化。
由此可见，本发明提供的乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S，及其突变菌株对主产物缬氨酸产量有显著的正效果，对副产物异亮氨酸产量有显著的负效果，对产缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等三支链氨基酸，及以其为前体的衍生物的生产菌株构建提供借鉴。
同时，在乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S的基础上，叠加ppc增强、或ppc和gndA同时增强，缬氨酸的积累量显著增加，分别达到12.1g/L和13.8g/L，提高幅度分别达到13.2％和31.4％。由此可见，乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S，与ppc增强、或ppc和gndA同时增强叠加，有显著正效果，对产缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等三支链氨基酸，及以其为前体的衍生物的生产菌株构建提供借鉴。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.支链氨基酸生物合成所用酶的突变体，其特征在于，ilvN基因编码的野生型乙酰羟酸合酶的第25位氨基酸由缬氨酸V突变为异亮氨酸I，形成乙酰羟酸合酶突变体；
和/或，ilvC基因编码的野生型乙酰羟酸异构还原酶的第90位氨基酸由异亮氨酸I突变为丝氨酸S，形成乙酰羟酸异构还原酶突变体。
2.根据权利要求1所述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体，其特征在于，野生型乙酰羟酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述乙酰羟酸合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体，其特征在于，所述乙酰羟酸合酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体，其特征在于，所述野生型乙酰羟酸异构还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述乙酰羟酸异构还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求4所述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体，其特征在于，所述乙酰羟酸异构还原酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.一种生物材料，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体。
7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于，对所述生物材料中的ppc和/或gndA基因进行修饰，强化ppc和/或gndA基因的表达。
8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料为微生物，所述微生物的原始菌株包括：谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；
优选地，所述原始菌株由保藏编号为CGMCC No.13406的菌株的a-异丙基苹果酸合酶基因leuA编码区第1个碱基由A突变为G后得到的。
9.权利要求1-5任一项所述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体或权利要求6-8任一项所述的生物材料在生物合成支链氨基酸或其衍生物中的应用。
10.权利要求1-5任一项所述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体或权利要求6-8任一项所述的生物材料在增加L-缬氨酸产量同时降低L-缬氨酸生物合成过程中亮氨酸或异亮氨基酸产量中的应用。
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