CN110982772B - 一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用。本发明提供了一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述高产缬氨酸的棒杆菌，2‑异丙基苹果酸合成酶基因leuA的第1位核苷酸碱基由A突变为G。本发明所述高产缬氨酸的棒杆菌通过弱化leuA基因，降低副产物亮氨酸的积累，提高L‑缬氨酸菌株的生产能力。实验表明本发明所述棒杆菌为L‑缬氨酸高产菌株，能有效积累L‑缬氨酸，提高L‑缬氨酸的产量，为L‑缬氨酸的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。L-缬氨酸呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度：25℃为88.5g/L，50℃为96.2g/L，不溶于冷乙醇、乙醚、丙酮。L-缬氨酸等电点为5.96，熔点315℃。
L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。L-缬氨酸可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。医药工业中，L-缬氨酸可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱，如L-缬氨酸缺乏可引起神经障碍、停止发育、体重下降、贫血等。食品工业中，L-缬氨酸可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。米制糕饼中添加缬氨酸(1g/kg)，产品有芝麻香，用于面包亦能改善风味。L-缬氨酸也可用作氨基酸功能量饮料与运动员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。饲料工业中，对动物的乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用。将其用于雏鸡饲料中，可提高雏鸡对鸡新城疫病毒的免疫能力。而且L-缬氨酸是动物饲料中的一种限制性氨基酸，所以L-缬氨酸可作为饲料添加剂改善动物日粮中氨基酸含量的不足。
目前L-缬氨酸的生产方法有三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。但目前L-缬氨酸的菌种的发酵性能仍较差、L-缬氨酸的转化率仍较低，仍不能满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种高产缬氨酸的棒杆菌，2-异丙基苹果酸合成酶基因leuA的第1位核苷酸碱基由A突变为G。
leuA基因编码的2-异丙基苹果酸合成酶是亮氨酸合成末端途径中的第一个酶，也是亮氨酸合成途径的关键酶，催化2-酮异戊酸与乙酰-CoA反应生成2-异丙基苹果酸；该酶受到亮氨酸的反馈抑制和转录弱化。本发明通过对leuA基因进行点突变，将其编码区第一个碱基由A变为G，从而使起始密码子ATG变为GTG，弱化该代谢通路，有助于增加缬氨酸合成前体2-酮异戊酸，使其更多的流向缬氨酸合成，降低亮氨酸的生成同时提高缬氨酸的产量，从而获得高产L-缬氨酸的基因工程菌。
在本发明中，所述棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)或黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)。
本发明还提供了所述高产缬氨酸的棒杆菌的构建方法，制备leuAA1G点突变基因片段，与载体连接获得单一位点突变重组载体，转化棒杆菌获得单一位点突变的棒杆菌。
在一些实施方案中，所述高产缬氨酸的棒杆菌的构建方法中所述制备leuAA1G点突变基因片段的方法具体为以MHZ-1012-2基因组为模板，分别以leuAA1G-f1/leuAA1G-r1、leuAA1G-f2/leuAA1G-r2引物对扩增得到上游片段leuAA1G-up和下游片段leuAA1G-dn；leuAA1G-up、leuAA1G-dn两片段混合物为模板，以leuAA1G-f1/leuAA1G-r2引物对扩增，得到突变的leuAA1G片段。
在一些实施例中，所述leuAA1G-f1的序列如SEQ ID No.1所示；所述leuAA1G-r1的序列如SEQ ID No.2所示；所述leuAA1G-f2的序列如SEQ ID No.3所示；所述leuAA1G-r2的序列如SEQ ID No.4所示。
在一些实施方案中，所述高产缬氨酸的棒杆菌的构建方法中所述棒杆菌为谷氨酸棒杆菌MHZ-1012-2菌株。本领域技术人员可以按照谷棒经典方法(C.glutamicumHandbook,Charpter23)制备MHZ-1012-2感受态细胞。
在一些实施方案中，所述高产缬氨酸的棒杆菌的构建方法中所述载体为pK18mobsacB。即所述leuAA1G点突变重组载体为pK18mobsacB-leuAA1G。
在一些实施方案中，重组质粒pK18mobsacB-leuAA1G以电穿孔方法转化MHZ-1012-2感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。
进一步的，在一些实施方案中，将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为MHZ-1012-3。
本发明还提供了所述构建方法获得的棒杆菌。
利用本发明获得的棒杆菌进行发酵生产，可获得L-缬氨酸的有效积累，为L-缬氨酸的工业化生产奠定基础。因此本发明还提供了所述棒杆菌在发酵生产L-缬氨酸中的应用。
在一些实施方案中，所述棒杆菌为谷氨酸棒杆菌MHZ-1012-3。
进一步的，本发明还提供了一种L-缬氨酸的生产方法，将上述高产缬氨酸的棒杆菌接种于种子培养基进行种子培养，然后将种子培养物转入发酵培养基发酵培养。
在本发明中，所述种子培养基为玉米浆2.5wt％，葡萄糖1.0wt％，硫酸铵0.4wt％，硫酸镁0.04wt％，磷酸二氢钾0.1wt％，尿素0.1wt％，CaCO30.5wt％，余量为水，pH 7.2。
进一步的，在本发明中，所述种子培养为33℃、220r/min振荡培养16-22h。
在本发明中，所述发酵培养基为玉米浆0.5wt％，葡萄糖12.0wt％，硫酸铵4.0wt％，硫酸镁0.04wt％，磷酸二氢钾0.1wt％，CaCO34 wt％，VH 50μg/L，VB1·HCl 100μg/L，余量为水，pH 7.2。
进一步的，在本发明中，所述发酵培养为33℃、220r/min振荡培养72h。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述高产缬氨酸的棒杆菌，2-异丙基苹果酸合成酶基因leuA的第1位核苷酸碱基由A突变为G。本发明所述高产缬氨酸的棒杆菌通过弱化leuA基因，降低副产物亮氨酸的积累，提高L-缬氨酸菌株的生产能力。实验表明本发明所述棒杆菌为L-缬氨酸高产菌株，能有效积累L-缬氨酸，提高L-缬氨酸的产量，为L-缬氨酸的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示重组质粒pK18mobsacB-leuAA1G的示意图。
具体实施方式
本发明公开了一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，本实验出发菌株MHZ-1012-2为谷氨酸棒杆菌，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13406。所述普通液体脑心浸液培养基配方为3.7％脑心浸粉溶液，所述普通固体脑心浸液培养基配方为3.7％脑心浸粉溶液和1.8％琼脂粉。
实施例1：重组质粒pK18mobsacB-leuAA1G的构建及在MHZ-1012-2中引入点突变
(1)pK18mobsacB-leuAA1G质粒的构建
以MHZ-1012-2基因组为模板，以leuAA1G-f1/leuAA1G-r1引物对进行PCR扩增得到上游片段leuAA1G-up；以MHZ-1012-2基因组为模板，以leuAA1G-f2/leuAA1G-r2引物对进行PCR扩增得到下游片段leuAA1G-dn。以leuAA1G-up、leuAA1G-dn两片段混合物为模板，以leuAA1G-f1/leuAA1G-r2引物对进行PCR扩增，得到突变的leuAA1G片段。leuAA1G片段用EcoRI和SmaI进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双酶切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-leuAA1G。
表1引物序列
| 引物 | 核苷酸序列 | SEQIDNO. |
| leuAA1G-f1 | cgggaattcgcattacttggaacaatcgtg | 1 |
| leuAA1G-r1 | aatgcatcgttaggagacactgtgttcaaccttcttaaaaagttttgggtg | 2 |
| leuAA1G-f2 | gttgaacacagtgtctcctaacgatgcattcatc | 3 |
| leuAA1G-r2 | tcccccgggacaccacgttgcgctgcagg | 4 |
(2)MHZ-1012-2中引入点突变
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备MHZ-1012-2感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-leuAA1G以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为MHZ-1012-3。
实施例2：L-缬氨酸基因工程菌发酵生产L-缬氨酸。
1、培养基
种子培养基：玉米浆2.5wt％，葡萄糖1.0wt％，硫酸铵0.4wt％，硫酸镁0.04wt％，磷酸二氢钾0.1wt％，尿素0.1wt％，CaCO30.5 wt％，余量为水，pH 7.2。
发酵培养基：玉米浆0.5wt％，葡萄糖12.0wt％，硫酸铵4.0wt％，硫酸镁0.04wt％，磷酸二氢钾0.1wt％，CaCO34 wt％，VH 50μg/L，VB1·HCl 100μg/L，余量为水，pH 7.2。
2、MHZ-1012-3摇瓶发酵生产L-缬氨酸
(1)种子培养：挑取MHZ-1012-2、MHZ-1012-3斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养16-22h；
(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养72h。
(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌MHZ-1012-3与出发菌MHZ-1012-2(对照菌)发酵液中的L-缬氨酸及亮氨酸含量，其浓度如下表2所示。
表2发酵液中L-缬氨酸及亮氨酸浓度
结果显示，出发菌株MHZ-1012-2的L-缬氨酸积累量仅为5.5g/L，而本发明所述工程菌MHZ-1012-3的L-缬氨酸产量为7.6g/L，比出发菌株产量提高2g/L；出发菌株MHZ-1012-2的副产物L-亮氨酸积累量为3.0g/L，而本发明的工程菌MHZ-1012-3的L-亮氨酸产量为0.9g/L，比出发菌株产量降低了2.1g/L，由此可见leuA起始密码子由ATG变为GTG，弱化了leuA。降低了亮氨酸形成代谢流，提高了L-缬氨酸形成代谢流，降低副产物亮氨酸增加产物L-缬氨酸。
综上所述，本发明所构建的基因工程菌MHZ-1012-3能够实现发酵过程中L-缬氨酸的有效积累，且降低副产物亮氨酸，该菌株具有广泛的工业应用前景。
序列表
<110> 新疆梅花氨基酸有限责任公司
<120> 一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用
<130> MP1721857
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgggaattcg cattacttgg aacaatcgtg 30
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatgcatcgt taggagacac tgtgttcaac cttcttaaaa agttttgggt g 51
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgaacaca gtgtctccta acgatgcatt catc 34
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcccccggga caccacgttg cgctgcagg 29
Claims (6)
1.一种高产缬氨酸的棒杆菌，其特征在于，以MHZ-1012-2作为出发菌株，将2-异丙基苹果酸合成酶基因leuA的第1位核苷酸碱基由A突变为G；
所述MHZ-1012-2菌株的保藏编为CGMCC No.13406。
2.权利要求1所述棒杆菌的构建方法，其特征在于，制备leuA A1G点突变基因片段，与载体连接获得单一位点突变重组载体，转化谷氨酸棒杆菌MHZ-1012-2菌株获得单一位点突变的棒杆菌；
所述载体为pK18mobsacB。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述制备leuA A1G点突变基因片段的方法具体为以MHZ-1012-2基因组为模板，分别以leuA A1G-f1/leuA A1G-r1、leuA A1G-f2/leuA A1G-r2引物对扩增得到上游片段leuA A1G-up和下游片段leuA A1G-dn；leuA A1G-up、leuA A1G-dn两片段混合物为模板，以leuA A1G-f1/leuA A1G-r2引物对扩增，得到突变的leuA A1G片段；
所述leuA A1G-f1的序列如SEQ ID No.1所示；所述leuA A1G-r1的序列如SEQ ID No.2所示；所述leuA A1G-f2的序列如SEQ ID No.3所示；所述leuA A1G-r2的序列如SEQ ID No.4所示。
4.权利要求1所述棒杆菌在发酵生产L-缬氨酸中的应用。
5.一种L-缬氨酸的生产方法，其特征在于，权利要求1所述棒杆菌接种于种子培养基进行种子培养，然后将种子培养物转入发酵培养基发酵培养。
6.根据权利要求5所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基为玉米浆2.5 wt %，葡萄糖1.0 wt %，硫酸铵0.4 wt％，硫酸镁0.04 wt％，磷酸二氢钾0.1 wt％，尿素0.1 wt％，CaCO3 0.5 wt %，余量为水，pH 7.2；所述发酵培养基为玉米浆0.5 wt %，葡萄糖12.0wt％，硫酸铵4.0 wt％，硫酸镁0.04 wt％，磷酸二氢钾0.1 wt％，CaCO34 wt %，VH 50μg/L，VB1•HCl 100 μg/L，余量为水，pH 7.2；所述种子培养为33℃、220r/min振荡培养16-22h；所述发酵培养为33℃、220r/min振荡培养72h。
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