CN105734004B - 重组菌株及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法、应用。本发明所构建的L‑赖氨酸基因工程菌能够实现发酵过程中L‑赖氨酸的有效积累，且具有较高的糖酸转化率。本发明从头构建的基因工程菌株，避免了随机突变带来的副作用，有利于实现高产酸和高转化率，具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法、应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产L-氨基酸、核苷酸及其他有机酸。
L-赖氨酸是世界上第二大氨基酸生产品种,广泛应用于动物饲料、医药和食品工业。其中约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。
谷氨酸棒杆菌合成L-赖氨酸，从L-天冬氨酸开始，经过六步酶催化得到L-赖氨酸。L-赖氨酸的产率与生物合成途径中的酶活性及代谢流的分布相关，通过增强末端合成途径的酶活性，或改变中央代谢流方向，以及增加还原力的供给，都利于菌株高产L-赖氨酸。
天冬氨酸激酶(lysC编码)作为末端合成途径的第一个关键酶，受到该途径产物L-赖氨酸的反馈抑制。J.Ohnishi等(J.Ohnishi.Appl Microbiol Biotechnol.2002,58:217-223)以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，通过引入点突变，解除了lysC的反馈抑制，突变菌株可积累55g/L L-赖氨酸。高丝氨酸脱氢酶(hom编码)是苏氨酸支路的第一个关键酶，通过引入点突变，弱化该酶活性，可以减少碳源流向苏氨酸分支途径。丙酮酸羧化酶(pyc编码)是回补途径关键酶，增强该酶活性，可以为L-赖氨酸合成提供更多前体。经过3基因改造，J.Ohnishi等获得的基因工程菌株APH-3可积累L-赖氨酸达80g/L。
还原力的供给在L-赖氨酸合成中非常重要。Masato Ikeda等(Ikeda.J IndMicrobiol Biotechnol.2006,33:610-615)以AHP-3为出发菌株，通过引入点突变，提高6-磷酸葡糖酸脱氢酶(gnd编码)活性，所获菌株APG-4可积累L-赖氨酸90g/L。继续引入点突变，弱化苹果酸：醌氧化还原酶(mqo编码)，所获菌株AGM-5可积累L-赖氨酸100g/L。
随着代谢工程技术的发展，从头构建基因工程菌株已应用于工业生产。从头构建的基因工程菌株，其代谢流向更加精准明确，物质与能量平衡更加完美，有利于实现菌株的高产酸和高转化率。
传统诱变和传统代谢工程菌株具有高产酸和高转化率的特性，一定时期内，作为氨基酸生产菌株得到了广泛的应用。但菌株中潜在的未知的随机突变，对菌株生长及产物合成都有一定的副作用。进一步的菌株代谢操作及工艺控制都无法优化到最完美的状态，菌株始终无法达到其最高转化率。
发明内容
有鉴于此，本发明提供重组菌株及其制备方法、应用。本发明从头构建一株基因工程菌株，避免了随机突变带来的副作用，有利于实现高产酸和高转化率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种重组菌株，其包含编码突变lysC蛋白质的突变lysC基因；所述突变lysC蛋白质具有T311I突变。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株还包括编码突变hom蛋白质的突变hom基因；所述突变hom蛋白质具有V59A突变。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株还包括突变dapA基因、突变dapB基因、突变ddh基因中的一个或多个；所述突变dapA基因、突变dapB基因、突变ddh基因为增强dapA基因、dapB基因和/或ddh基因的表达。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株还包括编码突变pyc蛋白质的突变pyc基因；所述突变pyc蛋白质具有P458S突变。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株还包括降低丙酮酸脱氢酶活性的aceE的启动子序列；所述aceE的启动子序列如SEQ ID No.27所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株编码突变gnd蛋白质的突变gnd基因；所述突变gnd蛋白质具有S361F突变。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株所述突变通过sacB重组系统引入。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株其出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株其保藏编号为CGMCC No.11942。
本发明还提供了所述重组菌株发酵生产赖氨酸中的应用。
此外，本发明还提供了一种保藏编号为CGMCC No.11942的L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法，包括如下步骤：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株；
步骤A、通过在lysC中引入点突变T311I，解除天冬氨酸激酶的反馈抑制；
步骤B、通过在hom中引入点突变V59A，弱化高丝氨酸脱氢酶；
步骤C、通过增加拷贝数，增强dapA、dapB、ddh的表达，进而增强其编码的酶的活性；
步骤D、通过在pyc中引入点突变P458S，解除丙酮酸羧化酶的反馈抑制；
步骤E、通过改变aceE的启动子序列，弱化丙酮酸脱氢酶；
步骤F、通过在gnd中引入点突变S361F，解除6-磷酸葡糖酸脱氢酶的反馈抑制。
上述步骤中的点突变和插入突变的引入是通过sacB重组系统完成的。且上述步骤在本发明中次序不分先后，相关技术方案均在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种发酵生产赖氨酸的方法，以本发明所述的重组菌株为发酵菌株。
本发明提供了重组菌株及其制备方法和应用。鉴于天冬氨酸激酶在赖氨酸合成中具有重要作用，解除该酶的反馈抑制(菌株MHZ-0912-1)，ATCC 13032获得有效积累L-赖氨酸的能力，与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)。而减少苏氨酸支路的分流(菌株MHZ-0912-2)，对L-赖氨酸的积累也有促进作用，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。继续增强末端合成途径的酶活性(菌株MHZ-0912-3)，菌株对L-赖氨酸的积累能力进一步提高，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。通过解除丙酮酸羧化酶的反馈抑制(菌株MHZ-0912-4)及弱化丙酮酸脱氢酶(菌株MHZ-0912-5)，利于更多碳源流向草酰乙酸和天冬氨酸方向，为L-赖氨酸合成提供更多前体，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。进一步通过解除6-磷酸葡糖酸脱氢酶的反馈抑制(菌株MHZ-0912-6)，增加了还原力供给，菌株可以更高水平合成L-赖氨酸，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
本发明所构建的L-赖氨酸基因工程菌MHZ-0912-6(保藏编号为CGMCC No.11942)能够实现发酵过程中L-赖氨酸的有效积累，且具有较高的糖酸转化率，该菌株具有广泛的工业应用前景。
生物保藏说明
生物材料MHZ-0912-6，分类命名：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11942。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示重组质粒pK18mobsacB-lysCT311I；
图2示重组质粒pK18mobsacB-homV59A；
图3示重组质粒pK18mobsacB-dapBdapAddh；
图4示重组质粒pK18mobsacB-pycP458S；
图5示重组质粒pK18mobsacB-aceEpro；
图6示重组质粒pK18mobsacB-gndS361F；
图7示ATCC 13032及本发明所构建基因工程菌L-赖氨酸产量示意图。
具体实施方式
本发明公开了重组菌株及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，利用基因工程技术增强L-赖氨酸合成途径的相关基因，弱化分支代谢途径和中央代谢途径，增强磷酸戊糖途径的还原力供应，构建获得一株L-赖氨酸高产菌株MHZ-0912-6，能高效积累L-赖氨酸，具有广泛的工业应用价值。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法。
本发明的第二个目的在于提供一种L-赖氨酸基因工程生产菌。
本发明的第三个目的在于提供一种L-赖氨酸的生产方法。
根据本发明的第一个目的，一种L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法，包括以下步骤：
A、通过在lysC中引入点突变T311I，解除天冬氨酸激酶的反馈抑制；
B、通过在hom中引入点突变V59A，弱化高丝氨酸脱氢酶；
C、通过增加拷贝数，增强dapA、dapB、ddh的表达，进而增强其编码的酶的活性；
D、通过在pyc中引入点突变P458S，解除丙酮酸羧化酶的反馈抑制；
E、通过改变aceE的启动子序列，弱化丙酮酸脱氢酶；
F、通过在gnd中引入点突变S361F，解除6-磷酸葡糖酸脱氢酶的反馈抑制；
点突变和插入突变的引入是通过sacB重组系统完成的。
根据本发明的第二个目的，根据如上所述的方法构建获得一株L-赖氨酸基因工程生产菌MHZ-0912-6。
根据本发明的优选实施例，所述出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。
根据本发明，一种L-赖氨酸基因工程生产菌的保藏编号为CGMCC No.11942。
根据本发明的第三个目的，通过发酵如上所述L-赖氨酸基因工程菌，提供一种L-赖氨酸的生产方法。
试验结果表明，鉴于天冬氨酸激酶在赖氨酸合成中具有重要作用，解除该酶的反馈抑制(菌株MHZ-0912-1)，ATCC 13032获得有效积累L-赖氨酸的能力，与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)。而减少苏氨酸支路的分流(菌株MHZ-0912-2)，对L-赖氨酸的积累也有促进作用，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。继续增强末端合成途径的酶活性(菌株MHZ-0912-3)，菌株对L-赖氨酸的积累能力进一步提高，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。通过解除丙酮酸羧化酶的反馈抑制(菌株MHZ-0912-4)及弱化丙酮酸脱氢酶(菌株MHZ-0912-5)，利于更多碳源流向草酰乙酸和天冬氨酸方向，为L-赖氨酸合成提供更多前体，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。进一步通过解除6-磷酸葡糖酸脱氢酶的反馈抑制(菌株MHZ-0912-6)，增加了还原力供给，菌株可以更高水平合成L-赖氨酸，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
综上所述，本发明所构建的L-赖氨酸基因工程菌MHZ-0912-6(保藏编号为CGMCCNo.11942)能够实现发酵过程中L-赖氨酸的有效积累，且具有较高的糖酸转化率，该菌株具有广泛的工业应用前景。
本发明提供的重组菌株及其制备方法、应用中所用菌株及制剂均可由市场购得。
术语解释：
本发明中涉及的基因名称解释如下：
lysC：天冬氨酸激酶；
hom：高丝氨酸脱氢酶；
dapA：二氢吡啶二羧酸合成酶；
dapB：二氢吡啶二羧酸还原酶；
ddh：二氨基庚二酸脱氢酶；
pyc：丙酮酸羧化酶；
aceE：丙酮酸脱氢酶E1亚基；
gnd：6-磷酸葡糖酸脱氢酶。
以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示：
表1、引物序列信息
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：重组质粒pK18mobsacB-lysCT311I的构建及在ATCC 13032中引入点突变
以ATCC 13032基因组为模板，以lysC-1f/lysC-1r引物对进行PCR扩增，得到上游片段lysC-up；以ATCC 13032基因组为模板，以lysC-2f/lysC-2r引物对进行PCR扩增，得到下游片段lysC-dn。以lysC-up、lysC-dn两片段混合物为模板，以lysC-1f/lysC-2r引物对进行PCR扩增，得到突变的lysCT311I片段。lysCT311I片段用BamHI、NheI进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-lysCT311I。
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备ATCC 13032感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-lysCT311I以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0912-1。
实施例2：重组质粒pK18mobsacB-homV59A的构建及在MHZ-0912-1中引入点突变
以ATCC 13032基因组为模板，以hom-1f/hom-1r引物对进行PCR扩增，得到上游片段hom-up；以ATCC 13032基因组为模板，以hom-2f/hom-2r引物对进行PCR扩增，得到下游片段hom-dn。以hom-up、hom-dn两片段混合物为模板，以hom-1f/hom-2r引物对进行PCR扩增，得到突变的homV59A片段。homV59A片段用BamHI、NheI进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-homV59A。
按照谷棒经典方法制备MHZ-0912-1感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-homV59A以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0912-2。
实施例3：重组质粒pK18mobsacB-dapBdapAddh的构建及在MHZ-0912-2中引入点突变
以ATCC 13032基因组为模板，以dapB-1f/dapA-1r引物对进行PCR扩增，得到dapBdapA-up全长片段。以ATCC 13032基因组为模板，以dapB-2f/dapA-2r引物对进行PCR扩增，得到dapBdapA-dn全长片段。以ATCC 13032基因组为模板，以ddh-f/ddh-r引物对进行PCR扩增，得到ddh全长片段。以dapBdapA-up、dapBdapA-dn、ddh三片段为模板，以dapB-1f/dapA-2r引物对进行PCR扩增，回收大片段。该片段用SbfI、NheI进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-dapBdapAddh。
按照谷棒经典方法制备MHZ-0912-2感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-dapBdapAddh以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0912-3。
实施例4：重组质粒pK18mobsacB-pycP458S的构建及在MHZ-0912-3中引入点突变
以ATCC 13032基因组为模板，以pyc-1f/pyc-1r引物对进行PCR扩增，得到上游片段pyc-up；以ATCC 13032基因组为模板，以pyc-2f/pyc-2r引物对进行PCR扩增，得到下游片段pyc-dn。以pyc-up、pyc-dn两片段混合物为模板，以pyc-1f/pyc-2r引物对进行PCR扩增，得到突变的pycP458S片段。pycP458S片段用SphI、NheI进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-pycP458S。
按照谷棒经典方法制备MHZ-0912-3感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-pycP458S以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0912-4。
实施例5：重组质粒pK18mobsacB-aceEpro的构建及在MHZ-0912-4中引入点突变
以ATCC 13032基因组为模板，以aceE-1f/aceE-1r引物对进行PCR扩增，得到上游片段aceEpro-up；以ATCC 13032基因组为模板，以aceE-2f/aceE-2r引物对进行PCR扩增，得到下游片段aceEpro-dn。以aceEpro-up、aceEpro-dn两片段混合物为模板，以aceE-1f/aceE-2r引物对进行PCR扩增，得到启动子突变的aceE片段。aceE片段用BamHI、NheI进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-aceEpro。
按照谷棒经典方法制备MHZ-0912-4感受态细胞，重组质粒pK18mobsacB-aceEpro以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0912-5。
实施例6：重组质粒pK18mobsacB-gndS361F的构建及在MHZ-0912-5中引入点突变
以ATCC 13032基因组为模板，以gnd-1f/gnd-1r引物对进行PCR扩增，得到上游片段gnd-up；以ATCC 13032基因组为模板，以gnd-2f/gnd-2r引物对进行PCR扩增，得到下游片段gnd-dn。以gnd-up、gnd-dn两片段混合物为模板，以gnd-1f/gnd-2r引物对进行PCR扩增，得到突变的gndS361F片段。gndS361F片段用XbaI、NheI进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-gndS361F。
按照谷棒经典方法制备MHZ-0912-5感受态细胞，重组质粒pK18mobsacB-gndS361F以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0912-6。
根据谷氨酸棒杆菌中L-赖氨酸的代谢途径，本发明在菌株ATCC 13032的基础上构建得到一个基因工程菌株MHZ-0912-6，该菌株涉及hom、aceE的弱化及pyc、gnd、lysC、dapA、dapB、ddh的增强，其中hom的弱化减少了往苏氨酸方向的代谢流路，aceE的弱化减少了TCA循环的代谢流，pyc的增强有利于前体的供应，gnd的增强有利于还原力的供给，lysC、dapA、dapB、ddh的增强有利于末端合成途径的增强。
实施例7：L-赖氨酸基因工程菌发酵生产L-赖氨酸
将实施例1至实施例6所构建基因工程菌株于500ml三角摇瓶中进行发酵培养，培养温度33℃，培养时间14～15小时，每组实验设置三个平行。所述发酵培养基组分如下：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO425g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，豆粕水解液10g/L，CaCO330g/L，NaOH调pH7.0。各基因工程菌株发酵产L-赖氨酸结果见表2。
表2各基因工程菌株发酵产L-赖氨酸结果
由表2可知，天冬氨酸激酶在赖氨酸合成中具有重要作用，解除该酶的反馈抑制(菌株MHZ-0912-1)，ATCC 13032获得有效积累L-赖氨酸的能力，与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)。而减少苏氨酸支路的分流(菌株MHZ-0912-2)，对L-赖氨酸的积累也有促进作用，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。继续增强末端合成途径的酶活性(菌株MHZ-0912-3)，菌株对L-赖氨酸的积累能力进一步提高，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。通过解除丙酮酸羧化酶的反馈抑制(菌株MHZ-0912-4)及弱化丙酮酸脱氢酶(菌株MHZ-0912-5)，利于更多碳源流向草酰乙酸和天冬氨酸方向，为L-赖氨酸合成提供更多前体，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。进一步通过解除6-磷酸葡糖酸脱氢酶的反馈抑制(菌株MHZ-0912-6)，增加了还原力供给，菌株可以更高水平合成L-赖氨酸，与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
综上所述，本发明所构建的L-赖氨酸基因工程菌MHZ-0912-6(保藏编号为CGMCCNo.11942)能够实现发酵过程中L-赖氨酸的有效积累，且具有较高的糖酸转化率，该菌株具有广泛的工业应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.11942 。
2.根据权利要求1所述的重组菌株在发酵生产赖氨酸中的应用。
3.一种发酵生产赖氨酸的方法，其特征在于，包括以如权利要求1所述的重组菌株为发酵菌株。
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