CN109750069A

CN109750069A - 生产l-赖氨酸的重组菌、其构建方法以及l-赖氨酸的生产方法

Info

Publication number: CN109750069A
Application number: CN201711058221.4A
Authority: CN
Inventors: 温廷益; 张琛; 商秀玲; 柴欣; 张芸; 刘树文; 王国强; 李忠财
Original assignee: Beijing Zhongke Yipin Biotechnology Co ltd; Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Beijing Zhongke Yipin Biotechnology Co ltd; Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2019-05-14
Also published as: JP6961819B2; EP3690027A1; CA3081113A1; EP3690027A4; PH12020550529A1; WO2019085445A1; US20200347419A1; JP2021500914A

Abstract

本发明涉及一种生产L‑赖氨酸的重组菌、其构建方法以及L‑赖氨酸的生产方法。该重组菌与出发菌相比具有提高的天冬酰胺酶的表达和/或活性，出发菌为能够积累赖氨酸的菌株。该重组菌经发酵培养观察到了可叠加提高产量的效果，显著提高了L‑赖氨酸的产量。

Description

生产L-赖氨酸的重组菌、其构建方法以及L-赖氨酸的生产方法

技术领域

本发明总地涉及微生物发酵领域，具体涉及生产L-赖氨酸的重组菌、其构建方法以及L-赖氨酸的生产方法。

背景技术

L-赖氨酸是人体九种必需氨基酸之一，具有调节机体代谢平衡，促进生长发育等多种生理功能，被广泛应用于食品、饲料和医药领域。在饲料行业，赖氨酸是猪和家禽生长的第一限制性氨基酸。在饲料中添加L-赖氨酸，可以提高饲料中氨基酸和蛋白质的利用率，改善饲料的营养效价，促进畜禽生长。在食品行业，L-赖氨酸主要用于营养强化剂和除臭剂。在医药领域，L-赖氨酸是复合氨基酸制剂的主要成分之一。目前，赖氨酸工业是仅次于谷氨酸的第二大氨基酸工业，因此，L-赖氨酸的工业生产研究具有重要的意义。

目前，L-赖氨酸主要采用微生物直接发酵法生产。赖氨酸生产菌的发酵生产性能是影响发酵法生产成本的关键因素。

赖氨酸高产菌株的选育方法主要有传统诱变法和代谢工程改造。

通过诱变筛选获得的菌株会积累大量的负效应突变，导致菌株生长缓慢、环境耐受性降低以及营养需求增高等问题。这些缺陷限制了菌株的工业化应用。

如图1所示，在谷氨酸棒状杆菌赖氨酸合成代谢途径中，赖氨酸的合成前体是三羧酸循环(TCA循环)中的草酰乙酸，草酰乙酸经转氨生成天冬氨酸，进入赖氨酸合成途径。因此，现有技术对赖氨酸生产菌株的代谢工程改造主要集中在赖氨酸终端合成途径、提供合成前体的糖酵解途径、TCA循环以及提供辅因子NADPH的戊糖磷酸途径关键基因的修饰。具体地，其主要通过增强丙酮酸羧化酶基因(pyc基因)表达，减弱磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(pck基因)表达等方式提高草酰乙酸的合成，以提高赖氨酸的积累。然而，迄今为止，尚未有现有技术从影响天冬氨酸的供给角度对赖氨酸生产菌株进行代谢工程改造。

发明内容

本发明人在前期研究中发现，天冬氨酸的供给也是影响赖氨酸的合成关键因素。提高天冬氨酸的合成可以保证赖氨酸大量合成的前体物质供应，提高菌株赖氨酸的合成效率。在天冬氨酸代谢过程中，天冬氨酸经天冬酰胺合酶催化生成天冬酰胺，天冬酰胺又经天冬酰胺酶催化水解生成天冬氨酸和氨。

本发明的目的在于通过对赖氨酸生产菌株进行代谢工程改造，提供一种生产L-赖氨酸的重组菌。

本发明提供了一种生产L-赖氨酸的重组菌，其中，所述重组菌与出发菌相比具有提高的天冬酰胺酶(EC 3.5.1.1asparaginase)的表达和/或活性，所述出发菌为能够积累赖氨酸的菌株。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述重组菌具有至少两个拷贝的天冬酰胺酶编码基因，和/或所述重组菌的天冬酰胺酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导。优选地，所述调控元件为强启动子。更优选地，所述强启动子为所述出发菌的P_tuf启动子。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述重组菌与出发菌相比具有降低的高丝氨酸脱氢酶(Hom)的表达和/或活性。所述降低高丝氨酸脱氢酶表达由如下至少一种方式实现：(A)所述重组菌的高丝氨酸脱氢酶编码基因失活，(B)所述重组菌的高丝氨酸脱氢酶编码基因的表达以低转录或低表达活性的调控元件介导。所述降低高丝氨酸脱氢酶的活性通过如下方式实现：所述重组菌的高丝氨酸脱氢酶的第59位缬氨酸突变为丙氨酸，所述重组菌的高丝氨酸脱氢酶编码基因优选如SEQ ID NO.1所示。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述重组菌与出发菌相比具有提高的丙酮酸羧化酶(pyc)的表达和/或活性。优选地，所述提高丙酮酸羧化酶表达通过如下至少一种方式实现：(C)所述重组菌具有至少两个拷贝的丙酮酸羧化酶编码基因，(D)所述重组菌的丙酮酸羧化酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导。所述提高丙酮酸羧化酶活性通过如下方式实现：所述重组菌的丙酮酸羧化酶的第458位脯氨酸突变为丝氨酸，所述重组菌的丙酮酸羧化酶编码基因优选如SEQ ID NO.8所示。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述重组菌与出发菌相比具有降低的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck)的表达和/或活性。优选地，所述重组菌的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因失活，和/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因的表达以低转录或低表达活性的调控元件介导。更优选地，所述失活为敲除所述重组菌的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述重组菌与出发菌相比具有提高的二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)的表达和/或活性。优选地，所述重组菌具有至少两个拷贝的二氢吡啶二羧酸还原酶编码基因，和/或二氢吡啶二羧酸还原酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导。更优选地，所述调控元件为强启动子。最优选地，所述强启动子为所述出发菌的P_tuf启动子。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述重组菌与出发菌相比具有提高的天门冬氨酸激酶(lysC)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)和/或二氨基庚酸脱羧酶(lysA)的表达和/或活性。优选地，所述重组菌具有至少两个拷贝的天门冬氨酸激酶编码基因、二氨基庚二酸脱氢酶编码基因和/或二氨基庚酸脱羧酶编码基因，和/或天门冬氨酸激酶编码基因、二氨基庚二酸脱氢酶编码基因和/或二氨基庚酸脱羧酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导。更优选地，所述调控元件为强启动子。最优选地，所述强启动子为所述出发菌的P_tuf启动子。

或优选地，根据前述的重组菌，其中，所述出发菌为选自棒杆菌属、短杆菌属、芽胞杆菌属、双歧杆菌属和乳杆菌属中的一株细菌或选自酵母中的一株真菌。

所述棒杆菌属的细菌选自谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum、北京棒杆菌Corynebacterium pekinense、有效棒杆菌Corynebacterium efficiens、钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum、嗜热产氨棒杆菌Corynebacterium thermoaminogenes、产氨棒杆菌Corynebacterium aminogenes、百合棒杆菌Corynebacterium lilium、美棒杆菌Corynebacterium callunae和力士棒杆菌Corynebacterium herculis中的一株细菌。

所述短杆菌属的细菌选自黄色短杆菌Brevibacteriaceae flvum、乳酸发酵短杆菌Brevibacteriaceae lactofermentum和产氨短杆菌Brevibacteriaceae ammoniagenes中的一株细菌。

所述芽胞杆菌属的细菌选自地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis和短小芽胞杆菌Bacillus pumilus中的一株细菌。

所述双歧杆菌属的细菌选自地两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、长双歧杆菌Bifidobacterium longum、短双歧杆菌Bifidobacterium breve和青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis中的一株细菌。

所述乳杆菌属的细菌选自嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、德式乳杆菌乳酸亚种Lactobacillus delbrueckii subsp和发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum中的一株细菌。

所述酵母的真菌为选自产朊假丝酵母Candida utilis、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、毕赤酵母Pichia pastoris和汉逊酵母Hansenula polymorpha中的一株真菌。

本发明还提供了一种上述重组菌的构建方法，其中，包括如下步骤：提高所述出发菌中天冬酰胺酶的表达和/或活性。具体地，提高所述出发菌中天冬酰胺酶的表达和/或活性通过如下至少一种方式实现：(E)增加所述出发菌中天冬酰胺酶编码基因的拷贝数，(F)将所述出发菌中的天冬酰胺酶编码基因的调控元件替换为高转录或高表达活性的调控元件。

优选地，所述构建方法还包括如下步骤：降低所述出发菌中高丝氨酸脱氢酶的表达和/或活性。

优选地，所述构建方法还包括如下步骤：提高所述出发菌中丙酮酸羧化酶的表达和/或活性。

优选地，所述构建方法还包括如下步骤：降低所述出发菌中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的表达和/或活性。具体地，降低所述出发菌中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的表达和/或活性通过如下至少一种方式实现：(G)失活所述出发菌染色体的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因，所述失活优选为敲除，(H)将所述出发菌中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因的调控元件替换为低转录或低表达活性的调控元件。

优选地，所述构建方法还包括如下步骤：提高所述出发菌中二氢吡啶二羧酸还原酶的表达和/或活性。具体地，提高所述出发菌中二氢吡啶二羧酸还原酶的表达和/或活性通过如下至少一种方式实现：(I)增加所述出发菌中二氢吡啶二羧酸还原酶编码基因的拷贝数，(J)将所述出发菌中的二氢吡啶二羧酸还原酶的调控元件替换为高转录或高表达活性的调控元件。

或优选地，所述构建方法还包括如下步骤：提高出发菌中天门冬氨酸激酶、二氨基庚二酸脱氢酶和/或二氨基庚酸脱羧酶的表达和/或活性。具体地，提高所述出发菌中天门冬氨酸激酶、二氨基庚二酸脱氢酶和/或二氨基庚酸脱羧酶的表达和/或活性通过如下至少一种方式实现：(L)增加所述出发菌中天门冬氨酸激酶编码基因、二氨基庚二酸脱氢酶编码基因和/或二氨基庚酸脱羧酶编码基因的拷贝数，(M)将所述出发菌中的天门冬氨酸激酶编码基因、二氨基庚二酸脱氢酶编码基因和/或二氨基庚酸脱羧酶编码基因的调控元件替换为高转录或高表达活性的调控元件。

本发明还提供了一种L-赖氨酸的生产方法，其中，包括如下步骤：发酵培养上述的重组菌。

本发明提供的生产L-赖氨酸的重组菌经发酵培养观察到了可叠加提高产量的效果，显著提高了L-赖氨酸的产量。发酵48小时的赖氨酸生产强度为0.05-5g/L/h，发酵结束时的赖氨酸产量为1-300g/L。

本发明首次提出了通过增强天冬酰胺酶的表达，提高赖氨酸的合成前体天冬氨酸的供给的代谢工程改造策略，显著提高赖氨酸的产量，从而在实践上可用于细菌发酵生产赖氨酸。其开辟并且实践证明了新的提高赖氨酸的发酵产量的方法，观察到了可以叠加提高产量的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产赖氨酸，便于推广应用。

附图说明

图1为谷氨酸棒状杆菌赖氨酸合成代谢途径示意图；

图2为重组质粒YZ022示意图；

图3为重组质粒YZ023示意图；

图4为重组质粒YZ025示意图；

图5为重组质粒YE019示意图；

图6为重组质粒YZ037示意图；

图7为重组质粒YZ039示意图；以及

图8为重组质粒YZ035示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

本发明涉及一种生产L-赖氨酸的重组菌，其中，重组菌与出发菌相比具有提高的天冬酰胺酶的表达和/或活性，出发菌为能够积累赖氨酸的菌株。

提高的天冬酰胺酶表达和/或活性能够是基于各种因素，其包括编码基因拷贝数增加、用更有效的强启动子替换天然启动子以及旨在增加活性的人工突变。具体地，基因拷贝数可以通过内源和/或外源等位基因的引入和/或扩增而增加。至于基因启动子的置换，其例子包括引入内源和/或外源启动子，使用的启动子具有有效活性使其下游结构基因表达有效增强。

在一种实施方案中，重组菌具有至少两个拷贝的天冬酰胺酶编码基因。具体地，重组菌是在其核DNA中除了内源天冬酰胺酶编码基因一个拷贝之外，还具有来自内源和/或外源的一个或多个天冬酰胺酶编码基因拷贝。更具体地，天冬酰胺酶编码基因的核苷酸序列能够为SEQ ID NO.39所示。

在一种实施方案中，重组菌的天冬酰胺酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导。优选地，调控元件为强启动子。更优选地，强启动子为出发菌的P_tuf启动子。具体地，在重组菌核DNA中的天冬酰胺酶编码基因上游，具有有效的内源和/或外源强启动子，从而导致天冬酰胺酶编码基因的表达有效提高。

本发明所述的“出发菌”(或又称“出发菌株”)是指用于本发明基因改造策略的初始菌株。该菌株可以是天然存在的菌株，也可以是通过诱变或遗传工程改造等方式选育的菌株。

本发明所述的“失活”指的是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果，包括但不限于，定点突变、插入失活和/或敲除。

本发明所述的基因敲除、基因插入、启动子替换和定点突变的方法能够为通过载体携带改造靶基因的同源臂发生同源重组实现。

本发明所述的导入某基因或增加某基因的拷贝数可通过构建包含该基因的重组质粒，再将重组质粒导入出发菌中实现，或也可直接将某基因插入出发菌染色体上的合适位点实现。

虽然在本发明中给出了高转录或高表达活性的调控元件的示例，但对于高转录或高表达活性的调控元件，在本发明中均没有特别限制，只要能够起到增强所启动基因的表达即可。可以列举的可用于本发明的调控元件有出发菌的P₄₅、P_eftu、P_sod、P_glyA、P_pck、P_pgk启动子等，但不限于此。而对于低转录或低表达活性的调控元件，在本发明中也没有特别限制，只要能够起到降低所启动基因的表达即可。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等。实施例中所用仪器设备和试剂为市售的常用仪器、试剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1赖氨酸底盘工程菌的构建

本实施例以谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032为出发菌株，通过定点突变hom(高丝氨酸脱氢酶，GenBank:CAF19887.1)基因，减弱分支途径苏氨酸合成途径的代谢流量；定点突变pyc(丙酮酸羧化酶，GenBank:CAF19394.1)基因提高赖氨酸合成前体草酰乙酸的供给；敲除pck(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，GenBank:CAF20888.1)基因同时增加pyc*和dapB(二氢吡啶二羧酸还原酶，GenBank:CAF20314.1)基因的拷贝数；质粒过表达lysC(天门冬氨酸激酶，GenBank:CAF18822.1)、ddh(二氨基庚二酸脱氢酶，GenBank:CAF21279.1)、lysA(二氨基庚酸脱羧酶，GenBank:CAF19884.1)基因，进一步增强赖氨酸的合成途径，构建产赖氨酸底盘工程菌。

(1)染色体hom基因的定点突变

根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的hom基因及其上下游序列分别设计引物。

以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，在突变位点设计引物分别扩增突变位点上下游的两部分hom基因。以P1和P2为引物扩增hom基因上半部分，以P3和P4为引物扩增hom基因下半部分。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P1和P4为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到1638bp的PCR产物，为包含有第59位缬氨酸突变为丙氨酸(V59A突变)的hom基因(SEQ ID NO.1)。

将上述1638bp的PCR产物经Xba I和EcoR I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB(购自美国典型微生物保藏中心ATCC，货号87097)连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P5和P6为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Xba I和EcoR I双酶切鉴定，得到1638bp的为阳性。

将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为YE019，其结构如图5所示。

表1

将序列测定正确的同源重组质粒YE019电转化至谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032中。通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过蔗糖反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P5和P6为引物进行PCR扩增鉴定，得到经鉴定正确的重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌EPCG1000。

提取该重组菌基因组DNA进行测序，结果证实已成功将谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032中的hom基因替换为V59A的hom基因，谷氨酸棒杆菌EPCG1000构建成功。

(2)染色体pyc基因的定点突变

根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的pyc基因及其上下游序列分别设计引物。

以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，在突变位点设计引物分别扩增突变位点上下游的两部分pyc基因。以P7和P8为引物扩增pyc基因上半部分，以P9和P10为引物扩增pyc基因下半部分。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P7和P10为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到3423bp的PCR产物，为包含有第458位脯氨酸突变为丝氨酸(P458S突变)的pyc基因(SEQ ID NO.8)，即pyc*基因。

将上述3423bp的PCR产物经Xba I和Hind III双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB(购自美国典型微生物保藏中心ATCC，货号87097)连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P11和P12为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Xba I和Hind III双酶切鉴定，得到3423bp的为阳性。

将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中SEQ ID NO.8所示的核苷酸插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为YZ037，其结构如图6所示。

表2

将序列测定正确的同源重组质粒YZ037电转化至谷氨酸棒杆菌EPCG1000中。通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过蔗糖反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P11和P12为引物进行PCR扩增鉴定，得到经鉴定正确的重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌EPCG1007。

提取该重组菌基因组DNA进行测序，结果证实已成功将谷氨酸棒杆菌EPCG1000中的pyc基因替换为P458S突变的pyc*基因，谷氨酸棒杆菌EPCG1007构建成功。

(3)pck基因的敲除和pyc*-dapB增加拷贝

根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的pck基因及其上下游序列分别设计引物。

以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P13和P14为引物扩增pck基因上游部分的序列(SEQ ID NO.15)，以P15和P16为引物扩增pyc基因的启动子，以P21和P22为引物扩增pck基因下游部分的序列(SEQ ID NO.16)。以纯化的上述PCR产物分别作为pyc*-dapB操纵子的上下游同源臂，在整合入谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组时，可以达到敲除pck的目的。

分别以(2)中构建好的带有点突变的pyc*基因与谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA作为模板，设计引物分别扩增pyc*与dapB(SEQ ID NO.17)。从NCBI数据库中获取相关基因序列的碱基信息，共设计六对引物，以构建pyc*-dapB基因片段(表3)。

表3

以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA作为模板，分别以P13和P14、P15和P16、P17和P18、P19和P20、P21和P22扩增长度为750bp、244bp、3423bp、896bp与767bp的基因，其分别为pck基因上游部分的序列、pyc基因的启动子序列(SEQ ID NO.57)、pyc*基因序列、dapB基因序列以及pck基因下游部分的序列。

将纯化后的上述PCR产物与大肠杆菌克隆载体pK18mobsacB混合，利用NEbuilder(NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit)进行连接组装，之后转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P23和P24为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒。

将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将pyc*-dapB插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为YZ039，其结构如图7所示。

将序列测定正确的同源重组质粒YZ039电转化至谷氨酸棒杆菌EPCG1007中。通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过蔗糖反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P23和P24为引物进行PCR扩增鉴定，得到经鉴定正确的重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌EPCG1009。

提取该重组菌基因组DNA进行测序，结果证实已成功将谷氨酸棒杆菌EPCG1007中的pck基因敲除，同时插入了pyc*-dapB基因片段，谷氨酸棒杆菌EPCG1009构建成功。

(4)lysC、ddh、lysA基因增加拷贝

根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的lysC(SEQ ID NO.30)、ddh(SEQ IDNO.31)、lysA(SEQ ID NO.32)基因及其上下游序列分别设计引物。

以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA作为模板，设计引物分别扩增lysC、ddh、lysA基因。

表4

以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA作为模板，分别以P25和P26、P27和P28、P29和P30扩增长度为1266bp、963bp与1338bp的基因。

将纯化后的上述PCR产物与大肠杆菌克隆载体pXMJ19混合，利用NEbuilder(NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit)进行连接组装，之后转化入大肠杆菌DH5α，在含氯霉素(20μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P25和P30为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒。

将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将lysC、ddh、lysA插入载体pXMJ19中得到的重组质粒，命名为YZ035，其结构如图8所示。

将序列测定正确的同源重组质粒YZ035电转化至谷氨酸棒杆菌EPCG1009中。将在抗性平板上可以生长的阳性菌落以P25和P30为引物进行PCR扩增鉴定，得到经鉴定正确的重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌EPCG1010。

提取该重组菌基因组DNA进行测序，结果证实已成功向谷氨酸棒杆菌EPCG1009中引入游离质粒YZ035，谷氨酸棒杆菌EPCG1010构建成功。

实施例2赖氨酸底盘工程菌中天冬酰胺酶编码基因NCgl2026的启动子替换

根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的NCgl2026基因启动子上下游序列和P_tuf启动子序列(SEQ ID NO.40)分别设计引物。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P31和P32为引物，PCR扩增NCgl2026基因启动子上游同源臂；以P33和P34为引物扩增启动子P_tuf；以P35和P36为引物扩增NCgl2026基因启动子下游同源臂。以纯化的上述PCR产物为模板，以P31和P36为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到1800bp的PCR产物，为含替换启动子P_tuf及被替换启动子的上下游同源臂的片段。

将上述1800bp的PCR产物经Xba I和EcoR I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB(购自美国典型微生物保藏中心ATCC，货号87097)连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P31和P36为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1800bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Xba I和EcoR I双酶切鉴定，得到1800bp的为阳性。

将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将包含有上下游同源臂的强启动子P_tuf插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为YZ022，其结构如图2所示。

表6

将序列测定正确的同源重组质粒YZ022电转化至谷氨酸棒杆菌EPCG1010中。通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过蔗糖反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P31和P36为引物进行PCR扩增鉴定，得到1800bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌EPCG1036。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将谷氨酸棒杆菌EPCG1010中的NCgl2026的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源强启动子P_tuf，谷氨酸棒杆菌EPCG1036构建成功。

实施例3赖氨酸底盘工程菌中天冬酰胺酶编码基因NCgl2026增加拷贝

根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的NCgl2026基因及其上下游序列设计引物。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P37和P38为引物，PCR扩增目标插入位点上游序列作为NCgl2026基因增加拷贝的上游同源臂；以P39和P40为引物扩增NCgl2026基因；以P41和P42为引物扩增目标插入位点下游序列作为NCgl2026基因增加拷贝的下游同源臂。以纯化的上述PCR产物为模板，以P37和P42为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到2778bp的PCR产物，为含有目标插入位点上下游同源臂及NCgl2026基因的片段。

将上述2778bp的PCR产物经Xba I和Nhe I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB(购自美国典型微生物保藏中心ATCC，货号87097)连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P37和P42为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2778bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Xba I和Nhe I双酶切鉴定，得到2778bp的为阳性。

将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将含有目标插入位点上下游同源臂及NCgl2026基因插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为YZ023，其结构如图3所示。

表7

将序列测定正确的同源重组质粒YZ023电转化至谷氨酸棒杆菌EPCG1010中。通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过蔗糖反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P37和P42为引物进行PCR扩增鉴定，得到2778bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌EPCG1039。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功在谷氨酸棒杆菌EPCG1010中的目标位点插入一个拷贝的NCgl2026基因，谷氨酸棒杆菌EPCG1039构建成功。

实施例4赖氨酸底盘工程菌中天冬酰胺酶编码基因NCgl2026的敲除

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P43和P44为引物，PCR扩增NCgl2026基因上游同源臂；以P45和P46为引物扩增NCgl2026基因下游同源臂。以纯化的上述PCR产物为模板，以P43和P46为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到1600bp的PCR产物，为含有NCgl2026基因上下游同源臂的片段。

将上述1600bp的PCR产物经EcoR I和Nhe I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB(购自美国典型微生物保藏中心ATCC，货号87097)连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P43和P46为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1600bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行EcoR I和Nhe I双酶切鉴定，得到1600bp的为阳性。

将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将含有NCgl2026基因上下游同源臂片段插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为YZ025，其结构如图4所示。

表8

将序列测定正确的同源重组质粒YZ025电转化至谷氨酸棒杆菌EPCG1010中。通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过蔗糖反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P43和P46为引物进行PCR扩增鉴定，得到1600bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌EPCG1038。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功在谷氨酸棒杆菌EPCG1010中敲除NCgl2026基因，谷氨酸棒杆菌EPCG1038构建成功。

实施例5谷氨酸棒杆菌赖氨酸工程菌在赖氨酸发酵生产中的应用

分别在摇瓶水平与3L发酵罐水平培养在实施例2到4中构建的产L-赖氨酸谷氨酸棒状杆菌EPCG1036、EPCG1038、EPCG1039和出发菌株EPCG1010以生产L-赖氨酸，方法如下所述。

(1)摇瓶发酵：

将谷氨酸棒状杆菌EPCG1036、EPCG1038、EPCG1039和EPCG1010接种在含有50ml下述种子培养基的500ml三角瓶中，于30℃以220rpm振荡培养8-9小时。然后，将5ml的每一种种子培养液接种入含有50ml下述发酵培养基的500ml挡板瓶中，于37℃以220rpm振荡培养42-46小时。并于发酵培养6h时加入终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行目的基因的诱导表达。间歇补加浓氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2之间，根据残糖情况，补加浓度为400g/L的葡萄糖母液，控制发酵液残糖在5-10g/L。

(2)3L发酵罐发酵：

将谷氨酸棒状杆菌EPCG1036、EPCG1038、EPCG1039和EPCG1010接种在含有100ml下述种子培养基的1000ml三角瓶中，于30℃以220rpm振荡培养8-9小时。然后，将每一种种子培养液接种入含有900ml下述发酵培养基的3L发酵罐中，于37℃、0.01MPa罐压培养42-46小时。将种子液按照体积百分含量为10％接种到含有终浓度10μg/ml氯霉素的发酵培养基中。采用的发酵罐为3L发酵罐：内置定速可编程控泵，可以实现恒速补料。发酵过程中通过蠕动泵补加600g/L的葡萄糖，控制发酵体系中葡糖糖的浓度为5-10g/L，通过加热套和冷却水控制发酵温度维持在30℃；通入空气提供溶氧，转速与溶氧信号级联控制溶氧维持在30％；补加浓氨水调控pH，维持在6.9左右。发酵连续进行52h。当OD₆₀₀＝4-5时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，终浓度为0.1mmol/L)诱导重组质粒携带的基因表达。

种子培养基和发酵培养基如下所述：

种子培养基(pH 7.0)

蔗糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素3.5g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾10g、七水硫酸镁0.5g、生物素0.2mg、维生素B11.5mg、右旋泛酸钙2mg、烟酰胺3mg(溶于1升蒸馏水中)。

发酵培养基(pH 7.0)

葡萄糖40g、糖蜜20g、磷酸0.4g、硫酸铵15g、七水硫酸镁0.87g、生物素0.88mg、维生素B16.3mg、右旋泛酸钙6.3mg、烟酰胺42mg(溶于1升蒸馏水中)。

(3)检测赖氨酸产量

HPLC方法：

1、流动相：

有机相：甲醇：乙腈：水＝45:45:10(V/V)；

水相：12.436g NaH₂PO₄·2H₂O溶于2L超纯水中，用NaOH调PH至7.8。

2、洗脱程序：

以赖氨酸标准品配制标准浓度的溶液，浓度分别为0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L，根据峰面积绘制标准曲线，计算发酵液中的赖氨酸浓度如下：

表9

摇瓶发酵实验结果显示，增强天冬酰胺酶基因表达，赖氨酸的产量显著提高；敲除该基因后，赖氨酸产量明显下降。

与摇瓶发酵结果相对应，在3L发酵罐水平发酵，增加一个拷贝的天冬酰胺酶编码基因，赖氨酸产量提高59.48％；将天冬酰胺酶编码基因启动子替换为强启动子，赖氨酸产量提高14.83％；而敲除天冬酰胺酶编码基因赖氨酸产量下降27.39％。

实施例6北京棒杆菌1.563中天冬酰胺酶编码基因NCgl2026的增强表达

以能够积累赖氨酸的北京棒杆菌AS1.563为出发菌株，分析天冬酰胺酶编码基因的表达对赖氨酸积累的影响。

(1)NCgl2026基因的强启动子替换

将实施例2中所构建的重组载体YZ022，转化至北京棒杆菌AS1.563(中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC10178)中，以实现将NCgl2026基因启动子替换为强启动子Ptuf。

通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过蔗糖反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P31和P36为引物进行PCR扩增鉴定，得到1800bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌CP1008。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将北京棒杆菌中AS1.563的NCgl2026的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源强启动子Ptuf，谷氨酸棒杆菌CP1008构建成功。

(2)NCgl2026基因增加拷贝

将实施例3中所构建的重组载体YZ023，转化至北京棒杆菌AS1.563中，以实现NCgl2026基因增加拷贝。

通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过蔗糖反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P37和P42为引物进行PCR扩增鉴定，得到2778bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌CP1009。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功在北京棒杆菌AS1.563中的目标位点插入一个拷贝的NCgl2026基因，北京棒杆菌CP1009构建成功。

(3)北京棒杆菌AS1.563中天冬酰胺酶编码基因NCgl2026的敲除

将实施例4中所构建的重组载体YZ025，转化至北京棒杆菌AS1.563中，以实现NCgl2026基因敲除。

通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过蔗糖反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P43和P46为引物进行PCR扩增鉴定，得到1600bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌CP1010。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功在北京棒杆菌AS1.563中敲除NCgl2026基因，北京棒杆菌CP1010构建成功。

实施例7北京棒杆菌赖氨酸工程菌在赖氨酸发酵生产中的应用

分别在摇瓶水平与3L发酵罐水平培养在实施例6中构建的产L-赖氨酸菌株北京棒杆菌CP1008、CP1009、CP1010和出发菌株AS1.563以生产L-赖氨酸，方法如下所述。

(1)摇瓶发酵：

将北京棒杆菌CP1008、CP1009、CP1010和AS1.563接种在含有50ml下述种子培养基的500ml三角瓶中，于30℃以220rpm振荡培养8-9小时。然后，将5ml的每一种种子培养液接种入含有50ml下述发酵培养基的500ml挡板瓶中，于37℃以220rpm振荡培养42-46小时。间歇补加浓氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2之间，根据残糖情况，补加浓度为400g/L的葡萄糖母液，控制发酵液残糖在5-10g/L。

(2)3L发酵罐发酵：

将北京棒杆菌CP1008、CP1009、CP1010和AS1.563接种在含有100ml下述种子培养基的1000ml三角瓶中，于30℃以220rpm振荡培养8-9小时。然后，将每一种种子培养液接种入含有900ml下述发酵培养基的3L发酵罐中，于37℃、0.01MPa罐压培养42-46小时。采用的发酵罐为3L发酵罐：内置定速可编程控泵，可以实现恒速补料。发酵过程中通过蠕动泵补加600g/L的葡萄糖，控制发酵体系中葡糖糖的浓度为5～10g/L，通过加热套和冷却水控制发酵温度维持在30℃；通入空气提供溶氧，转速与溶氧信号级联控制溶氧维持在30％；补加浓氨水调控pH，维持在6.9左右。发酵连续进行52h。

种子培养基和发酵培养基如下所述：

种子培养基(pH7.0)

生产培养基(pH7.0)

葡萄糖40g、糖蜜20g、磷酸0.4g、硫酸铵15g、七水硫酸镁0.87g、生物素0.88mg、维生素B1 6.3mg、右旋泛酸钙6.3mg、烟酰胺42mg(溶于1升蒸馏水中)。

培养完成后，进行HPLC分析测定菌株生产的L-赖氨酸的含量。北京棒杆菌CP1008、CP1009、CP1010和AS1.563培养物中的L-赖氨酸浓度如表10所示。

表10

由上表可见，不论是在摇瓶水平还是在3L发酵罐水平，改造菌株之间均表现出了显著差异。

摇瓶发酵与发酵罐发酵呈现出的差异趋势保持一致。即，增强天冬酰胺酶基因表达之后，赖氨酸的产量有所增加。相应的，敲除该基因后，赖氨酸产量明显下降。

就发酵罐发酵产酸数据而言，CP1008与AS1.563相比，赖氨酸产量提高86.6％，CP1009与AS1.563相比，赖氨酸产量提高36.3％。而CP1010与AS1.563相比，赖氨酸产量下降29.5％。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 北京中科伊品生物科技有限公司

中国科学院微生物研究所

<120> 生产L-赖氨酸的重组菌、其构建方法以及L-赖氨酸的生产方法

<130> 170710CI

<141> 2017-11-01

<160> 57

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1638

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 1

ctgcgacagc atggaactca gtgcaatggc tgtaaggcct gcaccaacaa tgattgagcg 60

aagctccaaa atgtcctccc cgggttgata ttagatttca taaatatact aaaaatcttg 120

agagtttttc cgttgaaaac taaaaagctg ggaaggtgaa tcgaatttcg gggctttaaa 180

gcaaaaatga acagcttggt ctatagtggc taggtaccct ttttgttttg gacacatgta 240

gggtggccga aacaaagtaa taggacaaca acgctcgacc gcgattattt ttggagaatc 300

atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 360

attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 420

ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgcttct 480

gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 540

ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 600

cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 660

cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 720

tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 780

gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 840

gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 900

ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 960

gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 1020

ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 1080

aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 1140

cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 1200

aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 1260

ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1320

gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1380

ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1440

gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1500

gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1560

tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1620

cgcctcgaaa gggactaa 1638

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(26)

<223> hom-V59A上游正向引物

<400> 2

gctctagaag ctgtttcaca atttct 26

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<223> hom-V59A突变位点反向引物

<400> 3

atatcagaag cagcaatgc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<223> hom-V59A突变位点正向引物

<400> 4

gcattgctgc ttctgatat 19

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<223> hom-V59A下游反向引物

<400> 5

ccggaattcc caacaacttg atggtgt 27

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<223> hom-V59A正向鉴定引物

<400> 6

tctacgttgt atctcgcac 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(18)

<223> hom-V59A反向鉴定引物

<400> 7

caggcgacca gctgcttc 18

<210> 8

<211> 2280

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 8

aaaaccgatg tttgattggg ggaatcgggg gttacgatac taggacgcag tgactgctat 60

cacccttggc ggtctcttgt tgaaaggaat aattactcta gtgtcgactc acacatcttc 120

aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc ggcgaaatcg cggtccgtgc 180

tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct atttaccccc gtgaagatcg 240

gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc attggtaccg aaggctcacc 300

agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca gctaaaaaag ttaaagcaga 360

tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc cagcttgccc gcgagtgtgc 420

ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt cttgatctca ccggtgataa 480

gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca gttttggcgg aatccacccc 540

gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc cagacttacc ccatctttgt 600

gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt gttgcttcac ctgatgagct 660

tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg gctttcggcg atggcgcggt 720

atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa gtgcagatcc ttggcgatca 780

cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca ctgcagcgtc gtcaccaaaa 840

agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa ctgcgtgatc gcatttgtgc 900

ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc gcgggaaccg tggaattctt 960

ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac ccacgtatcc aggttgagca 1020

caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag gcgcagatgc gcttggctgc 1080

tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag atcaagaccc acggtgcagc 1140

actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc ttccgcccag ataccggaac 1200

tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt cttgacggtg cagctcagct 1260

cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg aaaatgacct gccgtggttc 1320

cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg gctgagttca ccgtgtctgg 1380

tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg gaagaggact tcacttccaa 1440

gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca ctcgcacctc cttcaggctc cacctgctga 1500

tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc accgtgaaca agcctcatgg 1560

tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg cctaacatca aggatctgcc 1620

actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc ccagccgcgt ttgctcgtga 1680

tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc ttccgcgatg cacaccagtc 1740

tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct gcggcagagg ccgtcgcaaa 1800

gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc gcgacctacg atgtggcgat 1860

gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag ctgcgcgagg cgatgccgaa 1920

tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg ggatacaccc cgtacccaga 1980

ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc ggcgtggaca tcttccgcat 2040

cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca atcgacgcag tcctggagac 2100

caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt gatctctctg atccaaatga 2160

aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag gagatcgtca agtctggcgc 2220

tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc ccagctgcgg taaccaagct 2280

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(28)

<223> pyc-P458S上游正向引物

<400> 9

cccaagcttt gactgctcac tgcagcgt 28

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(17)

<223> pyc-P458S突变位点反向引物

<400> 10

aggtgcgagt gatcggc 17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(17)

<223> pyc-P458S突变位点正向引物

<400> 11

gccgatcact cgcacct 17

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(26)

<223> pyc-P458S下游反向引物

<400> 12

gctctagagc gtcgattgct ggacgc 26

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<223> pyc-P458S正向鉴定引物

<400> 13

cgcaaattag caacagaag 19

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(18)

<223> pyc-P458S反向鉴定引物

<400> 14

ccttaatggc caagatgt 18

<210> 15

<211> 750

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 15

acctggccct cgatacctcg agtctggtgg cggctttgtc tgaagatatt tctggcgccg 60

gattaaatga cctgaaagtt ctcgacgtcg gcggcggacc cggatacttc gccgaagcct 120

ttgagacact gggcgccacc tacttctccg tcgaacccga cgttggcgaa atgtccgcag 180

ctggcatcga cgtccacgga tcagtccgcg gatccggcct cgacctgccg tttcttcccg 240

attcctttga cgtggtgtac tcctccaacg ttgcagaaca tgtctccgca ccgtgggaat 300

tgggagaaga aatgctccgc gtcacccgca gcggcggcct ggcaatcctg agctacacca 360

tttggttagg gcccttcggc ggccatgaaa ccggactgtg ggaacactac gttggcggag 420

aatttgcccg cgatcgctac acgaagaaac acgggcaccc gcctaagaac gttttcgggg 480

agtcactgtt taatgtgtcc tgccgggagg ggctggaatg gggagcctcc gtgggcaatg 540

cggaattggt tgccgctttt ccccgctacc acccgtattg ggtctggtgg atggttaaag 600

tcccagtgct ccgagaattc gcggtaagta acttggtgtt ggtgtttaaa aagcactgag 660

gttttgagga attcatcgct taacgacaag aaaggctccc actttcggtg ggagcctttc 720

ttgttattta gcagttctta agcgtgaact 750

<210> 16

<211> 767

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 16

tacttctcca gattttgtgt cattcgacag agttctcgcc ccctagcgta gctttcagat 60

acagaactag ttaaaacttt aggtgagaca acggacacat ttgtcattac cagtggacct 120

accccctgcc cacacgcatc tacacacttt ctttaatatg agagcacccg tttaaatagc 180

ctattttggg ggtggtttca agaattaacc tcaaccgttc tccgacagtt cattccccgt 240

ccatggccat tgggttcaga tttgggcaat tctcacacat tccaggggac aactttccca 300

gttttcccac cattaacact taacattcgg acaataggca acaaaacgcc aagaacagcg 360

gtaatggtaa tccctttccc ttaccctgcc atcacaatcc aagcactccg ctagtggccg 420

accagcacaa accggcccac tgtcagtaca caccttttta aaacaacatt tacactcaca 480

tgcatgcccg cactgtcacc acccgccctc aactaccgaa ctaaagatat gtacttgaag 540

ccaaattttt accctagatc ccccttttaa atactttgaa aattactcac acacatcccc 600

acgttacccc aaaggttata tccagttagt cgtatcaaaa agtgctctga tcttaacttt 660

gccctaccta aatacatgac cccaccacga cggccagtac taacgacaga atccactagc 720

gaacccattt attaacaaac attgcaaaca agtgttgaag tattcgc 767

<210> 17

<211> 960

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 17

gctcctttta aaaaattcca cccgctgctg aaatgagcct ttacaggcct aggtaatgct 60

caagtcctac gactaggcct gggtgctgtg caatgttgcg cacacccacc aagacacctg 120

gtgcaaatga gttgcgatca taggagtcct gcttgatggt caaggtctga ccctgggtgc 180

caaagataac ttgctcgtga gcaaccatgc cggacatgcg gactgcatga accgggattc 240

catctacgct tgcgccacgg gaaccctcaa gtgcctgctc ggtcgcatct ggctgtgcgt 300

ccatgcctgc ttctttgcgt gccgcagcaa tgccctgagc agtgtggatc gcggtgcctg 360

aaggtgcatc cagcttgttg gggtggtgca gctcaataac ttcagctgat tcgaagaagc 420

gggcagcctg cttggaaaag accatggtca acaccgcaga gatagcaaag ttaggtgcga 480

tcagaacacc gacattgtct tttccttcaa gccagtcgcg aacctgctcc aaacgagcat 540

catcgaagcc cgtggttcca acaaccgcag aaatgccgtt gttgatgcag aactccaggt 600

tgcccatcac agcgttagga gtggtgaagt caacgacaac ttcagcgccg ttgtctacca 660

gaaggctcaa atcatcgtcg acgccgatct ctgcaacaag ctccagatcg tcggactcat 720

tgactgctgc cacaatagtt tgaccaacac ggcctttggc tccgagaacg ccaaccttga 780

ttcccattat gctccttcat tttcgtgggg cgaagagttt ttcaaacgcc caccagtcta 840

gacgtacccg ttcagaaggt gctgatatcc atacctaact gaccgttttg gtctgtgttg 900

ttaacgattg ttcatcagtt tgttccgttc tagggattaa tcacacaggt ggaactatgt 960

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(49)

<223> pck上游同源臂正向引物

<400> 18

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt acctggccct cgatacctc 49

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(41)

<223> pck上游同源臂反向引物

<400> 19

cctaggcctg taaagttcac gcttaagaac tgctaaataa c 41

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> pyc启动子正向引物

<400> 20

tgtgagtcga cattagagta attattcctt tcaacaagag 40

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(34)

<223> pyc启动子反向引物

<400> 21

atctggagaa gtatgcgtta aacttggcca aatg 34

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(32)

<223> pyc*正向引物

<400> 22

tccgttctag ggattaggaa acgacgacga tc 32

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(36)

<223> pyc*反向引物

<400> 23

aggaataatt actctaatgt cgactcacac atcttc 36

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(31)

<223> dapB正向引物

<400> 24

ttaagcgtga actttacagg cctaggtaat g 31

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(36)

<223> dapB反向引物

<400> 25

tcgtcgtcgt ttcctaatcc ctagaacgga acaaac 36

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(32)

<223> pck下游同源臂正向引物

<400> 26

caagtttaac gcatacttct ccagattttg tg 32

<210> 27

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(49)

<223> pck下游同源臂反向引物

<400> 27

cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt gcgaatactt caacacttg 49

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> pyc*-dapB鉴定正向引物

<400> 28

taccttgggc aggtcgtggg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> pyc*-dapB鉴定反向引物

<400> 29

tgggagcgtt gtgcgctcga 20

<210> 30

<211> 1266

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 30

atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60

aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120

tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180

ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240

gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300

ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360

gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420

aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480

ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540

accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600

atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660

cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720

attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780

gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840

aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900

tcttctgtag aagacggcac caccgacatc atcttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960

cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020

gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080

accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140

tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200

ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260

cgctaa 1266

<210> 31

<211> 963

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 31

atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtgggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60

cttattgcca agcagcccga catggacctt gtaggaatct tctcgcgccg ggccaccctc 120

gacacaaaga cgccagtctt tgatgtcgcc gacgtggaca agcacgccga cgacgtggac 180

gtgctgttcc tgtgcatggg ctccgccacc gacatccctg agcaggcacc aaagttcgcg 240

cagttcgcct gcaccgtaga cacctacgac aaccaccgcg acatcccacg ccaccgccag 300

gtcatgaacg aagccgccac cgcagccggc aacgttgcac tggtctctac cggctgggat 360

ccaggaatgt tctccatcaa ccgcgtctac gcagcggcag tcttagccga gcaccagcag 420

cacaccttct ggggcccagg tttgtcacag ggccactccg atgctttgcg acgcatccct 480

ggcgttcaaa aggcagtcca gtacaccctc ccatccgaag acgccctgga aaaggcccgc 540

cgcggcgaag ccggcgacct taccggaaag caaacccaca agcgccaatg cttcgtggtt 600

gccgacgcgg ccgatcacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc tgattacttc 660

gttggctacg aagtcgaagt caacttcatc gacgaagcaa ccttcgactc cgagcacacc 720

ggcatgccac acggtggcca cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780

gtggaataca tcctcaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcctc acagatcgct 840

ttcggtcgcg cagctcaccg catgaagcag cagggccaaa gcggagcttt caccgtcctc 900

gaagttgctc catacctgct ctccccagag aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc 960

taa 963

<210> 32

<211> 1338

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 32

atggctacag ttgaaaattt caatgaactt cccgcacacg tatggccacg caatgccgtg 60

cgccaagaag acggcgttgt caccgtcgct ggtgtgcctc tgcctgacct cgctgaagaa 120

tacggaaccc cactgttcgt agtcgacgag gacgatttcc gttcccgctg tcgcgacatg 180

gctaccgcat tcggtggacc aggcaatgtg cactacgcat ctaaagcgtt cctgaccaag 240

accattgcac gttgggttga tgaagagggg ctggcactgg acattgcatc catcaacgaa 300

ctgggcattg ccctggccgc tggtttcccc gccagccgta tcaccgcgca cggcaacaac 360

aaaggcgtag agttcctgcg cgcgttggtt caaaacggtg tgggacacgt ggtgctggac 420

tccgcacagg aactagaact gttggattac gttgccgctg gtgaaggcaa gattcaggac 480

gtgttgatcc gcgtaaagcc aggcatcgaa gcacacaccc acgagttcat cgccactagc 540

cacgaagacc agaagttcgg attctccctg gcatccggtt ccgcattcga agcagcaaaa 600

gccgccaaca acgcagaaaa cctgaacctg gttggcctgc actgccacgt tggttcccag 660

gtgttcgacg ccgaaggctt caagctggca gcagaacgcg tgttgggcct gtactcacag 720

atccacagcg aactgggcgt tgcccttcct gaactggatc tcggtggcgg atacggcatt 780

gcctataccg cagctgaaga accactcaac gtcgcagaag ttgcctccga cctgctcacc 840

gcagtcggaa aaatggcagc ggaactaggc atcgacgcac caaccgtgct tgttgagccc 900

ggccgcgcta tcgcaggccc ctccaccgtg accatctacg aagtcggcac caccaaagac 960

gtccacgtag acgacgacaa aacccgccgt tacatcgccg tggacggagg catgtccgac 1020

aacatccgcc cagcactcta cggctccgaa tacgacgccc gcgtagtatc ccgcttcgcc 1080

gaaggagacc cagtaagcac ccgcatcgtg ggctcccact gcgaatccgg cgatatcctg 1140

atcaacgatg aaatctaccc atctgacatc accagcggcg acttccttgc actcgcagcc 1200

accggcgcat actgctacgc catgagctcc cgctacaacg ccttcacacg gcccgccgtc 1260

gtgtccgtcc gcgctggcag ctcccgcctc atgctgcgcc gcgaaacgct cgacgacatc 1320

ctctcactag aggcataa 1338

<210> 33

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(58)

<223> lysC正向引物

<400> 33

caggtcgact ctagaggatc cccgggaaag gaggacaacc atggccctgg tcgtacag 58

<210> 34

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(53)

<223> lysC反向引物

<400> 34

caccgacatc atcttcacct gcgttgtcct cctttttagc gtccggtgcc tgc 53

<210> 35

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(43)

<223> ddh正向引物

<400> 35

caccggacgc taaaaaggag gacaaccatg accaacatcc gcg 43

<210> 36

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(32)

<223> ddh反向引物

<400> 36

gttgtcctcc tttttagacg tcgcgtgcga tc 32

<210> 37

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(45)

<223> lysA正向引物

<400> 37

acgcgacgtc taaaaaggag gacaaccatg gctacagttg aaaat 45

<210> 38

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(49)

<223> lysA反向引物

<400> 38

ctcatccgcc aaaacagcca agctgaattc ttatgcctct agtgagagg 49

<210> 39

<211> 978

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 39

atgtcgaagc agcactccac accattaaac aatgatgaag aacacacttc cgctcctcaa 60

aaggttgcgg taatcaccac gggcggaacc atcgcctgta cttccgacgc aaatgggcat 120

ctgcttccca ccgtcagcgg tgcagacctg cttgcgccaa tcgcaccacg gttcaatgga 180

gcgcagatcg ctttcgaaat ccacgaaatc aaccgccttg attcctcctc catgacgttt 240

gaggatctcg attccatcat cgccacggtt cataaggtgt tggaggatcc ggatgttgtt 300

ggcgtagtag ttacccacgg caccgattcc atggaagagt ccgccatcgc cgtagacacc 360

ttccttgatg atccccgccc agtcattttc accggcgccc aaaaaccctt cgatcatccc 420

gaagccgacg gcccaaacaa ccttttcgaa gcctgcctca tcgcatccga cccctccgct 480

cgcggaattg gtgcactcat tgtcttcggt cacgccgtca tccctgctcg cggctgcgtt 540

aaatggcaca cctctgatga gctggcgttt gcaaccaacg gccctgaaga accagagcgc 600

cccgatgcgc tgcccgtagc taaattggcg gatgtctctg tcgaaatcat ccccgcatac 660

cctggtgcca ccggcgcaat ggtggaagct gccatcgctg ccggtgctca aggacttgta 720

gtggaagcaa tgggatcagg caatgttggt tcccgcatgg gtgatgccct aggtaaagca 780

cttgacgctg gaattcccgt ggtgatgagc actagggttc ctcgtggtga agtatccgga 840

gtgtatggcg gtgcaggtgg aggtgcgact ttggctgcga agggcgctgt gggatctcgc 900

tacttcagag ctggtcaggc acgtattttg ctcgcgattg ccattgcgac gggcgcacat 960

ccggtgacgc tttactaa 978

<210> 40

<211> 200

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 40

tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60

ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120

aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180

gaagtccagg aggacataca 200

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<223> 插入Ptuf上游同源臂正向引物

<400> 41

ccggaattct gctcaggagc aacagtatt 29

<210> 42

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> 插入Ptuf上游同源臂反向引物

<400> 42

cattcgcagg gtaacggcca gcgctctagc gtatcaacta 40

<210> 43

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> Ptuf正向引物

<400> 43

tagttgatac gctagagcgc tggccgttac cctgcgaatg 40

<210> 44

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> Ptuf反向引物

<400> 44

gtggagtgct gcttcgacat tgtatgtcct cctggacttc 40

<210> 45

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> 插入Ptuf下游同源臂正向引物

<400> 45

gaagtccagg aggacataca atgtcgaagc agcactccac 40

<210> 46

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<223> 插入Ptuf下游同源臂反向引物

<400> 46

tgctctagac agcgatggca gcttccacc 29

<210> 47

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<223> 增加ncgl2026拷贝上游同源臂正向引物

<400> 47

tgctctagaa agggcaatga gtttgtcga 29

<210> 48

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> 增加ncgl2026拷贝上游同源臂反向引物

<400> 48

gtggagtgct gcttcgacat ttagttctcc aagtagagcc 40

<210> 49

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> ncgl2026正向引物

<400> 49

ggctctactt ggagaactaa atgtcgaagc agcactccac 40

<210> 50

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(39)

<223> ncgl2026反向引物

<400> 50

tatcagacga gatcttggat tagtaaagcg tcaccggat 39

<210> 51

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(39)

<223> 增加ncgl2026拷贝下游同源臂正向引物

<400> 51

atccggtgac gctttactaa tccaagatct cgtctgata 39

<210> 52

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<223> 增加ncgl2026拷贝下游同源臂反向引物

<400> 52

ctagctagcg tgtggatccg agcgcgaag 29

<210> 53

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<223> ncgl2026敲除上游同源臂正向引物

<400> 53

ccggaattct gctcaggagc aacagtatt 29

<210> 54

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> ncgl2026敲除上游同源臂反向引物

<400> 54

atgcaagacc aagggcgaaa gcgctctagc gtatcaacta 40

<210> 55

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> ncgl2026敲除下游同源臂正向引物

<400> 55

tagttgatac gctagagcgc tttcgccctt ggtcttgcat 40

<210> 56

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<223> ncgl2026敲除下游同源臂反向引物

<400> 56

ctagctagct tatgaggtag gcgtgcaat 29

<210> 57

<211> 244

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)

<400> 57

tgcgttaaac ttggccaaat gtggcaacct ttgcaaggtg aaaaactggg gcggggttag 60

atcctggggg gtttatttca ttcactttgg cttgaagtcg tgcaggtcag gggagtgttg 120

cccgaaaaca ttgagaggaa aacaaaaacc gatgtttgat tgggggaatc gtgtggtata 180

atggtaggac gcagtgactg ctatcaccct tggcggtctc ttgttgaaag gaataattac 240

tcta 244

Claims

1.一种生产L-赖氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有提高的天冬酰胺酶的表达和/或活性，所述出发菌为能够积累赖氨酸的菌株。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌具有至少两个拷贝的天冬酰胺酶编码基因，和/或所述重组菌的天冬酰胺酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导；

优选地，所述调控元件为强启动子；

更优选地，所述强启动子为P_tuf启动子。

3.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有降低的高丝氨酸脱氢酶的表达和/或活性，

优选地，所述降低高丝氨酸脱氢酶表达通过如下至少一种方式实现：(A)所述重组菌的高丝氨酸脱氢酶编码基因失活，(B)所述重组菌的高丝氨酸脱氢酶编码基因的表达以低转录或低表达活性的调控元件介导；

所述降低高丝氨酸脱氢酶的活性通过如下方式实现：所述重组菌的高丝氨酸脱氢酶的第59位缬氨酸突变为丙氨酸，所述重组菌的高丝氨酸脱氢酶编码基因优选如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有提高的丙酮酸羧化酶的表达和/或活性；

优选地，所述提高丙酮酸羧化酶表达通过如下至少一种方式实现：(C)所述重组菌具有至少两个拷贝的丙酮酸羧化酶编码基因，(D)所述重组菌的丙酮酸羧化酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导；

所述提高丙酮酸羧化酶活性通过如下方式实现：所述重组菌的丙酮酸羧化酶的第458位脯氨酸突变为丝氨酸，所述重组菌的丙酮酸羧化酶编码基因优选如SEQ ID NO.8所示。

5.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有降低的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的表达和/或活性；

优选地，所述重组菌的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因失活，和/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因的表达以低转录或低表达活性的调控元件介导；

更优选地，所述失活为敲除所述重组菌的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因。

6.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有提高的二氢吡啶二羧酸还原酶的表达和/或活性；

优选地，所述重组菌具有至少两个拷贝的二氢吡啶二羧酸还原酶编码基因，和/或二氢吡啶二羧酸还原酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导；

更优选地，所述调控元件为强启动子；

最优选地，所述强启动子为所述出发菌的P_tuf启动子。

7.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有提高的天门冬氨酸激酶、二氨基庚二酸脱氢酶和/或二氨基庚酸脱羧酶的表达和/或活性；

优选地，所述重组菌具有至少两个拷贝的天门冬氨酸激酶编码基因、二氨基庚二酸脱氢酶编码基因和/或二氨基庚酸脱羧酶编码基因，和/或天门冬氨酸激酶编码基因、二氨基庚二酸脱氢酶编码基因和/或二氨基庚酸脱羧酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导；

更优选地，所述调控元件为强启动子；

最优选地，所述强启动子为所述出发菌的P_tuf启动子。

8.根据权利要求1-7任一项所述重组菌，其特征在于，所述出发菌为选自棒杆菌属、短杆菌属、芽胞杆菌属、双歧杆菌属和乳杆菌属中的一株细菌或选自酵母中的一株真菌，

优选地，所述棒杆菌属的细菌选自谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum、北京棒杆菌Corynebacterium pekinense、有效棒杆菌Corynebacterium efficiens、钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum、嗜热产氨棒杆菌Corynebacterium thermoaminogenes、产氨棒杆菌Corynebacterium aminogenes、百合棒杆菌Corynebacterium lilium、美棒杆菌Corynebacterium callunae和力士棒杆菌Corynebacterium herculis中的一株细菌；

所述短杆菌属的细菌选自黄色短杆菌Brevibacteriaceae flvum、乳酸发酵短杆菌Brevibacteriaceae lactofermentum和产氨短杆菌Brevibacteriaceae ammoniagenes中的一株细菌；

所述芽胞杆菌属的细菌选自地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis和短小芽胞杆菌Bacillus pumilus中的一株细菌；

所述双歧杆菌属的细菌选自地两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、长双歧杆菌Bifidobacterium longum、短双歧杆菌Bifidobacterium breve和青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis中的一株细菌；

所述乳杆菌属的细菌选自嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、德式乳杆菌乳酸亚种Lactobacillus delbrueckii subsp和发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum中的一株细菌；

9.一种权利要求1-8任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

提高所述出发菌中天冬酰胺酶的表达和/或活性；

优选地，提高所述出发菌中天冬酰胺酶的表达和/或活性通过如下至少一种方式实现：(E)增加所述出发菌中天冬酰胺酶编码基因的拷贝数，(F)将所述出发菌中的天冬酰胺酶编码基因的调控元件替换为高转录或高表达活性的调控元件。

10.一种L-赖氨酸的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵培养权利要求1-8任一项所述的重组菌。