CN113755492A - 丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用。所述突变体比野生型启动子具有提高的启动子活性。由此可以用于增强目的基因表达，例如将其与丙酮酸羧化酶基因可操作地连接，增强了丙酮酸羧化酶的表达强度，由此提高了菌株的氨基酸生产效率。

Description

丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其生物氨基酸中的应用。
背景技术：
氨基酸，包括赖氨酸、苏氨酸、谷氨酸等是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，被广泛应用于医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中，主要采用微生物发酵法来生产，目前，主要的生产菌株包括肠杆菌属、棒杆菌属等的微生物，而由于棒杆菌的生理优越性，棒杆菌已成为工业中最重要的生产菌株。随着生物技术的不断发展，对棒杆菌进行代谢工程改造来提高其氨基酸产量的报道逐渐增多，这些改造包括加强氨基酸合成途径相关酶的表达，减弱竞争性途径相关酶的表达等等。
丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase，由pyc基因编码)，被认为是棒杆菌回补途径中发挥重要作用的酶，该酶能够催化丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸，从而进入TCA循环。已有大量的文献报道，过表达丙酮酸羧化酶可以增加菌株的氨基酸(如赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸等)产量，如CN110603321A，CN1275167A。而目前pyc基因的过表达大多是通过增加其拷贝数而实现的，然而拷贝数增加可能导致菌株的基因组不稳定，而启动子对基因的表达调控不存在以上缺陷，而且高性能的启动子还可于表达不同的目标基因。因此，本领域需要开发丰富的启动子元件，以便适度增强pyc等基因的表达，从而提高菌株目标化合物的生产效率。
发明内容：
针对上述现有技术的不足和需求，本发明人研究寻找具有增强活性的相关启动子而完成本发明。
第一方面，本发明提供一种丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其在对应于SEQID NO.21所示核苷酸序列的启动子的第279位至第317位的核心区存在突变，并且突变后的启动子活性增强至少1.8倍，优选3倍，5倍，8倍，优选10倍，11倍，12倍，13倍，更优选14倍，15倍，16倍以上。
进一步优选地，所述突变体的启动子核心区的核苷酸序列为如下序列之一：
1)CTAATTTTGATTCGTACTGATTTCTGCTACGATGAGTCA；
2)GGATTGTTGATTTGAGCTTGATGAGCGTACAATCAACTT；
3)TTCTCCTTGATTGCGCCTTAACCGTGGTATGATTCGATA；
4)ATTGATTTGATTGGAACCTTACTGTGCTATGATTTGGTA；
5)TCGAGTTTGATTTCACAACGTGTGTGATAGGATATAATA；
6)TTGCGTTTGATTAAAGTATGCAAGGGCTAGTATGGTGAT；
7)ATCATTTTGATTCCGGCGCACATGTGGTAATATGGTATT；
8)TCGCCATTGATTGCCCGCCATCCATGCTATAATCGGAAG；
9)TTCCGCTTGATTGTGGCCATAGTATGATATTATTAATTA；
10)CGGATCTTGATTTTATGATGGGTATTGTATAATCTTGGT；
11)CGGATATTGATTTGGCCGGTGTTGTGGTAGTATCGTGTT；
12)AGGGGTTTGATTGGCCGCTCGGTGTGTTATCATGGAGAG；
13)GAGTTGTTGATTTCGTTGGTGCACGTATACAATGGTTTT；
14)CTTGGCTTGATTTTTGTTTGAGGGTTGTATAATGTTATT；
15)GACTAGTTGATTTCCGCCCTTGGTTGATATTATGCTTGA；
16)ATCCGCTTGATTTAGGCGTACGTTTAATAGTATATTGAA；
17)CGGGGCTTGATTTCCTTGTCGTGGCGTTATTATAATGGA；
18)ATGGAGTTGATTATACGATACTACAGATACTATACTGGT；
19)CCGTAGTTGATTGACTTGGGCAGTATATAGTATAATGAA；或
20)CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG。
更进一步地，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：20任一项所示。
其中丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体是具有启动子活性的核苷酸分子，并相对于野生型的启动子具有增强的活性。所述“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目的基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目的基因的转录。
所述编码丙酮酸羧化酶的基因为pyc基因，被认为是棒杆菌回补途径中发挥重要作用的酶，该酶能够催化丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸，这是三羧酸循环的一个重要回补途径。已有大量的文献报道，过表达丙酮酸羧化酶Pyc可以增加菌株的氨基酸(如赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸等)产量。
所述“启动子核心区”是指原核生物中位于启动子上的一段核酸序列，是发挥启动子功能的核心序列区，主要包括-35区、-10区、-35区和-10区之间的区域以及转录起始位点，-35区是RNA聚合酶的识别位点，-10区是RNA聚合酶的结合位点。
本发明的启动子的突变体是改进的谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶基因的启动子，它比野生型启动子具有更高的启动子活性，如提高至少1.8倍，3倍，5倍，8倍，优选10倍，11倍，12倍，13倍，更优选14倍，15倍，16倍以上。本发明的启动子核酸分子可以使用标准的分子生物学技术分离或制备。例如，可以使用合适的引物序列通过PCR来分离本发明的启动子核酸分子。此外，也可以使用自动DNA合成仪通过标准合成技术来制备本发明的启动子核酸分子。
本发明的具有启动子活性的核酸分子可以被用作棒杆菌或肠杆菌中其他基因的表达，包括但不限于氨基酸合成相关的基因，如天冬氨酸激酶LysC、苏氨酸操纵子ThrABC、天冬氨酸半醛脱氢酶Asd、天冬氨酸氨裂合酶AspB、高丝氨酸脱氢酶Hom、高丝氨酸O-乙酰基转移酶MetX、二氢吡啶二羧酸合成酶DapA、二氢吡啶甲酸还原酶DapB、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶Ddh、谷氨酸激酶ProB、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA、5-氨基乙酰丙酸合成酶HemA等等。
本发明所述的系列强度启动子元件，可用于适度调控目标基因的表达，实现目标产物的高效生产。
本发明所使用的术语“棒杆菌”是指棒杆菌属的微生物，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生氨基酸的突变体或菌株。
第二方面，本发明提供了包含所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的表达盒、重组载体。
所述“表达盒”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即含有启动子、目的基因并且能够将目的基因进行表达的元件。
术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。本发明所使用的载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。即所述载体包括但不限于质粒，噬菌体，例如本发明具体实施例中使用的pEC-XK99E质粒。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。
第三方面，本发明提供了含有所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的重组宿主细胞。
重组宿主细胞具体例如通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本发明所述“宿主细胞”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株。
在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
第四方面，本发明提供了一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与目的基因可操作地链接，优选地增强以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关基因的表达。
本发明中的术语“可操作地连接”是指本发明的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与编码基因功能性连接，以启动和介导所述基因的转录，表明本发明的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与编码基因可操作地连接以控制操纵子基因的转录活性。所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。本发明所述的增强目的基因表达的方法中，利用本发明的所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法实现。
第五方面，本发明提供了一种以草酰乙酸为前体的目标产物的生产方法，所述方法包括培养含有所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关的基因可操作地连接的宿主细胞，并收集产生的目标产物。其中，以草酰乙酸为前体的目标产物包括但不限于氨基酸及其衍生物，所述氨基酸包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)，以及5-氨基乙酰丙酸等，所述衍生物包括但不限于戊二胺、戊二酸等。通过本发明的方法，可以提高菌株的以草酰乙酸为前体的目标产物的产量。更具体的，以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关的基因选自pyc基因，lysC基因、thrABC基因、asd基因、aspB基因、hom基因、metX基因、dapA基因、dapB基因、ddh基因、proB基因、proA基因、proC基因、putA基因、hemA基因等。
在一个具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌经过下述改良，所述谷氨酸棒杆菌中的天冬氨酸激酶编码基因引入了T311I突变编码序列，并且导入与上述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体可操作连接的编码丙酮酸羧化酶的基因，获得赖氨酸生产菌株；或导入与本发明所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体可操作连接地引入有G149K突变的谷氨酸激酶、谷氨酸-5-半醛脱氢酶，和/或吡咯-5-羧酸脱氢酶的表达盒整合至脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶基因上，获得脯氨酸生产菌株；优选地，所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的核心区序列为CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG，更优选地，其全长启动子的序列如SEQ ID NO：20所示。
本发明所述的生产以草酰乙酸为前体的目标产物的方法中，利用本发明的所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法，同时也包括从细胞或培养液中回收目标产物的步骤。从细胞或培养基中回收目标产物的方法是本领域公知的，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC。
本发明的有益效果：本发明提供的具有增强的启动子活性的核酸分子表现出比野生型更高的启动子活性，可以用于目标基因的表达，尤其是与氨基酸生产相关基因的表达，例如与pyc基因可操作地连接，可以增强丙酮酸羧化酶的表达强度，由此提高了重组菌株的氨基酸生产效率，具有较高的应用价值。
附图说明
图1：pEC-XK99E-Ppyc-rfp质粒的质粒图谱。
图2：pyc启动子突变体的荧光筛选平板。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1.谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子强度表征质粒的构建
为了表征谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子的强度，本发明首先构建一个表征载体，在pEC-XK99E质粒骨架基础上，由pyc基因启动子表达pyc基因N端60个氨基酸、一个连接肽和红色荧光蛋白基因。根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列及pyc基因注释信息，设计引物pyc-F/R，以ATCC13032基因组为模板，通过PCR扩增获得pyc基因启动子和N端180bp的DNA片段。以文献报道的pEC-XK99E-rfp(王迎春等.基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子[J].生物工程学报,2018,34(11)：1760～1771)质粒为模板，以pEC-F/R引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架、连接肽和红色荧光蛋白基因的DNA片段。以上两个片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pEC-XK99E-Ppyc-rfp表征载体，质粒图谱如图1所示。以上所用引物序列如表1所示。
表1
Figure BDA0002591483710000061
实施例2.谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体筛选及强度表征
(1)谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体文库的构建
本发明对谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子的核心区：
“CGATGTTTGATTGGGGGAATCGGGGGTTACGATACTAGG”进行突变，其中下划线处分别为该启动子的-35区和-10区主要序列。本发明在以上核心区对应位置进行突变“NNNNNNTTGA TTNNNNNNNNNNNNNNNTANNATNNNNNN”，分别采用pyc-M1/M2和pyc-M3/M4引物扩增质粒的两个片段，通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，对获得的所有克隆菌进行收集并提取质粒，获得pyc基因启动子突变体文库。将以上文库和实施例1中获得野生型对照pEC-XK99E-Ppyc-rfp转化分别转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032，涂布TSB平板，通过荧光成像系统对长有数百个克隆的平板进行荧光拍照，根据克隆的荧光亮度初步筛选表达强度提高的突变体。TSB平板培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L；琼脂粉，15g/L。本发明对大于1万个克隆进行初步平板筛选，如图2所示，获得约30个荧光强度增强的突变体。以上所用引物序列如表2所示。
表2
Figure BDA0002591483710000071
(2)谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体文库筛选
对以上平板观察荧光强度增强的所有突变体进行96孔板培养表征启动子的强度，TSB液体培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L。将平板获得的菌株用牙签接种至每孔含有200μl TSB液体培养基的96孔板中，每个菌株3个平行，孔板摇床转速为800rpm，30℃培养24h后检测菌株的荧光强度，并对荧光强度较野生型对照提高的菌株进行测序。结果如表3所示，部分启动子突变体序列相同，最终本发明成功获得20个表达强度较野生型启动子提高的不同启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列编为SEQ ID NO：1至20)，提高倍数范围为1.8-16.1倍，可为改造pyc等基因的表达提供丰富的元件。
表3
Figure BDA0002591483710000072
Figure BDA0002591483710000081
实施例3.谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体应用于目标产物生产
(1)谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体的重组载体构建
根据已报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别以ATCC13032基因组为模板，以pyc-UF/pyc-UR1和pyc-DF1/pyc-DR，pyc-UF/pyc-UR9和pyc-DF9/pyc-DR，pyc-UF/pyc-UR16和pyc-DF16/pyc-DR，pyc-UF/pyc-UR20和pyc-DF20/pyc-DR为引物，PCR扩增Ppyc-1、Ppyc-9、Ppyc-16和Ppyc-20启动子突变的上下游同源臂；同时以pK18-1/2引物扩增pK18mobsacB的骨架。上述PCR片段回收后，通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，分别获得启动子突变的重组载体pK18-Ppyc-1、pK18-Ppyc-9、pK18-Ppyc-16和pK18-Ppyc-20。以上所用引物序列如表4所示。
表4
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO.
pyc-UF CAGGAAACAGCTATGACATGGTATCGCCATGTATCACGCACTC SEQ ID NO：30
pyc-UR1 TCAGTACGAATCAAAATTAGGTTTTTGTTTTCCTCTCAATGTTTTC SEQ ID NO：31
pyc-UR9 ATGGCCACAATCAAGCGGAAGTTTTTGTTTTCCTCTCAATGTTTTC SEQ ID NO：32
pyc-UR16 TACGCCTAAATCAAGCGGATGTTTTTGTTTTCCTCTCAATGTTTTC SEQ ID NO：33
pyc-UR20 TATCTTACAATCAAGGCCCGGTTTTTGTTTTCCTCTCAATGTTTTC SEQ ID NO：34
pyc-DF1 CTAATTTTGATTCGTACTGATTTCTGCTACGATGAGTCAACGCAGTGACTGCTATCACCC SEQ ID NO：35
pyc-DF9 TTCCGCTTGATTGTGGCCATAGTATGATATTATTAATTAACGCAGTGACTGCTATCACCC SEQ ID NO：36
pyc-DF16 ATCCGCTTGATTTAGGCGTACGTTTAATAGTATATTGAAACGCAGTGACTGCTATCACCC SEQ ID NO：37
pyc-DF20 CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAGACGCAGTGACTGCTATCACCC SEQ ID NO：38
pyc-DR TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTAATTTGCGAAGCTCATCAGGTG SEQ ID NO：39
pK18-1 GCACTGGCCGTCGTTTTAC SEQ ID NO：40
pK18-2 CATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG SEQ ID NO：41
(2)谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌的pyc基因启动子突变体构建
将上述构建的重组载体pK18-Ppyc-1、pK18-Ppyc-9、pK18-Ppyc-16和pK18-Ppyc-20分别转化谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌SCgL30(该菌株中谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的天冬氨酸激酶的第311位Thr突变为Ile的菌株，参见申请号为202010042203.2)，涂布含有5g/L葡萄糖和25μg/mL卡那霉素的LBHIS固体培养基上，30℃培养获得第一次重组的转化子。正确的一次重组转化子分别接种含有5g/L葡萄糖的LB培养基，过夜培养，然后1％转接含有100g/L蔗糖的LB培养基，30℃培养过夜后分别涂布添加100g/L蔗糖的LB固体培养基平板进行筛选，并通过测序确认，分别获得的pyc启动子突变的菌株SCgL33、SCgL34、SCgL35和SCgL36。
(3)谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌pyc基因启动子突变体的赖氨酸生产能力评价
为了测试谷氨酸棒杆菌中pyc启动子突变对菌株产赖氨酸的影响，分别对SCgL30、SCgL33、SCgL34、SCgL35和SCgL36进行发酵测试，发酵培养基成份为：葡萄糖，80g/L；酵母粉，1g/L；大豆蛋白胨，1g/L；NaCl，1g/L；硫酸铵，1g/L；尿素，8g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.45g/L；FeSO4·7H2O，0.05g/L；生物素，0.4mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，40g/L；初始pH7.2。首先将菌株接种到TSB液体培养基中培养8h，培养物作为种子接种到每孔含有800μl发酵培养基的24孔板中，初始OD600控制为0.1，30℃培养20h，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测赖氨酸产量。结果如表5所示，pyc启动子突变后菌株的赖氨酸产量均有提高，而且随着启动子强度的增强而提高的更加显著。
表5
菌株 赖氨酸产量(g/L)
SCgL30 1.67±0.03
SCgL33 1.77±0.04
SCgL34 2.07±0.06
SCgL35 2.37±0.15
SCgL36 3.27±0.15
实施例4.谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体应用于脯氨酸生产
(1)Ppyc-20应用于脯氨酸生产的菌株构建
本发明将谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株引入G149K突变，密码子从GGT突变为AAG，获得SLCgP1菌株。本发明进一步应用将Ppyc-20启动子过表达解除反馈抑制的谷氨酸激酶proBG149K、谷氨酸-5-半醛脱氢酶proA和吡咯-5-羧酸脱氢酶proC的表达盒整合至脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶putA基因上，获得脯氨酸生产菌SLCgP2菌株。
SLCgP2菌株具体构建如下：1)首先在pEC-XK99E质粒上构建Ppyc-20启动子表达proBG149K、proA和proC的表达盒。以SCgL36菌株基因组为模板，以pyc-a/b为引物，扩增Ppyc-20启动子片段；以SLCgP1菌株基因组为模板，分别以proB-1/2、proA-1/2和proC-1/2为引物扩增proBG149K、proA和proC的片段；同时以pEC-1/2引物扩增pEC-XK99E的骨架。以上5个片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pEC-proBG149KproAproC质粒。2)构建将以上表达框在putA基因上插入染色体的重组载体。以SCgL36菌株基因组为模板，分别以putA-1/2和putA-3/4引物扩增putA基因上插入的上下游同源臂；以pEC-proBG149KproAproC质粒为模板，以ABC-F/R为引物扩增表达框片段；同时以pK18-1/2引物扩增pK18mobsacB的骨架。上述PCR片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pK18-proBG149KproAproC重组载体。3)pK18-proBG149KproAproC重组载体转化SLCgP1菌株，涂布含有5g/L葡萄糖和25μg/mL卡那霉素的LBHIS固体培养基上，30℃培养获得第一次重组的转化子。正确的一次重组转化子分别接种含有5g/L葡萄糖的LB培养基，过夜培养，然后1％转接含有100g/L蔗糖的LB培养基，30℃培养过夜后分别涂布添加100g/L蔗糖的LB固体培养基平板进行筛选，通用特异引物PCR及测序确认正确突变体，获得SLCgP2菌株。以上所用引物序列如表6所示。
表6
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO.
pEC-1 GGAGAAAATACCGCATCAGGC SEQ ID NO：42
pEC-2 CTGTTTTGGCGGATGAGAGAAG SEQ ID NO：43
pyc-a CCTGATGCGGTATTTTCTCCGAAAACCCAGGATTGCTTTGTG SEQ ID NO：44
pyc-b TTGGAGATGCGCTCACGCATTAGAGTAATTATTCCTTTCAACAAGAG SEQ ID NO：45
proB-1 ATGCGTGAGCGCATCTCCAAC SEQ ID NO：46
proB-2 TTACGCGCGGCTGGCGTAGTTG SEQ ID NO：47
proA-1 ACTACGCCAGCCGCGCGTAAGCCTTTTATGGTGTGATCCGAC SEQ ID NO：48
proA-2 TTAAGGCCTAATTTGTCCTGTGCC SEQ ID NO：49
proC-1 CAGGACAAATTAGGCCTTAATTTGTCGTTTTGGGCCCCC SEQ ID NO：50
proC-2 TCTCTCATCCGCCAAAACAGCTAGCGCTTTCCGAGTTCTTCAG SEQ ID NO：51
putA-1 CAGGAAACAGCTATGACATGTTCTAGGGCATCGACGAACCAG SEQ ID NO：52
putA-2 GAAATTGTTAAAAGCGCAGCGC SEQ ID NO：53
ABC-F GCTGCGCTTTTAACAATTTCGAAAACCCAGGATTGCTTTGTG SEQ ID NO：54
ABC-R TCGAAGCCGCACGTCATCTAG SEQ ID NO：55
putA-3 TAGATGACGTGCGGCTTCGATCCGTGAACGCCTATCTGTACG SEQ ID NO：56
putA-4 TGTAAAACGACGGCCAGTGCGATCGATTCCACGCCCAAAC SEQ ID NO：57
pK18-1 GCACTGGCCGTCGTTTTAC SEQ ID NO：58
pK18-2 CATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG SEQ ID NO：59
(2)Ppyc-20启动子突变体改造菌株的脯氨酸生产能力评价
为了测试谷氨酸棒杆菌中应用Ppyc-20启动子突变对菌株产脯氨酸的影响，分别对SLCgP1和SLCgP2进行发酵测试，发酵培养基成份为：葡萄糖，72g/L；酵母粉，1g/L；大豆蛋白胨，1g/L；NaCl，1g/L；硫酸铵，1g/L；尿素，10g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.45g/L；FeSO4·7H2O，0.05g/L；生物素，0.4mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，40g/L；初始pH7.2。首先将菌株接种到TSB液体培养基中培养8h，培养物作为种子接种到每孔含有800μl发酵培养基的24孔板中，接种量为12μl，30℃培养18h，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测脯氨酸产量。结果如表7所示，在染色体插入Ppyc-20启动子表达proBG149K、proA和proC的表达盒后菌株的脯氨酸产量提高显著，其中SLCgP2比SLCgP1提高了77％。
表7
菌株 脯氨酸产量(g/L)
SLCgP1 3.10±0.15
SLCgP2 5.48±0.23
以上结果表明增强的pyc基因启动子突变体可用于在谷氨酸棒杆菌中表达不同的目标基因并应用于各种产品的生产。首先，增强的pyc基因启动子突变体可用于谷氨酸棒杆菌中pyc基因自身的表达增强，从而增强Pyc的活性，进而强化从丙酮酸到草酰乙酸的合成，其可应用至依赖于草酰乙酸前体供应的目标产物的生产，包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)，以及5-氨基乙酰丙酸等以草酰乙酸为重要代谢前体的氨基酸的生物法生产。本发明实施例已经证实增强的pyc基因启动子突变体可以用于天冬氨酸家族氨基酸赖氨酸和谷氨酸家族氨基酸脯氨酸的生产。也已经有大量的现有技术证实增强Pyc的表达和活性可以用于以上产品的生产。例如：1)Peters-Wendisch PG等报道过表达Pyc可以提高谷氨酸、赖氨酸和苏氨酸产量(Peters-Wendisch P G,Schiel B,Wendisch V F,et al.Pyruvatecarboxylase is a major bottleneck for glutamate and lysine production byCorynebacterium glutamicum.[J].J Mol Microbiol Biotechnol,2001,3(2):295-300.)。2)Pyc是谷氨酸棒杆菌中催化从C3(PEP或丙酮酸)生成C4草酰乙酸的主要酶，Pyc过表达及活性增强是提高以草酰乙酸为前体的氨基酸生产的重要靶点(Uwe Sauer,BernhardJ.Eikmanns.The PEP–pyruvate–oxaloacetate node as the switch point for carbonflux distribution in bacteria[M]//FEMS Microbiology Reviews.)。3)专利CN103981203B公布了促进草酰乙酸合成的相关酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶)的活性增强可以提高5-氨基乙酰丙酸产量，本发明的谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶pyc基因启动子突变都可以用于增强Pyc的表达和活性，因此本发明pyc基因启动子突变体也可以用于5-氨基乙酰丙酸生产。其次，本发明的实施例也证实增强的pyc基因启动子突变体还可以用于proB、proA、proC等基因的表达，说明本发明的pyc基因启动子突变体具有很好的通用性，其可以用于更多基因的表达，进而用于更多产品的生产。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用
<160> 59
<170> PatentIn Version 3.1
<210>1
<211>373
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400> 1
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<400> 14
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga 60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa 120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg 180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg 240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacct tggcttgatt tttgtttgag 300
ggttgtataa tgttattacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg 360
aataattact cta 373
<210>15
<211>373
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400> 15
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga 60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa 120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg 180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg 240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacga ctagttgatt tccgcccttg 300
gttgatatta tgcttgaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg 360
aataattact cta 373
<210>16
<211>373
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400> 16
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga 60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa 120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg 180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg 240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacat ccgcttgatt taggcgtacg 300
tttaatagta tattgaaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg 360
aataattact cta 373
<210>17
<211>373
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400> 17
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga 60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa 120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg 180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg 240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaaccg gggcttgatt tccttgtcgt 300
ggcgttatta taatggaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg 360
aataattact cta 373
<210>18
<211>373
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400> 18
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga 60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa 120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg 180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg 240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacat ggagttgatt atacgatact 300
acagatacta tactggtacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg 360
aataattact cta 373
<210>19
<211>373
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400> 19
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga 60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa 120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg 180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg 240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaaccc gtagttgatt gacttgggca 300
gtatatagta taatgaaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg 360
aataattact cta 373
<210>20
<211>373
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400> 20
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga 60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa 120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg 180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg 240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaaccg ggccttgatt gtaagataag 300
acatttagta taattagacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg 360
aataattact cta 373
<210>21
<211>373
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400> 21
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga 60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa 120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg 180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg 240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaaccg atgtttgatt gggggaatcg 300
ggggttacga tactaggacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg 360
aataattact cta 373
<210>22
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 22
cctgatgcgg tattttctcc gaaaacccag gattgctttg tg 42
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 23
gcggacagct tcagaagcaa aag 23
<210>24
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 24
ttgcttctga agctgtccgc ggcggtggct ctggaggtgg tgggtccggc ggtggctctg 60
cttcctccga agacgttatc aaag 84
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 25
ggagaaaata ccgcatcagg c 21
<210>26
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 26
cccgaaaaca ttgagaggaa aacaaaaacn nnnnnttgat tnnnnnnnnn nnnnnntann 60
atnnnnnnac gcagtgactg ctatcaccc 89
<210>27
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 27
aaccttccat acgaactttg aaacg 25
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 28
caaagttcgt atggaaggtt ccg 23
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 29
ttcctctcaa tgttttcggg c 21
<210>30
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 30
caggaaacag ctatgacatg gtatcgccat gtatcacgca ctc 43
<210>31
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 31
tcagtacgaa tcaaaattag gtttttgttt tcctctcaat gttttc 46
<210>32
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 32
atggccacaa tcaagcggaa gtttttgttt tcctctcaat gttttc 46
<210>33
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 33
tacgcctaaa tcaagcggat gtttttgttt tcctctcaat gttttc 46
<210>34
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 34
tatcttacaa tcaaggcccg gtttttgttt tcctctcaat gttttc 46
<210>35
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 35
ctaattttga ttcgtactga tttctgctac gatgagtcaa cgcagtgact gctatcaccc 60
<210>36
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 36
ttccgcttga ttgtggccat agtatgatat tattaattaa cgcagtgact gctatcaccc 60
<210>37
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 37
atccgcttga tttaggcgta cgtttaatag tatattgaaa cgcagtgact gctatcaccc 60
<210>38
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 38
cgggccttga ttgtaagata agacatttag tataattaga cgcagtgact gctatcaccc 60
<210>39
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 39
tgtaaaacga cggccagtgc ctaatttgcg aagctcatca ggtg 44
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
gcactggccg tcgttttac 19
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
catgtcatag ctgtttcctg tgtg 24
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
ggagaaaata ccgcatcagg c 21
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
ctgttttggc ggatgagaga ag 22
<210>44
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
cctgatgcgg tattttctcc gaaaacccag gattgctttg tg 42
<210>45
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
ttggagatgc gctcacgcat tagagtaatt attcctttca acaagag 47
<210>46
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
atgcgtgagc gcatctccaa c 21
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
ttacgcgcgg ctggcgtagt tg 22
<210>48
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
actacgccag ccgcgcgtaa gccttttatg gtgtgatccg ac 42
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
ttaaggccta atttgtcctg tgcc 24
<210>50
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
caggacaaat taggccttaa tttgtcgttt tgggccccc 39
<210>51
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
tctctcatcc gccaaaacag ctagcgcttt ccgagttctt cag 43
<210>52
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
caggaaacag ctatgacatg ttctagggca tcgacgaacc ag 42
<210>53
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
gaaattgtta aaagcgcagc gc 22
<210>54
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
gctgcgcttt taacaatttc gaaaacccag gattgctttg tg 42
<210>55
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
tcgaagccgc acgtcatcta g 21
<210>56
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
tagatgacgt gcggcttcga tccgtgaacg cctatctgta cg 42
<210>57
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
tgtaaaacga cggccagtgc gatcgattcc acgcccaaac 40
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
gcactggccg tcgttttac 19
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
catgtcatag ctgtttcctg tgtg 24

Claims (10)

1.一种谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其在对应于SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的启动子的第279位至第317位的核心区存在突变。
2.如权利要求1所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其特征在于，所述突变体第279位至第317位的核心区的核苷酸序列为如下序列之一：
1)CTAATTTTGATTCGTACTGATTTCTGCTACGATGAGTCA；
2)GGATTGTTGATTTGAGCTTGATGAGCGTACAATCAACTT；
3)TTCTCCTTGATTGCGCCTTAACCGTGGTATGATTCGATA；
4)ATTGATTTGATTGGAACCTTACTGTGCTATGATTTGGTA；
5)TCGAGTTTGATTTCACAACGTGTGTGATAGGATATAATA；
6)TTGCGTTTGATTAAAGTATGCAAGGGCTAGTATGGTGAT；
7)ATCATTTTGATTCCGGCGCACATGTGGTAATATGGTATT；
8)TCGCCATTGATTGCCCGCCATCCATGCTATAATCGGAAG；
9)TTCCGCTTGATTGTGGCCATAGTATGATATTATTAATTA；
10)CGGATCTTGATTTTATGATGGGTATTGTATAATCTTGGT；
11)CGGATATTGATTTGGCCGGTGTTGTGGTAGTATCGTGTT；
12)AGGGGTTTGATTGGCCGCTCGGTGTGTTATCATGGAGAG；
13)GAGTTGTTGATTTCGTTGGTGCACGTATACAATGGTTTT；
14)CTTGGCTTGATTTTTGTTTGAGGGTTGTATAATGTTATT；
15)GACTAGTTGATTTCCGCCCTTGGTTGATATTATGCTTGA；
16)ATCCGCTTGATTTAGGCGTACGTTTAATAGTATATTGAA；
17)CGGGGCTTGATTTCCTTGTCGTGGCGTTATTATAATGGA；
18)ATGGAGTTGATTATACGATACTACAGATACTATACTGGT；
19)CCGTAGTTGATTGACTTGGGCAGTATATAGTATAATGAA；或
20)CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG。
3.如权利要求1或2所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：20任一项所示。
4.一种表达盒，其包含如权利要求1-3任一项所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体。
5.一种表达载体，其包含如权利要求1-3任一项所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体、或如权利要求4所述的表达盒。
6.一种宿主细胞，其包含如权利要求1-3任一项所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体。
7.如权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，其是肠杆菌属或棒杆菌属，优选棒杆菌属，进一步优选为谷氨酸棒杆菌，更具体的是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067。
8.一种增强目的基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求1-3任一项所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与目的基因可操作地连接。
9.一种以草酰乙酸为前体的目标产物的生产方法，所述方法包括培养含有权利要求1-3任一项的突变体核酸与以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关的基因可操作地连接的宿主细胞，并收集产生的目标产物。
10.如权利要求9所述的以草酰乙酸为前体的目标产物的生产方法，其特征在于，所述以草酰乙酸为前体的目标产物包括但不限于氨基酸或其衍生物，优选包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)，以及5-氨基乙酰丙酸等，优选衍生物包括但不限于戊二胺、5-氨基酸戊酸、戊二酸等。
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