CN116042591A - 磷酸甲基嘧啶合酶突变体及其在构建谷氨酸生产菌株中的应用 - Google Patents

磷酸甲基嘧啶合酶突变体及其在构建谷氨酸生产菌株中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及磷酸甲基嘧啶合酶突变体及其在提高L‑谷氨酸产量和转化率中的应用。该突变体可以降低谷氨酸的生产成本，可以用于大规模生产谷氨酸，具有应用前景。

Description

磷酸甲基嘧啶合酶突变体及其在构建谷氨酸生产菌株中的应用
技术领域
本发明涉及微生物与生物技术领域，具体涉及一种磷酸甲基嘧啶合酶突变体，以及该突变体构建L-谷氨酸生产菌株，生产L-谷氨酸的方法。
背景技术
L-谷氨酸是世界第一大氨基酸产品，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应，主要用于生产味精、鸡精等调味料以及各种食品，并在医药、化工、畜牧等领域应用广泛。
当前，L-谷氨酸的生产主要采用微生物发酵法来生产，通常使用的工业发酵微生物包括棒杆菌属（ Corynebacterium）、短杆菌属（ Brevibacterium）的菌株。由于谷氨酸棒杆菌（ Corynebacterium glutamicum）的生理优越性，其已成为工业中最重要的谷氨酸生产菌株。随着谷氨酸棒杆菌遗传改造工具的不断发展，以及代谢工程手段的进步，对谷氨酸棒杆菌进行代谢工程改造提高其谷氨酸产量的报道逐渐增多，然而，由于谷氨酸棒杆菌中的L-谷氨酸主要由谷氨酸脱氢酶催化TCA循环中间产物α-酮戊二酸一步转化生成，因此，可改造的代谢靶点较少，导致菌株的理性改造受限，菌株的L-谷氨酸产量较难提高。
磷酸甲基嘧啶合酶，简称ThiC，是微生物中参与维生素B1合成的关键酶，维生素B1是丙酮酸脱氢酶复合体和α-酮戊二酸脱氢酶复合体的关键辅因子，在碳源利用和代谢中发挥重要功能。现有L-谷氨酸生产菌株在发酵过程中需外源添加维生素B1，以维持高效的中心代谢。但目前尚没有改造维生素B1合成途径促进L-谷氨酸合成的研究。
发明内容
本发明通过对研究团队前期筛选获得的谷氨酸高产菌株SL4基因组序列分析，发现其磷酸甲基嘧啶合酶编码基因 thiC存在点突变，并进一步研究发现，由其编码的第349位丙氨酸被苏氨酸取代的突变酶可以提高菌株的谷氨酸产量，进而可以提升谷氨酸的生产效率，降低生产成本。在此基础上，完成本发明。
第一方面，本发明提供磷酸甲基嘧啶合酶突变体，所述突变体为氨基酸序列在对应于SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第349位丙氨酸被苏氨酸取代。
进一步地，所述磷酸甲基嘧啶合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
其中，本文所述的“磷酸甲基嘧啶合酶”及其缩写名称“ThiC”是指来源于谷氨酸棒杆菌，其编码基因是Gene ID为BBD29_07055的蛋白。如本文所使用，ThiC不被具体限制，只要其具有相应的活性，并且其可以是衍生自谷氨酸棒状杆菌，但是不限于此。例如，ThiC可以是如SEQ ID NO:3的氨基酸序列的野生型序列或者与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的氨基酸序列。
所述“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本公开中野生型的磷酸甲基嘧啶合酶是指野生型ThiC蛋白，也即如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。
所述“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即，取代、插入和/或缺的多核苷酸）。在具体的实施方式中，所述“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变（subsititution）或点突变（point mutation）。
所述“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本发明中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。
第二方面，本发明提供了所述磷酸甲基嘧啶合酶的编码多核苷酸。
所述“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
具体地，本发明的磷酸甲基嘧啶合酶的编码多核苷酸包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸，且在其1045位突变的多核苷酸。此外，本发明的多核苷酸还包括与SEQ ID NO:2所示多核苷酸具有75％或更高，具体地80％或更高，更具体地85％或更高，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和99％或更高的同源性的任何多核苷酸。
本发明的术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。一个部分与另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域中已知的技术测定。例如，同源性可以通过使用容易可获得的计算机程序直接排列两个多核苷酸分子或两个多肽分子的序列信息来测定。计算机程序的实例可以包括BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLCbio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc.)等。另外，多核苷酸之间的同源性可以通过如下步骤来测定：在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，利用单链特异性核酸酶分解，然后对分解的片段进行大小测定。
第三方面，本发明提供所述磷酸甲基嘧啶合酶突变体或其编码核苷酸在提高L-谷氨酸产量和转化率中的应用。
第四方面，本发明提供了一种L-谷氨酸的生产菌株，所述谷氨酸生产菌株中引入含有第一方面的磷酸甲基嘧啶合酶突变体或第二方面的编码多核苷酸，以提高所述菌株的L-谷氨酸的产量和转化率。
本发明的生产菌株是谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株。
在本发明的一个具体实施方式中，所述出发菌株是谷氨酸棒杆菌，进一步地经过改良，具体地是在所述菌中的NCgl1221同源基因（BBD29_06760或yggB）中引入A111V突变，获得谷氨酸生产菌株SCgGC5。
在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
第五方面，本发明提供了一种生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括培养第四方面的宿主细胞使之生产L-谷氨酸，进一步包括从培养基中分离提取或回收L-谷氨酸的步骤。
本发明的有益效果：本发明提供的磷酸甲基嘧啶合酶突变体，与SEQ ID NO：3所示序列的磷酸甲基嘧啶合酶相比，含有该突变体的菌株其L-谷氨酸产量提高11%以上，因此可以提高菌株L-谷氨酸的产量和转化率，可降低谷氨酸的生产成本，有可能用于大规模生产谷氨酸。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选此处提供的方法和材料。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例中所用的培养基如下：
TSB平板培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K2HPO4·3H2O，1 g/L；MgSO4·7H2O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L；琼脂粉，15 g/L。
TSB液体培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K2HPO4·3H2O，1 g/L；MgSO4·7H2O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L。
谷氨酸发酵实验使用的种子培养基成份为：葡萄糖，25 g/L；KH2PO4·3H2O，2.2 g/L；尿素，3 g/L；玉米浆，33 mL；MgSO4·7H2O，0.9 g/L；豆饼水解液，22 mL；MOPS，20 g/L；初始pH7.2。
谷氨酸发酵实验使用的发酵培养基成份为：葡萄糖，80 g/L；KH2PO4，1 g/L；尿素，10 g/L；玉米浆干粉，5 g/L；MgSO4·7H2O，0.4 g/L；FeSO4·7H2O，10 mg/L；MnSO4·4H2O，10mg/L；VB1，200 μg/L；MOPS，40 g/L；初始pH7.5。
实施例1、突变型ThiC编辑质粒构建
发明人前期通过诱变筛选，获得一株能够高产谷氨酸的突变菌株，并命名为SL4（Liu Jiao, et al., Mutations in Peptidoglycan Synthesis Gene ponA ImproveElectrotransformation Efficiency of Corynebacterium glutamicum ATCC 13869.Appl. Environ. Microbiol., 2018, 84, e02225-02218 .）。通过对SL4基因组进行序列分析，发现其磷酸甲基嘧啶合酶编码基因 thiC存在点突变，并进一步研究发现由其编码的第349位丙氨酸被苏氨酸取代。鉴于现有L-谷氨酸生产菌株在发酵过程中需外源添加维生素B1，以维持高效的中心代谢，因此预测该突变可能是提高谷氨酸产量的新靶点。
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列及野生型ThiC的序列（其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示），设计扩增引物ThiC-F1/R1和ThiC-F2/R2，以ATCC 13869基因组为模板，扩增包含ThiCA349T突变体的上游和下游重组片段。根据质粒pK18mob sacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mob sacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。本实施例所用引物见表1。上述三片段回收后重组连接，获得带有ThiCA349T突变体的编辑质粒pK18-ThiCA349T。
表1 构建突变体编辑质粒引物
引物 核苷酸序列
pK-F AAGCTTGGCACTGGCCGTCG
pK-R GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT
ThiC-F1 tgacatgattacgaattcCTATAAGCAGGCATTTGCAG
ThiC-R1 acgatgccacgcaattcgccgagctgcaa
ThiC-F2 gcgaattgcgtggcatcgttggcgtcggc
ThiC-R2 cgacggccagtgccaagcttGAACCCTTCCGCATCTAC
其中，SEQ ID NO：3的氨基酸序列如下：
MTPTQNEIHPKHSYSPIRKDGLEVPETEIRLDDSPSGPNEPFRIYRTRGPETDPKQGLPRLRESWITARGDVAAYQGRERLLIDDGRSAMRRGQASAEWKGQKPAPLKALPGKRVTQMAYARAGVITREMEFVALREHVDAEFVRSEVARGRAIIPNNVNHPESEPMIIGRKFLTKINANIGNSAVTSSIEEEVSKLQWATRWGADTVMDLSTGDDIHTTREWIIRNSPVPIGTVPIYQALEKVNGVAADLNWEVFRDTVIEQCEQGVDYMTIHAGVLLAYIPLTTRRVTGIVSRGGSIMAGWCLAHHRESFLYEHFDELCEIFAQYDVAFSLGDGLRPGSLADANDAAQFAELQTIGELTQRAWEYDVQVMVEGPGHVPLNMIQENNELEQKWAADAPFYTLGPLVTDIAPGYDHITSAIGAAHIAMGGTAMLCYVTPKEHLGLPNRDDVKTGVITYKLAAHAADVAKGHPGARAWDDAMSKARFEFRWNDQFALSLDPDTAIAYHDETLPAEPAKTAHFCSMCGPKFCSMRISQDIRDMFGDQIAELGMPGVGDSSSAVASSGAREGMAEKSREFIAGGAEVYRR。
SEQ ID NO：4的核苷酸序列如下：
atgacgcctacccaaaatgagatccacccgaaacacagctactcccccatccgcaaggacggtctcgaggtcccggagaccgaaatccgcctcgatgactcgccaagcggccccaacgaacccttccgcatctaccgcacccgtggcccagaaaccgaccccaagcagggacttccgcgcctgcgcgagtcatggatcaccgcccgcggcgacgttgccgcatatcaggggcgcgagcgtttgcttatcgacgacggccgctcggcaatgcgtcgaggtcaagcttcggcagagtggaaaggccaaaaaccagctcctttgaaggcgctacctggcaaaagagtcacccaaatggcctatgcgcgcgctggcgtgattactcgtgaaatggagtttgtggcgctgcgcgaacacgttgatgcagaatttgtgcgctcggaggtggcgcgcggtcgggccattattcccaacaacgtcaaccaccccgaatctgaaccgatgattattggtcgcaaatttttgaccaaaatcaacgccaatattggcaattctgcggtcacttcttcaatcgaggaagaggtgtccaagctgcagtgggccacgcgctggggtgccgataccgtgatggatctatccaccggcgatgatattcacaccacccgcgaatggattatccgcaactcccccgttcccatcggcaccgtaccgatctaccaagcgctggaaaaagtaaatggcgtggccgcagaccttaactgggaagtattccgcgataccgtcattgagcagtgtgaacaaggcgtggactatatgaccatccacgccggcgtactactggcctacatcccactgaccacccgtcgcgtcaccggcattgtctcccgtggcggttctatcatggccggttggtgtctggcgcaccaccgcgaatcatttctctacgagcattttgacgagctgtgcgaaatttttgcacaatatgacgtcgcattctcccttggtgatggtctacgccccggctcgcttgccgacgccaacgatgccgcgcaattcgccgagctgcaaaccattggtgaactcacccaacgcgcctgggaatacgatgtacaagtaatggtcgaaggacctggacacgtgccactaaacatgatccaggaaaacaacgagctggaacaaaagtgggcagcggacgcacctttttacactcttggaccactagttaccgacatcgctccaggttatgaccacatcacttctgccattggtgcagctcacatcgccatgggtggcaccgccatgctgtgttatgtcaccccgaaagaacaccttggcctgcccaaccgtgacgacgtcaaaaccggcgtaatcacctacaagctcgctgcccacgcagcagatgtggccaagggtcatcccggcgcgcgtgcctgggacgacgccatgagcaaagcgcgatttgaattccgttggaatgatcagtttgcgctctccctcgaccccgacactgcaatcgcttaccacgacgaaaccctgccggcagagcctgcgaaaaccgcacacttctgttcaatgtgtggcccgaagttctgctccatgcgaattagccaggacattcgcgatatgtttggcgatcaaatcgcggaattggggatgcctggggttggggattcttctagtgctgttgcttctagtggggcacgggaggggatggctgagaaatcccgggaatttattgctggtggtgcggaggtttatcggcgttag。
实施例2、突变型ThiC的谷氨酸生产菌株构建
本实施例首先构建一株可以生产L-谷氨酸的菌株，其构建过程如下：
已有文献报道了在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组 NCgl1221同源基因（BBD29_06760或 yggB）中引入A111V突变，可以使菌株具备组成型合成分泌L-谷氨酸的能力。根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计引物A111V-UH-F/R和A111V-DH-F/R。以ATCC13869基因组为模板，分别利用上述引物通过PCR扩增获得带有YggBA111V突变的DNA片段；根据质粒pK18mob sacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mob sacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段；上述三片段回收后重组连接，对化转后所获得的克隆进行收集并提取质粒，获得YggBA111V突变的编辑载体pK18-YggBA111V。
采用文献报道的方法制备 C. glutamicum ATCC 13869感受态细胞（Biotechnology Letters, 2015, 37: 2445-52.），向上述制备获得的13869感受态细胞电转化1 μg的pK18-YggBA111V质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养1天，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养6 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得L-谷氨酸生产菌株SCgGC5。本实施例所用引物见表2。
表2本实施例所用引物
引物 核苷酸序列
A111V-UH-F tgacatgattacgaattcATCCACTGGAGTTTTGCCAATTCTC
A111V-UH-R gtcttggtGTGcagtcgattgttgcg
A111V-DH-F atcgactgCACaccaagaccaatggc
A111V-DH-R cgacggccagtgccaagcttTGGAGGAATAGAGCGGGTCATACAC
采用文献报道的方法制备L-谷氨酸生产菌株SCgGC5感受态细胞，向上述制备获得的SCgGC5感受态细胞电转化1 μg的pK18-ThiCA349T质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养24h，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养4 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得带有突变型ThiC的L-谷氨酸生产菌株SCgGC5-ThiCA349T。即该菌株中含有了突变后的ThiC（其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示）。
SEQ ID NO：1的氨基酸序列如下：
MTPTQNEIHPKHSYSPIRKDGLEVPETEIRLDDSPSGPNEPFRIYRTRGPETDPKQGLPRLRESWITARGDVAAYQGRERLLIDDGRSAMRRGQASAEWKGQKPAPLKALPGKRVTQMAYARAGVITREMEFVALREHVDAEFVRSEVARGRAIIPNNVNHPESEPMIIGRKFLTKINANIGNSAVTSSIEEEVSKLQWATRWGADTVMDLSTGDDIHTTREWIIRNSPVPIGTVPIYQALEKVNGVAADLNWEVFRDTVIEQCEQGVDYMTIHAGVLLAYIPLTTRRVTGIVSRGGSIMAGWCLAHHRESFLYEHFDELCEIFAQYDVAFSLGDGLRPGSLADANDATQFAELQTIGELTQRAWEYDVQVMVEGPGHVPLNMIQENNELEQKWAADAPFYTLGPLVTDIAPGYDHITSAIGAAHIAMGGTAMLCYVTPKEHLGLPNRDDVKTGVITYKLAAHAADVAKGHPGARAWDDAMSKARFEFRWNDQFALSLDPDTAIAYHDETLPAEPAKTAHFCSMCGPKFCSMRISQDIRDMFGDQIAELGMPGVGDSSSAVASSGAREGMAEKSREFIAGGAEVYRR。
SEQ ID NO：2的核苷酸序列如下：
atgacgcctacccaaaatgagatccacccgaaacacagctactcccccatccgcaaggacggtctcgaggtcccggagaccgaaatccgcctcgatgactcgccaagcggccccaacgaacccttccgcatctaccgcacccgtggcccagaaaccgaccccaagcagggacttccgcgcctgcgcgagtcatggatcaccgcccgcggcgacgttgccgcatatcaggggcgcgagcgtttgcttatcgacgacggccgctcggcaatgcgtcgaggtcaagcttcggcagagtggaaaggccaaaaaccagctcctttgaaggcgctacctggcaaaagagtcacccaaatggcctatgcgcgcgctggcgtgattactcgtgaaatggagtttgtggcgctgcgcgaacacgttgatgcagaatttgtgcgctcggaggtggcgcgcggtcgggccattattcccaacaacgtcaaccaccccgaatctgaaccgatgattattggtcgcaaatttttgaccaaaatcaacgccaatattggcaattctgcggtcacttcttcaatcgaggaagaggtgtccaagctgcagtgggccacgcgctggggtgccgataccgtgatggatctatccaccggcgatgatattcacaccacccgcgaatggattatccgcaactcccccgttcccatcggcaccgtaccgatctaccaagcgctggaaaaagtaaatggcgtggccgcagaccttaactgggaagtattccgcgataccgtcattgagcagtgtgaacaaggcgtggactatatgaccatccacgccggcgtactactggcctacatcccactgaccacccgtcgcgtcaccggcattgtctcccgtggcggttctatcatggccggttggtgtctggcgcaccaccgcgaatcatttctctacgagcattttgacgagctgtgcgaaatttttgcacaatatgacgtcgcattctcccttggtgatggtctacgccccggctcgcttgccgacgccaacgatgccAcgcaattcgccgagctgcaaaccattggtgaactcacccaacgcgcctgggaatacgatgtacaagtaatggtcgaaggacctggacacgtgccactaaacatgatccaggaaaacaacgagctggaacaaaagtgggcagcggacgcacctttttacactcttggaccactagttaccgacatcgctccaggttatgaccacatcacttctgccattggtgcagctcacatcgccatgggtggcaccgccatgctgtgttatgtcaccccgaaagaacaccttggcctgcccaaccgtgacgacgtcaaaaccggcgtaatcacctacaagctcgctgcccacgcagcagatgtggccaagggtcatcccggcgcgcgtgcctgggacgacgccatgagcaaagcgcgatttgaattccgttggaatgatcagtttgcgctctccctcgaccccgacactgcaatcgcttaccacgacgaaaccctgccggcagagcctgcgaaaaccgcacacttctgttcaatgtgtggcccgaagttctgctccatgcgaattagccaggacattcgcgatatgtttggcgatcaaatcgcggaattggggatgcctggggttggggattcttctagtgctgttgcttctagtggggcacgggaggggatggctgagaaatcccgggaatttattgctggtggtgcggaggtttatcggcgttag。
实施例3、ThiC突变体对L-谷氨酸合成的影响
为了验证ThiC突变体对谷氨酸产量的效果，对上述构建的SCgGC5-ThiCA349T菌株进行发酵测试，同时以菌株SCgGC5作为对照。
首先将菌株接种到种子培养基中培养8 h，培养物作为种子接种到每孔含有800 μL发酵培养基的24孔板中，初始OD600控制约为0.5，孔板摇床转速为800 rpm，每个菌株3个平行，30℃培养，17 h、20 h和23 h补加5 g/L尿素，25 h发酵结束，检测L-谷氨酸产量和葡萄糖消耗量，并计算从葡萄糖到L-谷氨酸的糖酸转化率。结果如表3所示。
表3 L-谷氨酸生产
菌株 L-谷氨酸（g/L） 糖酸转化率（g/g，%）
ATCC 13869 0.20±0.00 0.27±0.00
SCgGC5 4.26±0.19 5.27±0.28
<![CDATA[SCgGC5-ThiC<sup>A349T</sup>]]> 4.76±0.07 6.33±0.10
从表中可知，突变体ThiCA349T能够明显提高L-谷氨酸产量及糖酸转化率，在L-谷氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景。

Claims (10)

1.一种磷酸甲基嘧啶合酶突变体，其特征在于，所述突变体在对应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第349位丙氨酸被苏氨酸取代。
2.如权利要求1所述磷酸甲基嘧啶合酶突变体的编码多核苷酸。
3.如权利要求1所述的磷酸甲基嘧啶合酶突变体或其编码多核苷酸在生产L-谷氨酸中的应用。
4.一种产L-谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其中包含权利要求1所述的磷酸甲基嘧啶合酶突变体，或权利要求2所述的编码多核苷酸。
5.如权利要求4所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其出发菌株包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC14067，以及由上述菌株制备的产生L-谷氨酸的菌株。
6.如权利要求4或5所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其是在谷氨酸棒杆菌ATCC13869基础上，选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：编码α-酮戊二酸脱氢酶的odhA基因；编码琥珀酸脱氢酶的sucA基因。
7.如权利要求6所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，出发菌株中进一步存在选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a. 编码丙酮酸羧化酶的pyc基因；
b. 编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因；
c. 编码柠檬酸合酶的gltA基因；
d. 编码天磷酸转酮酶的fxpk基因；
e.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；
f. 编码磷酸盐转运蛋白的pitA基因；
g.编码机械敏感通道蛋白的yggB基因。
8.如权利要求7所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，出发菌株中的BBD29_06760或其同源基因（NCgl1221基因或yggB）的第111位丙氨酸被缬氨酸取代。
9.一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，包括培养如权利要求4至8任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌使之生产L-谷氨酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，进一步包括从培养基中分离提取或回收L-谷氨酸的步骤。
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