CN115948396A - 谷氨酸脱氢酶启动子突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明基于谷氨酸棒杆菌的gdh基因的野生型启动子，通过对其RBS区进行突变构建启动子文库，筛选获得具有增强活性的突变启动子，表现出比野生型更高的启动子活性。本发明的突变启动子可用于增强目的基因的表达，例如与gdh基因可操作地连接，可以增强谷氨酸脱氢酶的表达强度，由此提高了重组菌株的氨基酸例如谷氨酸生产效率，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体，包含启动子突变体的表达盒、重组载体、重组宿主细胞，以及增强目标基因表达的方法、制备蛋白的方法和生产氨基酸例如谷氨酸的方法。
背景技术
谷氨酸作为重要的氨基酸之一，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，被广泛应用于医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中，主要采用微生物发酵法来生产。目前，由于棒杆菌的生理优越性，棒杆菌已成为工业中最重要的谷氨酸生产菌株。随着生物技术的不断发展，对棒杆菌进行代谢工程改造提高其谷氨酸产量的报道逐渐增多，这些改造包括加强谷氨酸合成途径相关酶的表达，减弱竞争性途径相关酶的表达等等。
谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，由
gdh基因编码），可催化α-酮戊二酸生成谷氨酸，是谷氨酸生物合成的关键酶，同时由于谷氨酸是脯氨酸、赖氨酸等的合成前体或重要代谢物，已有文献报道，增强谷氨酸脱氢酶的表达可以提高菌株的谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸等的产量(WO0053726A1，JP61268185A，CN1262640C，Keleshyan, SK etal., Influence of Glutamate Dehydrogenase Activity on L-Proline Synthesis,APPLIED BIOCHEMISTRY AND MICROBIOLOGY, 2017,53(5):518-523)。本领域技术人员都知晓，增强酶的表达的方法有很多，如增加拷贝数、替换强启动子等等。由于增加拷贝数会在一定程度上增加菌株的负担，可能导致菌株的基因组不稳定，而启动子对基因的表达调控不存在以上缺陷。因此，对于提高棒杆菌氨基酸的生产效率来说，本领域需要开发丰富的启动子元件，以便适度增强
gdh等目标基因的表达，从而提高菌株氨基酸的生产效率。
发明内容
本发明基于谷氨酸棒杆菌的
gdh基因的野生型启动子，通过设计引物对该启动子序列进行定点突变，获得了活性增加的突变启动子，再针对其核心区及RBS区进行突变构建启动子文库，筛选获得具有增强的启动子活性的核酸分子，表现出比野生型更高的启动子活性，可用于增强目的基因的表达，因而完成本发明。
第一方面，本发明提供具有增强活性的谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体，特征在于，所述突变体的多核苷酸选自如下任一项：
（i）如SEQ ID NO：2所示的核苷酸；
（ii）包含与（i）所示的核苷酸序列的反向互补序列的多核苷酸；
（iii）包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与（i）或（ii）所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列的多核苷酸。
进一步地，所述突变体的核苷酸序列还包括在对应于SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第789至第799位存在突变的核苷酸。优选地，所述突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO：3-5所示。
其中，所述“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
所述“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本公开中野生型的启动子是指野生型gdh基因的启动子，也即如SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸。
所述“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即，取代、插入和/或缺的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。在具体的实施方式中，所述“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变（subsititution）或点突变（point mutation）。
所述“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目的基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目的基因的转录。所述“RBS”是指核糖体结合位点（ribosomebinding site），是指mRNA的起始AUG上游的一段非翻译区，可被16SrRNA识别，起始翻译。
本发明的启动子的突变体是改进的谷氨酸棒杆菌的
gdh基因的启动子，它比野生型启动子具有更高的启动子活性，如提高至少1.14倍以上，优选1.86倍以上，更优选2.33倍以上，最优选3.07倍以上。
所述“互补的”是指在核苷酸或核苷酸之间的杂交或碱基配对，例如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物与被测序或扩增的单链核苷酸上的引物结合位点之间等。
所述“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
所述“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
本发明的启动子核酸分子可以使用标准的分子生物学技术分离或制备。例如，可以使用合适的引物序列通过PCR来分离本发明的启动子核酸分子。此外，也可以使用自动DNA合成仪通过标准合成技术来制备本发明的启动子核酸分子。
第二方面，本发明提供包含第一方面所述启动子的表达盒、重组载体。
所述“表达盒”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即含有启动子、目的基因并且能够将目的基因进行表达的元件。
所述“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。本发明所使用的载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。即所述载体包括但不限于质粒，噬菌体，例如本发明具体实施例中使用的pEC-XK99E质粒。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。
第三方面，本发明提供了含有第一方面所述启动子、或第二方面所述表达盒、重组载体的重组微生物宿主细胞。
重组微生物宿主细胞具体通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
所述“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株。示例地，所述宿主细胞可以是任何菌株，只要该菌株具有生产L-氨基酸的能力，其包括野生型菌株和重组菌株。
示例地，所述生产谷氨酸的宿主细胞可以是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基础上，选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
a.编码α-酮戊二酸脱氢酶的
odhA基因。
b.编码琥珀酸脱氢酶的
sucA基因。
在一些实施方式中，示例地，所述宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a. 编码丙酮酸羧化酶的
pyc基因；
b. 编码谷氨酸脱氢酶的
gdh基因；
c. 编码柠檬酸合酶的
gltA基因；
d.编码天磷酸转酮酶的
fxpk基因；
e.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的
ppc基因；
f. 编码磷酸盐转运蛋白的
pitA基因；
g.编码机械敏感通道蛋白的
yggB基因。
在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
第四方面，本发明提供一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将第一方面所述的启动子与目的基因可操作地连接。
其中，所述目的基因是指编码微生物中目标蛋白质的基因。示例性的，目的基因是编码与目标化合物的生物合成相关的酶的基因、编码与还原力相关的酶的基因，编码与糖酵解或TCA循环相关的酶的基因，或编码与目标化合物的释放相关的酶的基因等等。
所述“可操作地连接”是指本发明的谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体与编码基因功能性连接，以启动和介导所述基因的转录，表明本发明的谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体与编码基因可操作地连接以控制操纵子基因的转录活性。所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。本发明所述的增强目的基因表达的方法中，利用本发明的所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法实现。
在一个具体实施方式中，所述编码基因是谷氨酸脱氢酶的基因，其可催化α-酮戊二酸生成谷氨酸，是谷氨酸生物合成的关键酶，同时由于谷氨酸是脯氨酸、赖氨酸等的合成前体，已有大量文献报道增强谷氨酸脱氢酶的表达，可以提高菌株的谷氨酸、脯氨酸和赖氨酸等的产量(WO0053726A1，JP61268185A，CN1262640C，Keleshyan, SK et al., Influenceof Glutamate Dehydrogenase Activity on L-Proline Synthesis, APPLIEDBIOCHEMISTRY AND MICROBIOLOGY, 2017,53(5):518-523)。本发明的所述的系列强度启动子元件，可用于适度调控目标基因的表达，实现目标产物的高效生产。
本发明的谷氨酸脱氢酶基因启动子突变体可以被用作棒杆菌或肠杆菌中其他基因的表达，包括但不限于氨基酸合成相关的基因，如天冬氨酸激酶LysC、苏氨酸操纵子ThrABC、天冬氨酸半醛脱氢酶Asd、天冬氨酸氨裂合酶AspB、高丝氨酸脱氢酶Hom、高丝氨酸O-乙酰基转移酶MetX、二氢吡啶二羧酸合成酶DapA、二氢吡啶甲酸还原酶DapB、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶Ddh、谷氨酸激酶ProB、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA等等。
第五方面，本发明提供一种生产氨基酸的方法，所述方法包括培养第四方面所述的宿主细胞，收集产生的氨基酸。其中，所述氨基酸包括脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺等。更优选地，所述氨基酸生产相关的基因包括但不限于
gdh基因，
lysC基因、
thrABC基因、
asd基因、
aspB基因、
hom基因、
metX基因、
dapA基因、
dapB基因、
ddh基因、
proB基因、
proA基因、
proC基因、
putA基因、
hemA基因等。通过本发明的方法，可以提高菌株的氨基酸，特别是脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸酰胺的产量。
本发明所述的生产氨基酸的方法中，利用本发明的所述谷氨酸脱氢酶基因启动子突变体基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法，同时也包括从细胞或培养液中回收氨基酸的步骤。从细胞或培养基中回收氨基酸的方法是本领域公知的，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC。
在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌，进一步地是经过改良是谷氨酸棒杆菌，具体地是在所述菌中的
NCgl1221同源基因（BBD29_06760或
yggB）中引入A111V突变，获得谷氨酸生产菌株SCgGC5。
本发明的有益效果：本发明提供的具有启动子活性的多核苷酸表现出比野生型更高的启动子活性，可用于增强目的基因的表达，例如与
gdh基因可操作地连接，可以增强谷氨酸脱氢酶的表达强度，由此提高了重组菌株的氨基酸例如谷氨酸生产效率，具有较高的应用价值。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选此处提供的方法和材料。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例中所用的培养基如下：
TSB平板培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K2HPO4·3H2O，1 g/L；MgSO4·7H2O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L；琼脂粉，15 g/L。
TSB液体培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K2HPO4·3H2O，1 g/L；MgSO4·7H2O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L。
谷氨酸发酵实验使用的种子培养基成份为：葡萄糖，25 g/L；KH2PO4·3H2O，2.2 g/L；尿素，3 g/L；玉米浆，33 mL；MgSO4·7H2O，0.9 g/L；豆饼水解液，22 mL；MOPS，20 g/L；初始pH7.2。
谷氨酸发酵实验使用的发酵培养基成份为：葡萄糖，80 g/L；KH2PO4，1 g/L；尿素，10 g/L；玉米浆干粉，5 g/L；MgSO4·7H2O，0.4 g/L；FeSO4·7H2O，10 mg/L；MnSO4·4H2O，10mg/L；VB1，200 μg/L；MOPS，40 g/L；初始pH7.5。
实施例1谷氨酸棒杆菌
gdh启动子的突变筛选和强度表征
（1）谷氨酸棒杆菌
gdh启动子表征载体构建
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计扩增引物gdh-1/2，以ATCC 13869基因组为模板，扩增包含
gdh基因的野生型启动子Pgdh-WT（序列如SEQ ID NO：1所示）以及N端180 bp序列的片段。以文献报道的pEC-XK99E-
rfp质粒（王迎春等. 基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子 [J]. 生物工程学报,2018,34(11):1760-1771）为模板，分别以PEC-1/2为引物扩增pEC-XK99E质粒骨架，以RFP-1/2为引物扩增包含连接肽（DNA序列为：GGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCGGCGGTGGCTCT）的红色荧光蛋白基因DNA片段。本实施例所用引物见表1。上述片段回收纯化后利用诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pEC-XK99E-Pgdh-WT-
rfp表征载体。
（2）谷氨酸棒杆菌
gdh启动子突变体的表征载体构建
设计引物Pgdh-Ts24-F/R，以上述pEC-XK99E-Pgdh-WT-
rfp表征载体为模板反向扩增，片段经T4 PNK进行末端磷酸化处理后用T4连接酶进行连接，对转化后所获得的克隆进行收集并提取质粒，获得
gdh启动子突变体Pgdh-Ts24（序列如SEQ ID NO：2所示）的表征载体pEC-XK99E-Pgdh-Ts24-
rfp。
表1 构建表征载体引物
| 引物 | 核苷酸序列 | 序列号 |
| gdh-1 | CCTGATGCGGTATTTTCTCCGTGTCAGTATGCCTTTCTGT | SEQ ID NO：6 |
| gdh-2 | CCACCTCCAGAGCCACCGCCCTGACGCTCAGGCTCGCACA | SEQ ID NO：7 |
| PEC-1 | CTGCAGGCATGCAAGCTTGG | SEQ ID NO：8 |
| PEC-2 | GGAGAAAATACCGCATCAGGC | SEQ ID NO：9 |
| RFP-1 | GGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCGGCGGTGGCTCTGCTTCCTCCGAAGACGTTATCAAAG | SEQ ID NO：10 |
| RFP-2 | CCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTAAGCACCGGTGGAGTGACGAC | SEQ ID NO：11 |
| Pgdh-Ts24-F | AATTCTTTGTTGTCATTCTGTGCGACACTGCTATAATTTGAACGTGAGCAGTTAACAGCCTAAATGTCCG | SEQ ID NO：12 |
| Pgdh-Ts24-R | AAAATTGTTTGAAAATTTCTTTAGG | SEQ ID NO：13 |
（3）谷氨酸棒杆菌
gdh启动子突变体的强度表征
将上述表征载体分别转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13869，涂布于含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体平板，获得重组菌株。接种转化子至每孔含有800 μL TSB液体培养基的24孔板中，每个菌株3个平行，孔板摇床转速为800 rpm，30℃培养16 h后利用酶标仪检测菌株的荧光强度。荧光测定激发波长为560 nm，发射波长为607 nm；同时测定菌液OD600，计算菌株的荧光强度，结果见表2。可以看出，突变型启动子PgltA-Ts24的活性明显提高，比野生型启动子的活性提高了1.14倍。
表2
gdh启动子突变体的荧光表征
| 启动子编号 | 荧光强度（RFU/OD<sub>600</sub>） | 比野生型提高的倍数 | 启动子完整序列的序列号 |
| P<sub><i>gdh</i>-WT</sub> | 317±6 | —— | SEQ ID NO：1 |
| P<sub><i>gdh</i>-Ts24</sub> | 678±70 | 1.14 | SEQ ID NO：2 |
实施例2谷氨酸棒杆菌
gdh基因启动子的进一步突变筛选及强度表征
（1）启动子突变体文库的构建及初步筛选
本实施例对实施例1中获得
gdh基因启动子突变体P gdh-Ts24的RBS区进行突变，构建RBS突变文库，在RBS区（第789位至第799位）引入“NNNRRRRRNNN”突变。
以实施例1构建的pEC-XK99E-P gdh-Ts24-
rfp表征载体为模板，使用引物RBS-gdh-F和引物RBS-gdh-R扩增包含RBS区突变的片段，经T4 PNK进行末端磷酸化处理后用T4连接酶进行连接，对化转后所获得的所有克隆进行收集并提取质粒，获得Pgdh-Ts24启动子的突变体质粒文库。
将以上质粒文库，转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13869，涂布于含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体平板，通过荧光成像系统对长有数百个克隆的平板进行荧光拍照，根据克隆的荧光亮度初步筛选表达强度提高的突变体。同时将实施例1中获得的pEC-XK99E-Pgdh-WT-
rfp、pEC-XK99E-Pgdh-Ts24-
rfp表征质粒分别转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，获得对照菌株。以上所用引物序列如表3所示。
表3文库建库引物
| 引物 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO： |
| RBS-gdh-F | CGCATGCAGCCGAGATGGGANNNRRRRRNNNATGACAGTTGATGAGCAGGT | SEQ ID NO：14 |
| RBS-gdh-R | CGCACGATTTTAAAGTGTGTATCTG | SEQ ID NO：15 |
（2）启动子突变体文库的表征及序列分析
对以上平板中荧光成像显示荧光亮度增强的突变体进行96孔板培养表征启动子的强度。将平板获得的荧光亮度增强的克隆和野生型及突变型启动子的对照菌株，分别用枪头接种至每孔含有200 μL TSB液体培养基的96孔板中，培养基中添加25 μg/mL卡那霉素，每个菌株各3个平行，孔板摇床转速为800 rpm，30℃培养16 h后采用酶标仪检测菌株的荧光强度。荧光测定激发波长为560 nm，发射波长为607 nm；同时测定菌液OD600，计算菌株的荧光强度。对荧光强度较突变型对照提高菌株，采用pEC-F（TACGGTTCCTGGCCTTTTGC）和RFP-CX（CGGGTGTTTAACGTAAGCTTTG）引物扩增包含突变区的片段并进行测序分析。结果如表4所示，最终成功获得3个表达强度较P gdh-WT启动子提高的启动子突变体（分别如SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：5所示核苷酸序列），提高倍数范围为1.86-3.07倍，这些突变体较P gdh-Ts24启动子突变体的启动活性也有不同程度的提升。
表4
gdh启动子突变体荧光表征
| 启动子编号 | 荧光强度(RFU/OD<sub>600</sub>) | 比野生型提高的倍数 | 启动子完整序列的序列号 |
| P<sub><i>gdh</i>-WT</sub> | 317±6 | —— | SEQ ID NO：1 |
| P<sub><i>gdh</i>-Ts24</sub> | 678±70 | 1.14 | SEQ ID NO：2 |
| P<sub><i>gdh</i>-RBS3</sub> | 907±25 | 1.86 | SEQ ID NO：3 |
| P<sub><i>gdh</i>-RBS8</sub> | 1099±71 | 2.47 | SEQ ID NO：4 |
| P<sub><i>gdh</i>-RBS19</sub> | 1290±100 | 3.07 | SEQ ID NO：5 |
实施例3谷氨酸棒杆菌
gdh基因启动子突变体应用于L-谷氨酸生产
（1）谷氨酸棒杆菌
gdh基因启动子表达质粒的构建
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）和质粒pEC-XK99E序列，设计扩增引物。以PEC-1和P-gdh-2为引物，分别以pEC-XK99E-P gdh-WT-
rfp、pEC-XK99E-P gdh-Ts24-
rfp表征载体为模板，扩增含有
gdh野生型和突变型启动子的骨架；以P-gdh-1和P-gdh-R为引物，以ATCC13869基因组为模板，扩增
gdh部分基因片段；将扩增得到的片段分别与含有
gdh野生型和突变型启动子的骨架同源重组，对化转后所获得的克隆进行收集并提取质粒，分别获得表达质粒pEC-P gdh-WT-
gdh和pEC-P gdh-Ts24-
gdh。
（2）L-谷氨酸生产菌株构建
已有文献报道了在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组
NCgl1221同源基因（BBD29_06760或
yggB）中引入A111V突变，可以使菌株具备组成型合成分泌L-谷氨酸的能力。为了验证上述启动子在L-谷氨酸生产中的应用，首先在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组中引入上述突变。
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计引物A111V-UH-F/R和A111V-DH-F/R。以ATCC13869基因组为模板，分别利用上述引物通过PCR扩增获得带有YggBA111V突变的DNA片段；根据质粒pK18mob
sacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mob
sacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段；上述三片段回收后重组连接，对化转后所获得的克隆进行收集并提取质粒，获得YggBA111V突变的编辑载体pK18-YggBA111V。
采用文献报道的方法制备
C. glutamicum ATCC 13869感受态细胞（Biotechnology Letters, 2015, 37: 2445-52.），向上述制备获得的13869感受态细胞电转化1 μg的pK18-YggBA111V质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养1天，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养6 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得L-谷氨酸生产菌株SCgGC5。本实施例所用引物见表5。
表5本实施例所用引物
| 引物 | 核苷酸序列 | 序列号 |
| Pgdh-R | CCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTAGATGACGCCCTGTGCCA | SEQ ID NO：16 |
| P-gdh-1 | tgtgcgagcctgagcgtcag | SEQ ID NO：17 |
| P-gdh-2 | ctgacgctcaggctcgcaca | SEQ ID NO：18 |
| A111V-UH-F | tgacatgattacgaattcATCCACTGGAGTTTTGCCAATTCTC | SEQ ID NO：19 |
| A111V-UH-R | gtcttggtGTGcagtcgattgttgcg | SEQ ID NO：20 |
| A111V-DH-F | atcgactgCACaccaagaccaatggc | SEQ ID NO：21 |
| A111V-DH-R | cgacggccagtgccaagcttTGGAGGAATAGAGCGGGTCATACAC | SEQ ID NO：22 |
| pK-F | AAGCTTGGCACTGGCCGTCG | SEQ ID NO：23 |
| pK-R | GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT | SEQ ID NO：24 |
（3）基因启动子突变体应用于L-谷氨酸生产的菌株构建
为了验证
gdh启动子突变体对谷氨酸产量的效果，将上述构建的pEC-P gdh-WT-
gdh和pEC-P gdh-Ts24-
gdh质粒，转化至SCgGC5菌株中，得到菌株SCgGC5/pEC-P gdh-WT-
gdh和SCgGC5/pEC-P gdh-Ts24-
gdh，同时以菌株SCgGC5/pEC-XK99E作为对照。
首先将菌株接种到种子培养基中培养8 h，培养物作为种子接种到每孔含有800 μL添加25 μg/mL卡那霉素的发酵培养基的24孔板中，初始OD600控制约为0.5，孔板摇床转速为800 rpm，每个菌株3个平行，30℃培养，18 h时测定pH值并补加2 g/L尿素，20 h时测定pH值并补加2 g/L尿素，23 h发酵结束，检测L-谷氨酸产量和葡萄糖消耗量，并计算从葡萄糖到L-谷氨酸的糖酸转化率。结果如表6所示。
表6L-谷氨酸生产
| 菌株 | OD<sub>600</sub> | L-谷氨酸（g/L） | 糖酸转化率（g/g，%） |
| SCgGC5/pEC-XK99E | 13.91±0.35 | 4.45±0.26 | 7.76±0.49 |
| SCgGC5/pEC-P<sub><i>gdh</i>-WT</sub>-<i>gdh</i> | 14.48±0.42 | 6.90±0.20 | 14.08±0.25 |
| SCgGC5/pEC-P<sub><i>gdh</i>-Ts24</sub>-<i>gdh</i> | 14.19±0.29 | 8.82±0.19 | 16.44±0.61 |
从表中可知，P gdh-Ts24能够明显提高L-谷氨酸产量及糖酸转化率，可见，
gdh启动子突变体在L-谷氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景。
Claims (10)
1.一种具有启动子活性的多核苷酸，特征在于，所述多核苷酸选自如下任一项：
（i）如SEQ ID NO：2所示的核苷酸；
（ii）包含与（i）所示的核苷酸序列的反向互补序列的多核苷酸；
（iii）包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与（i）或（ii）所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸的突变体，其特征在于，所述突变体在对应于SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第789至第799位存在突变；优选地，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-5所示。
3.包含如权利要求1-2任一项所述启动子的表达盒；可选地，所述表达盒还含有目标基因，所述目标基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。
4.包含如权利要求1-2任一项所述具有启动子活性的多核苷酸或权利要求4所述表达盒的重组载体。
5.含有权利要求1-2任一项所述具有启动子活性的多核苷酸、或权利要求3所述的表达盒、或权利要求4所述重组载体的重组微生物宿主细胞；优选地，所述重组微生物宿主细胞选自肠杆菌或棒杆菌，优选谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株。
6.一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将如权利要求1-2任一项所述具有启动子活性的多核苷酸与目的基因可操作地连接。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述目的基因是氨基酸合成相关的基因，如谷氨酸脱氢酶Gdh，柠檬酸合酶GltA、酮戊二酸脱氢酶OdhA、丙酮酸羧化酶PYC、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC、天冬氨酸激酶LysC、苏氨酸操纵子ThrABC、天冬氨酸半醛脱氢酶Asd、天冬氨酸氨裂合酶AspB、高丝氨酸脱氢酶Hom、高丝氨酸O-乙酰基转移酶MetX、二氢吡啶二羧酸合成酶DapA、二氢吡啶甲酸还原酶DapB、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶Ddh、谷氨酸激酶ProB、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA的基因等。
8.一种制备蛋白的方法，所述方法包括利用权利要求3所述的表达盒、权利要求4所述的重组载体，或权利要求5所述的重组微生物宿主细胞表达所述蛋白的步骤；任选地，还包括分离或纯化所述蛋白的步骤。
9.一种生产目标化合物的方法，其中，所述方法包括利用权利要求3所述的表达盒，权利要求4所述的重组载体，或权利要求5所述的重组宿主细胞表达与目标化合物合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白，在所述与目标化合物合成相关的蛋白或所述基因表达调控蛋白存在的环境下生产目标化合物的步骤；优选地，所述目标化合物为氨基酸；可选地，包括脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸；所述目标化合物合成相关的蛋白包括但不限于谷氨酸脱氢酶Gdh，柠檬酸合酶GltA、酮戊二酸脱氢酶OdhA、丙酮酸羧化酶PYC、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC、天冬氨酸激酶LysC、苏氨酸操纵子ThrABC、天冬氨酸半醛脱氢酶Asd、天冬氨酸氨裂合酶AspB、高丝氨酸脱氢酶Hom、高丝氨酸O-乙酰基转移酶MetX、二氢吡啶二羧酸合成酶DapA、二氢吡啶甲酸还原酶DapB、内消旋二氨基庚二酸脱氢酶Ddh、谷氨酸激酶ProB、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA等。
10.如权利要求1-2任一项所述具有启动子活性的多核苷酸、权利要求3所述的表达盒，权利要求4所述的重组载体，权利要求5所述的重组微生物宿主细胞在增强基因的表达、制备蛋白、生产目标化合物中的用途。
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