RU2812048C9 - Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы и его применение - Google Patents
Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812048C9 RU2812048C9 RU2023103181A RU2023103181A RU2812048C9 RU 2812048 C9 RU2812048 C9 RU 2812048C9 RU 2023103181 A RU2023103181 A RU 2023103181A RU 2023103181 A RU2023103181 A RU 2023103181A RU 2812048 C9 RU2812048 C9 RU 2812048C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- mutant
- promoter
- pyruvate carboxylase
- pyc
- Prior art date
Links
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims abstract description 53
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 55
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 55
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 48
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 31
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 27
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 25
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 24
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 23
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 20
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 19
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 19
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 16
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 14
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 14
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 12
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 12
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 11
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 11
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 108700023479 Glutamate 5-kinases Proteins 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 9
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- DWAKNKKXGALPNW-BYPYZUCNSA-N (S)-1-pyrroline-5-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC=N1 DWAKNKKXGALPNW-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 claims description 8
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 101150046501 proB gene Proteins 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 5
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 claims description 5
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 claims description 5
- 101150068263 putA gene Proteins 0.000 claims description 5
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 5-aminopentanoic acid Chemical compound [NH3+]CCCCC([O-])=O JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000612 Proline Oxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004177 Proline oxidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 3
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 101150008667 cadA gene Proteins 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101150015189 aceE gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150070145 aspB gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 101150064198 gapN gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150112623 hemA gene Proteins 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150115974 metX gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims description 2
- KJOMYNHMBRNCNY-UHFFFAOYSA-N pentane-1,1-diamine Chemical compound CCCCC(N)N KJOMYNHMBRNCNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010071189 phosphoenolpyruvate-glucose phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 claims 3
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100337176 Escherichia coli (strain K12) gltB gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100505027 Escherichia coli (strain K12) gltD gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100398755 Escherichia coli (strain K12) ldcC gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100116199 Streptomyces lavendulae dcsE gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100057034 Talaromyces wortmannii astB gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 claims 1
- YEOCBTKAGVNPMO-JIZZDEOASA-N diazanium;(2s)-2-aminobutanedioate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC([O-])=O YEOCBTKAGVNPMO-JIZZDEOASA-N 0.000 claims 1
- 101150095438 metK gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150043924 metXA gene Proteins 0.000 claims 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 description 81
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 69
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 18
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 18
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 102000005133 Glutamate 5-kinase Human genes 0.000 description 8
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 101150118057 proA gene Proteins 0.000 description 6
- 101150108812 proC gene Proteins 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100189062 Bacillus subtilis (strain 168) proH gene Proteins 0.000 description 5
- FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N O-acetyl-L-homoserine Chemical compound CC(=O)OCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 101100245038 Synechocystis sp. (strain PCC 6803 / Kazusa) proA1 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 101150057904 ddh gene Proteins 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 description 4
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 4
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 4
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102100034013 Gamma-glutamyl phosphate reductase Human genes 0.000 description 3
- 108010016106 Glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 3
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N Phosphoenolpyruvic acid Natural products OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 101150019455 gdh gene Proteins 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 3
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 2
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 101100387232 Escherichia coli (strain K12) asd gene Proteins 0.000 description 2
- 101150099894 GDHA gene Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 101150107204 asd gene Proteins 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108010034653 homoserine O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 101150041134 ldcC gene Proteins 0.000 description 2
- 101150109073 ldhD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 description 2
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 10,10-diamino-1,6-dioxacyclotridecane-2,5,7,13-tetrone Chemical compound NC1(CCC(=O)OC(CCC(=O)OC(CC1)=O)=O)N VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020001657 6-phosphogluconate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004567 6-phosphogluconate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 101100326595 Arabidopsis thaliana CAD6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101001007135 Escherichia coli (strain K12) Constitutive lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 108010023021 Glutamyl-tRNA reductase Proteins 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KABXUUFDPUOJMW-BYPYZUCNSA-N L-glutamic 5-semialdehyde Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC=O KABXUUFDPUOJMW-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 102100023162 L-serine dehydratase/L-threonine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 101710193388 L-serine dehydratase/L-threonine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 101710125839 L-threonine dehydratase Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710155796 Malate:quinone oxidoreductase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700027408 O-acetylhomoserine (thiol)-lyase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101710170075 Serine dehydratase-like Proteins 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101150024271 TKT gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 1
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 101150006213 ackA gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 101150014383 adhE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 101150064923 dapD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150000582 dapE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 101150107963 eno gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 101150077334 focA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 108010008221 formate C-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 101150014950 gnd gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 101150094267 mqo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 150000004719 oxaloacetic acids Chemical class 0.000 description 1
- 101150111581 pflB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150000475 pntAB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 101150060030 poxB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150108780 pta gene Proteins 0.000 description 1
- 101150109655 ptsG gene Proteins 0.000 description 1
- 101150118630 ptsI gene Proteins 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 108010073086 succinyl-CoA-tetrahydrodipicolinate N-succinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой мутант промотора гена пируваткарбоксилазы Corynebacterium glutamicum. Указанный мутант обладает улучшенной промоторной активностью по сравнению с промотором дикого типа и может применяться для повышения экспрессии целевого гена. Так, функциональное лигирование указанного мутанта с геном пируваткарбоксилазы повышает интенсивность экспрессии пируваткарбоксилазы, тем самым улучшая эффективность продуцирования аминокислот штаммом. 8 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 4 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение принадлежит к области биотехнологии и конкретнее относится к мутантам промоторов гена пируваткарбоксилазы и их применениям.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Аминокислоты, включая лизин, треонин, глутаминовую кислоту и т.д., являются основными веществами, составляющими белки, необходимые для питания животных, и широко используются в таких отраслях, как медицина, здравоохранение, пищевая промышленность, корма для животных и косметика. Аминокислоты в основном продуцируются путем микробиологической ферментации. В настоящее время основные штаммы-продуценты включают такие микроорганизмы, как род Enterobacter и род Corynebacterium. Благодаря своему физиологическому превосходству Corynebacterium стал самым важным штаммом-продуцентом в отрасли. С непрерывным развитием биотехнологии сообщения о метаболической инженерии Corynebacterium для улучшения выхода аминокислот при его применении постепенно растут. Эти инженерные модификации включают повышение экспрессии ферментов, связанных с путями синтеза аминокислот, ослабление экспрессии ферментов, связанных с конкурентными путями, и так далее.
Считается, что пируваткарбоксилаза (кодируемая геном pyc) является ферментом, который играет значительную роль в анаплеротическом пути Corynebacterium, и этот фермент способен катализировать образование щавелевоуксусной кислоты из пировиноградной кислоты и углекислого газа, тем самым входя в цикл ЦТК (цикл трикарбоновых кислот). В многочисленных литературных источниках сообщалось, что сверхэкспрессия пируваткарбоксилазы может увеличить выход аминокислот (таких как лизин, глутаминовая кислота и треонин) при использовании штаммов [1-2]. В настоящее время сверхэкспрессия гена pyc в основном достигается за счет увеличения числа его копий. Однако увеличение числа копий может привести к геномной нестабильности штаммов, тогда как промоторы не имеют вышеуказанного недостатка в регуляции экспрессии генов, и высокоэффективные промоторы также могут применяться для экспрессии различных целевых генов. Следовательно, в данной области техники существует необходимость в разработке промоторных элементов с повсеместной активностью для надлежащего повышения экспрессии генов, таких как pyc, тем самым улучшая продукцию целевого соединения штаммом.
Цитируемые источники:
[1] CN110603321A
[2] CN1275167A
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте настоящего изобретения предложен мутант промотора гена пируваткарбоксилазы, где указанный мутант (i) имеет один или более мутированных нуклеотидов в коровой области, соответствующей положениям с 279 по 317 промотора, имеющего нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.
Термин «мутант» в контексте настоящего документа относится к полинуклеотиду или полипептиду, который относительно полинуклеотида или полипептида «дикого типа» или «сравнительного» полинуклеотида или полипептида содержит изменение (изменения) (т. е. замену, инсерцию и/или делецию полинуклеотида) в одном или более (например, нескольких) положениях, где замена относится к замене другим нуклеотидом нуклеотида, который занимает одно положение; делеция относится к удалению нуклеотида, который занимает определенное положение; и инсерция относится к добавлению нуклеотида после нуклеотида, прилегающего к и следующего сразу за занятым положением.
В частности, мутант промотора гена пируваткарбоксилазы Corynebacterium glutamicum имеет мутированный нуклеотид(ы) в положениях 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 в нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям с 279 по 317 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления мутант содержит замененный нуклеотид. Замена представляет собой мутацию, вызванную заменой одного основания в нуклеотиде другим, отличающимся, основанием, которую также называют заменой основания или точечной мутацией.
В некоторых вариантах осуществления мутант (ii) содержит последовательность, обратно комплементарную нуклеотидной последовательности, представленной в (i).
В некоторых вариантах осуществления мутант (iii) содержит последовательность, обратно комплементарную последовательности, способной к гибридизации с нуклеотидной последовательностью, представленной в (i) или (ii), в высокожестких условиях гибридизации или очень высокожестких условиях гибридизации.
В некоторых вариантах осуществления мутант (iv) содержит нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, представленной в (i) или (ii). В частности, мутант содержит последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, представленной в (i) или (ii).
Нуклеотидная последовательность мутанта, представленного в любом из (i) - (iv), не является CGATGTTTGATTGGGGGAATCGGGGGTTACGATACTAGG в положениях, соответствующих положениям с 279 по 317 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 21; и предпочтительно мутант, представленный в любом из (i) - (iv), обладает повышенной промоторной активностью по сравнению с промотором гена пируваткарбоксилазы, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления мутант промотора гена пируваткарбоксилазы согласно настоящему изобретению имеет следующую нуклеотидную последовательность, соответствующую положениям с 279 по 317 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 21: NNNNNNTTGATTNNNNNNNNNNNNNNNTANNATNNNNNN, где N выбран из A, T, C или G.
Предпочтительно мутант промотора гена пируваткарбоксилазы обладает промоторной активностью, повышенной в от 1 до 17 раз или более по сравнению с промотором гена пируваткарбоксилазы, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21. В качестве примера, промоторная активность после мутации повышается по меньшей мере в 1,8 раза, предпочтительно в 3 раза, в 5 раз, в 8 раз, предпочтительно в 10 раз, в 11 раз, в 12 раз, в 13 раз, и более предпочтительно в 14 раз, в 15 раз или в 16 раз, или более.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность коровой области промотора мутанта согласно настоящему изобретению представляет собой одну из следующих последовательностей:
CTAATTTTGATTCGTACTGATTTCTGCTACGATGAGTCA;
GGATTGTTGATTTGAGCTTGATGAGCGTACAATCAACTT;
TTCTCCTTGATTGCGCCTTAACCGTGGTATGATTCGATA;
ATTGATTTGATTGGAACCTTACTGTGCTATGATTTGGTA;
TCGAGTTTGATTTCACAACGTGTGTGATAGGATATAATA;
TTGCGTTTGATTAAAGTATGCAAGGGCTAGTATGGTGAT;
ATCATTTTGATTCCGGCGCACATGTGGTAATATGGTATT;
TCGCCATTGATTGCCCGCCATCCATGCTATAATCGGAAG;
TTCCGCTTGATTGTGGCCATAGTATGATATTATTAATTA;
CGGATCTTGATTTTATGATGGGTATTGTATAATCTTGGT;
CGGATATTGATTTGGCCGGTGTTGTGGTAGTATCGTGTT;
AGGGGTTTGATTGGCCGCTCGGTGTGTTATCATGGAGAG;
GAGTTGTTGATTTCGTTGGTGCACGTATACAATGGTTTT;
CTTGGCTTGATTTTTGTTTGAGGGTTGTATAATGTTATT;
GACTAGTTGATTTCCGCCCTTGGTTGATATTATGCTTGA;
ATCCGCTTGATTTAGGCGTACGTTTAATAGTATATTGAA;
CGGGGCTTGATTTCCTTGTCGTGGCGTTATTATAATGGA;
ATGGAGTTGATTATACGATACTACAGATACTATACTGGT;
CCGTAGTTGATTGACTTGGGCAGTATATAGTATAATGAA; или
CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG.
В некоторых вариантах осуществления мутант промотора гена пируваткарбоксилазы согласно настоящему изобретению имеет нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 20.
Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы представляет собой молекулу, состоящую из нуклеотидов, обладающую промоторной активностью, и обладает повышенной активностью по сравнению с промотором дикого типа. «Промотор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая обычно расположена против хода транскрипции от кодирующей последовательности представляющего интерес гена, обеспечивая сайт распознавания для РНК-полимеразы, и расположена против хода транскрипции от 5’ -направления сайта инициации транскрипции мРНК. Она представляет собой нетранслируемую последовательность нуклеиновой кислоты, с которой связывается РНК-полимераза, чтобы инициировать транскрипцию представляющего интерес гена.
Ген, кодирующий пируваткарбоксилазу, представляет собой ген pyc, который, как полагают, является ферментом, который играет значительную роль в анаплеротическом пути Corynebacterium, и этот фермент способен катализировать образование щавелевоуксусной кислоты из пировиноградной кислоты и углекислого газа. Это один из основных анаплеротических путей цикла трикарбоновых кислот. В многочисленных литературных источниках сообщалось, что сверхэкспрессия пируваткарбоксилазы Pyc может увеличить выход аминокислот (таких как лизин, глутаминовая кислота и треонин) при использовании штаммов.
«Коровая область промотора» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, расположенной на промоторе у прокариота, которая представляет собой коровую область последовательности, в которой осуществляется функция промотора, главным образом включающую область -35, область -10, область между областью -35 и областью -10 и сайт инициации транскрипции, область -35 представляет собой сайт распознавания РНК-полимеразы, область -10 представляет собой сайт связывания РНК-полимеразы.
Мутант промотора согласно настоящему изобретению представляет собой улучшенный промотор гена пируваткарбоксилазы Corynebacterium glutamicum, который обладает более высокой промоторной активностью, чем у промотора дикого типа, например, увеличенной по меньшей мере в 1,8 раза, в 3 раза, в 5 раз, в 8 раз, предпочтительно в 10 раз, в 11 раз, в 12 раз, в 13 раз, более предпочтительно в 14 раз или более, в 15 раз или более, в 16 раз или более.
Молекула нуклеиновой кислоты промотора согласно настоящему изобретению может быть выделена или получена с помощью стандартной технологии молекулярной биологии. Например, молекула нуклеиновой кислоты промотора согласно настоящему изобретению может быть выделена с помощью ПЦР с использованием подходящих последовательностей праймеров. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты промотора согласно настоящему изобретению может быть получена стандартным методом синтеза с использованием автоматического синтезатора ДНК.
Молекулы нуклеиновой кислоты с промоторной активностью согласно настоящему изобретению могут применяться для экспрессии другого гена в Corynebacterium или Enterobacterium, включая, не ограничиваясь перечисленным, гены, связанные с синтезом аминокислот, например, пируваткарбоксилазу Pyc, глутаматдегидрогеназу Gdh, аспартаткиназу LysC, треониновый оперон ThrABC, ген аспартат-полуальдегиддегидрогеназы Asd, аспартат-аммоний-лиазу AspB, гомосериндегидрогеназу Hom, гомосерин-O-ацетилтрансферазу MetX, дигидродипиколинатсинтазу DapA, дигидродипиколинатредуктазу DapB, мезо-диаминопимелатдегидрогеназу Ddh, глутаматкиназу ProB, глутамат-5-полуальдегиддегидрогеназу ProA, пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназу ProC, пролиндегидрогеназу/пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназу PutA, синтазу 5-аминолевулиновой кислоты HemA, фосфоенолпируваткарбоксилазу Ppc, белок-транспортер аминокислот, белок, ассоциированный с системой ptsG, пируватдегидрогеназу AceE, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу GapN или лизиндекарбоксилазу CadA или LdcC, и т. д.
Сильные промоторные элементы согласно настоящему изобретению могут применяться для умеренной регуляции экспрессии целевых генов и достижения высокоэффективной продукции целевых продуктов.
Термин «Corynebacterium» в контексте настоящего документа относится к микроорганизмам рода Corynebacterium, включая, не ограничиваясь перечисленным, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum B253, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 и производные штаммы, которые продуцируют аминокислоты и получены из штаммов, описанных выше.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложены экспрессионная кассета и рекомбинантный вектор, содержащий мутант промотора гена пируваткарбоксилазы.
«Экспрессионная кассета» имеет значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, т. е. означает элемент, содержащий промотор и представляющий интерес ген, и способна экспрессировать представляющий интерес ген.
Термин «вектор» относится к конструкции ДНК, содержащей последовательности ДНК, функционально лигированные с соответствующими регуляторными последовательностями, для обеспечения экспрессии представляющего интерес гена в подходящем хозяине. Вектор, используемый в настоящем документе, не ограничен каким-либо особым образом и может представлять собой любой вектор, известный в данной области техники, при условии, что он способен реплицироваться в организме-хозяине. То есть вектор включает, не ограничиваясь перечисленным, плазмиду и фаг, например, плазмиду pEC-XK99E, используемую в конкретных примерах настоящего изобретения. После трансформации в подходящего хозяина вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина или, в некоторых случаях, непосредственно интегрироваться в геном.
В третьем аспекте настоящего изобретения предложена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая мутант промотора гена пируваткарбоксилазы, экспрессионную кассету или рекомбинантный вектор.
Рекомбинантную клетку-хозяина, в частности, получают, например, трансформацией. Термин «трансформация», используемый в настоящем документе, имеет значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, т. е. означает способ введения экзогенной ДНК в хозяина. Способы трансформации включают любой способ введения нуклеиновой кислоты в клетку. Эти способы включают, не ограничиваясь перечисленным, электропорацию, осаждение фосфатом кальция (CaPO4), осаждение хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекцию, метод полиэтиленгликоля (ПЭГ), метод ДЭАЭ-декстрана, метод катионной липосомы и метод ацетата лития-ДМСО.
«Клетка-хозяин» в контексте настоящего документа имеет значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, т. е. означает клетку, в которую может быть введена нуклеиновая кислота, обладающая промоторной активностью, согласно настоящему изобретению, и которая после введения называется рекомбинантной клеткой-хозяином. Другими словами, в настоящем изобретении может быть использована любая клетка-хозяин, при условии, что она содержит нуклеиновую кислоту, обладающую промоторной активностью, согласно настоящему изобретению, и функционально лигирована с геном для опосредования транскрипции этого гена. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению может представлять собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин согласно настоящему изобретению может представлять собой штамм любого типа, способный продуцировать целевой продукт, включая штаммы дикого типа и рекомбинантные штаммы. В качестве примера, клетку-хозяина получают из микроорганизмов, подходящих для ферментативного продуцирования целевых продуктов, таких как аминокислоты и органические кислоты, например, Enterobacterium, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacterium и Microbacterium, и т. д.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Enterobacterium или Corynebacterium, более предпочтительно Corynebacterium glutamicum, включая, не ограничиваясь перечисленным, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum B253, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 и производные штаммы, продуцирующие L-аминокислоты, полученные из штаммов, описанных выше.
В одном конкретном варианте осуществления Corynebacterium glutamicum подвергают следующей модификации: последовательность, кодирующую мутацию T311I, вводят в ген, кодирующий аспартаткиназу у Corynebacterium glutamicum, и вводят ген, кодирующий пируваткарбоксилазу, функционально лигированный с мутантом промотора гена пируваткарбоксилазы, описанным выше, для получения лизин-продуцирующего штамма; или экспрессионные кассеты глутаматкиназы, глутамат-5-полуальдегиддегидрогеназы и/или пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназы, в которые введена мутация G149K, функционально лигированные с мутантом промотора гена пируваткарбоксилазы согласно настоящему изобретению, интегрируют в ген пролиндегидрогеназы/пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназы с получением пролин-продуцирующего штамма; предпочтительно последовательность коровой области мутанта промотора гена пируваткарбоксилазы представляет собой CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG, более предпочтительно последовательность полноразмерного промотора представлена в SEQ ID NO: 20.
В других вариантах осуществления клетка-хозяин может также представлять собой другие типы штаммов, продуцирующих аминокислоты. «Штамм, продуцирующий аминокислоты», описанный в настоящем документе, относится к штамму, который может продуцировать аминокислоты при культивировании бактерий в среде, и может накапливать аминокислоты, или может секретировать аминокислоты в среду, т. е. могут быть получены внеклеточные свободные аминокислоты. Например, штаммы могут представлять собой встречающиеся в природе штаммы, продуцирующие аминокислоты, или сконструированные штаммы, продуцирующие аминокислоты, полученные путем генетических модификаций.
В качестве примера, клетка-хозяин представляет собой лизин-продуцирующую клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления лизин-продуцирующие клетки-хозяева могут дополнительно включать, не ограничиваясь перечисленным, один или более генов, выбранных из одного или более из следующих, экспрессия которых ослаблена или снижена:
a. ген adhE, кодирующий алкогольдегидрогеназу;
b. ген ackA, кодирующий ацетаткиназу;
c. ген pta, кодирующий фосфатацетилтрансферазу;
d. ген ldhA, кодирующий лактатдегидрогеназу;
e. ген focA, кодирующий транспортер формиата;
f. ген pflB, кодирующий пируватформиатлиазу;
g. ген poxB, кодирующий пируватоксидазу;
h. ген thrA, кодирующий бифункциональный фермент аспартаткиназа I/гомосериндегидрогеназа I;
i. ген thB, кодирующий гомосеринкиназу;
j. ген ldcC, кодирующий лизиндекарбоксилазу; и
h. ген cadA, кодирующий лизиндекарбоксилазу.
В некоторых вариантах осуществления лизин-продуцирующие клетки-хозяева могут дополнительно включать, не ограничиваясь перечисленным, один или более генов, выбранных из одного или более из следующих, которые характеризуются повышенной экспрессией или сверхэкспрессируются:
a. ген dapA, кодирующий дигидродипиридинсинтазу, которая ослабляет ингибирование по типу обратной связи лизином;
b. ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу;
c. ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу;
d. dapD, кодирующий тетрагидродипиколинатсукцинилазу, и dapE, кодирующий сукцинилдиаминопимелатдеацилазу;
e. ген asd, кодирующий аспартат-полуальдегиддегидрогеназу;
f. ген ppc, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу;
g. ген pntAB, кодирующий ниацинамидадениндинуклеотид-трансгидрогеназу; и
i. ген lysE, кодирующий белок-транспортер лизина.
В качестве примера, клетки-хозяева представляют собой треонин-продуцирующие клетки-хозяева. В некоторых вариантах осуществления треонин-продуцирующие клетки-хозяева могут представлять собой штаммы, экспрессирующие аспартаткиназу LysC, которая ослабляет ингибирование по типу обратной связи, на основе Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. В других вариантах осуществления треонин-продуцирующие клетки-хозяева могут также представлять собой другие типы штаммов, обладающие способностью продуцировать треонин.
В некоторых вариантах осуществления один или более генов, выбранных из группы, состоящей из следующих генов в треонин-продуцирующих клетках-хозяевах, характеризуются повышенной экспрессией или сверхэкспрессируются:
a. ген thrABC, кодирующий треониновый оперон;
b. ген hom, кодирующий гомосериндегидрогеназу, которая ослабляет ингибирование по типу обратной связи;
c. ген GAP, кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу;
d. ген pyc, кодирующий пируваткарбоксилазу;
e. ген mqo, кодирующий малат : хинон-оксидоредуктазу;
f. ген tkt, кодирующий транскетолазу;
g. ген gnd, кодирующий 6-фосфоглюконатдегидрогеназу;
h. ген thE, кодирующий экспортер треонина; и
i. ген eno, кодирующий енолазу.
В качестве примера, клетки-хозяева представляют собой изолейцин-продуцирующие клетки-хозяева. В некоторых вариантах осуществления изолейцин-продуцирующие клетки-хозяева представляют собой штаммы, которые продуцируют L-изолейцин путем замены аминокислоты в положении 323 гена ilvA в L-треониндегидратазе аланином. В других вариантах осуществления изолейцин-продуцирующие клетки-хозяева могут также представлять собой другие типы штаммов, обладающие способностью продуцировать изолейцин.
В качестве примера, клетки-хозяева представляют собой O-ацетилгомосерин-продуцирующие клетки-хозяева. В некоторых вариантах осуществления O-ацетилгомосерин-продуцирующие клетки-хозяева представляют собой штаммы, которые продуцируют O-ацетилгомосерин путем инактивации O-ацетилгомосерин(тиол)-лиазы. В других вариантах осуществления O-ацетилгомосерин-продуцирующие клетки-хозяева также могут представлять собой другие типы штаммов, обладающие способностью продуцировать O-ацетилгомосерин.
В качестве примера, клетки-хозяева представляют собой метионин-продуцирующие клетки-хозяева. В некоторых вариантах осуществления метионин-продуцирующие клетки-хозяева представляют собой штаммы, которые продуцируют метионин путем инактивации регуляторов транскрипции метионина и цистеина. В других вариантах осуществления метионин-продуцирующие клетки-хозяева могут также представлять собой другие типы штаммов, обладающие способностью продуцировать метионин.
В настоящем описании клетки-хозяева могут быть культивированы обычными методами, известными в данной области техники, включая, не ограничиваясь перечисленным, культуру в луночных планшетах, культуру при встряхивании, периодическую культуру, непрерывную культуру, культуру с подпиткой и т. д. Кроме того, различные условия культивирования, такие как температура, время и значение pH среды, могут быть надлежащим образом скорректированы в соответствии с фактическими ситуациями.
В четвертом аспекте настоящего изобретения предложено применение мутанта промотора гена пируваткарбоксилазы согласно первому аспекту, экспрессионной кассеты или экспрессионного вектора согласно второму аспекту или рекомбинантной клетки-хозяина согласно третьему аспекту для по меньшей мере одного из следующих (a) - (c):
(a) повышение уровня транскрипции гена или получение реагента или набора для повышения уровня транскрипции гена;
(b) получение белка или получение реагента или набора для применения при получении белка; и
(c) продуцирование целевого продукта или получение реагента или набора для применения при продуцировании целевого продукта.
В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой белок, связанный с синтезом целевого продукта, белок, связанный с мембранным транспортом, или белок, регулирующий экспрессию гена.
В некоторых вариантах осуществления целевой продукт может быть выбран из по меньшей мере одной аминокислоты и ее производных или может быть выбран из других видов соединений, которые могут быть биосинтетически доступны в данной области техники.
В качестве примера, аминокислоты и их производные включают, не ограничиваясь перечисленным, одну или комбинацию двух или более из следующих: пролин, гидроксипролин, лизин, глутаминовая кислота, аргинин, орнитин, глутамин, треонин, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, цистеин, метионин, аспарагиновая кислота, аспарагин, гистидин, фенилаланин, тирозин, триптофан, 5-аминолевулиновая кислота, 5-аминовалериановая кислота или производных любой из аминокислот, описанных выше.
В пятом аспекте настоящего изобретения предложен способ повышения экспрессии представляющего интерес гена, включающий функциональное лигирование мутанта промотора гена пируваткарбоксилазы с представляющим интерес геном, предпочтительно повышения экспрессии гена, связанного с синтезом целевого продукта с использованием щавелевоуксусной кислоты в качестве предшественника.
Термин «функционально лигированный» в контексте настоящего документа означает, что мутант промотора гена пируваткарбоксилазы согласно настоящему изобретению функционально лигирован с кодирующим геном для инициирования и опосредования транскрипции гена, что указывает на то, что мутант промотора гена пируваткарбоксилазы согласно настоящему изобретению функционально лигирован с кодирующим геном для контроля транскрипционной активности гена оперона. Способы функционального лигирования могут быть любыми способами, описанными в данной области техники. В случае применения мутанта промотора гена пируваткарбоксилазы согласно настоящему изобретению способ повышения экспрессии целевого гена согласно настоящему изобретению включает способы, обычно применяемые специалистом в данной области техники.
Например, кодирующий ген включает, не ограничиваясь перечисленным, кодирующий ген белка, связанного с синтезом целевого продукта, кодирующий ген белка, связанного с мембранным транспортом, или кодирующий ген белка, регулирующего экспрессию гена.
В некоторых вариантах осуществления мутант промотора гена пируваткарбоксилазы применяют для экспрессии гена, связанного с синтезом аминокислот. Например, мутант промотора гена пируваткарбоксилазы может применяться для экспрессии других генов в Corynebacterium или Enterobacterium, включая, не ограничиваясь перечисленным, гены, связанные с синтезом аминокислот, например, глутаматдегидрогеназу Gdh, ген пируваткарбоксилазы Pyc, аспартаткиназу LysC, треониновый оперон ThrABC, аспартат-полуальдегиддегидрогеназу Asd, аспартат-аммоний-лиазу AspB, гомосериндегидрогеназу Hom, гомосерин-O-ацетилтрансферазу MetX, дигидродипиколинатсинтазу DapA, дигидродипиколинатредуктазу DapB, мезо-диаминопимелатдегидрогеназу Ddh, глутаматкиназу ProB, глутамат-5-полуальдегиддегидрогеназу ProA, пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназу ProC, пролиндегидрогеназу/пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназу PutA, глутамил-тРНК-редуктазу HemA, фосфоенолпируваткарбоксилазу Ppc, белок-транспортер аминокислот, белок, ассоциированный с системой ptsG, пируватдегидрогеназу AceE, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу GapN или лизиндекарбоксилазу CadA или LdcC, и т. д.
В других вариантах осуществления мутант промотора гена пируваткарбоксилазы применяют для экспрессии гена, связанного с синтезом органических кислот, например, белков, связанных с синтезом лимонной кислоты, или генов для кодирования белков, связанных с синтезом янтарной кислоты.
В шестом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения белка, включающий стадию экспрессии белка с помощью экспрессионной кассеты или экспрессионного вектора согласно второму аспекту или рекомбинантной клетки-хозяина согласно третьему аспекту; необязательно, белок представляет собой белок, связанный с синтезом целевого продукта, белок, связанный с мембранным транспортом, или белок, регулирующий экспрессию гена; и
необязательно, способ дополнительно включает стадию выделения или очистки белка.
В седьмом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения целевого продукта, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей мутант промотора гена пируваткарбоксилазы согласно первому аспекту, который функционально лигирован с геном, связанным с синтезом целевого продукта, и сбор полученного целевого продукта.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения целевого продукта с щавелевоуксусной кислотой в качестве предшественника, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей мутант промотора гена пируваткарбоксилазы, который функционально лигирован с геном, связанным с синтезом целевого продукта с щавелевоуксусной кислотой в качестве предшественника, и сбор полученного целевого продукта. При этом целевой продукт с щавелевоуксусной кислотой в качестве предшественника включает, не ограничиваясь перечисленным, аминокислоты и их производные. Аминокислоты включают аминокислоты семейства аспарагиновой кислоты (лизин, треонин, изолейцин и метионин), аминокислоты семейства глутаминовой кислоты (глутаминовая кислота, пролин, гидроксипролин, аргинин и глутамин) и 5-аминолевулиновую кислоту, и т. д. Производные включают, не ограничиваясь перечисленным, пентандиамин, глутаровую кислоту и т. д. С помощью способов, раскрытых в настоящем документе, выход целевых продуктов с щавелевоуксусной кислотой в качестве предшественника в штаммах может быть увеличен. Более конкретно, ген, связанный с синтезом целевого продукта с щавелевоуксусной кислотой в качестве предшественника, выбран из группы, состоящей из: гена pyc, гена gdh, гена lysC, гена thrABC, гена asd, гена aspB, гена hom, гена metX, гена dapA, гена dapB, гена ddh, гена proB, гена proA, гена proC, гена putA, гена hemA, гена ppc, гена lysE, гена ptsG, гена ptsI, гена aceE, гена gapN, гена cadA, гена ldcC и т. д.
Способ получения целевого продукта с щавелевоуксусной кислотой в качестве предшественника согласно настоящему изобретению представляет собой способ, обычно используемый специалистом в данной области техники, основанный на применении мутанта промотора гена пируваткарбоксилазы, и при этом способ включает стадию извлечения целевого продукта из клетки или культурального раствора. Способ извлечения целевого продукта из клетки или среды хорошо известен в данной области техники и включает, не ограничиваясь перечисленным, фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию и ВЭЖХ.
Настоящее изобретение обеспечивает следующие преимущества: молекула нуклеиновой кислоты с повышенной промоторной активностью, предложенная в настоящем документе, проявляет более высокую промоторную активность, чем у дикого типа, и пригодна для экспрессии целевого гена, в частности, экспрессии гена, связанного с продукцией аминокислот. Например, при функциональном лигировании с геном, связанным с синтезом целевого продукта, таким как ген pyc, можно повысить интенсивность экспрессии белков, связанных с синтезом целевого продукта, таких как пируваткарбоксилаза, тем самым повышая эффективность продукции аминокислот рекомбинантными штаммами и их производными, и т. д., поэтому он имеет относительно высокое практическое значение.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
ФИГ. 1. Карта плазмидного вектора pEC-XK99E-Ppyc-rfp.
ФИГ. 2. Флуоресцентный скрининг планшета с мутантами промотора pyc.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения терминов
При использовании в сочетании с термином «включая» в формуле изобретения и/или описании, слово в единственном числе может относиться к «одному» или относиться к «одному или более», «по меньшей мере одному» и «одному или более чем одному».
В контексте формулы и описания изобретения подразумевается, что термин «включающий», «имеющий» или «содержащий» является включительным или неограничивающим и не исключает дополнительные или не указанные элементы или способы и стадии.
Во всем документе заявки термин «приблизительно» означает, что значение включает ошибку или стандартное отклонение, вызванное устройством или способом, используемыми для измерения значения.
Применительно к содержанию, раскрытому в настоящем документе, термин «или» определяется только как альтернативы и «и/или», но термин «или», используемый в настоящем документе, относится к «и/или», если явно не указано, что он относится только к альтернативе или взаимному исключению между альтернативами.
Выбранный/необязательный/предпочтительный «числовой диапазон» при использовании в формуле или описании изобретения включает не только числовые конечные точки на обоих концах диапазона, но и все натуральные числа, попадающие между вышеуказанными числовыми конечными точками в отношении этих числовых конечных точек.
В контексте настоящего документа термин «молекула нуклеиновой кислоты» или «полинуклеотид» относится к полимеру, состоящему из нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты или полинуклеотид может быть в форме отдельного фрагмента или может быть составной частью более крупной структуры нуклеотидной последовательности, которая получена из нуклеотидной последовательности, которая была выделена по меньшей мере один раз по количеству или концентрации, и может быть распознана, подвергнута манипуляциям и может быть установлена ее последовательность, а также нуклеотидная последовательность, стандартным молекулярно-биологическим методом (например, с использованием вектора клонирования). Когда нуклеотидная последовательность представлена последовательностью ДНК (т. е. A, T, G, C), она также включает последовательность РНК (т. е. A, U, G, C), где «U» заменяет «T». Другими словами, «полинуклеотид» относится к нуклеотидному полимеру, выбитому из дополнительного нуклеотида (отдельному фрагменту или целому фрагменту), или может быть составной частью или компонентом более крупной нуклеотидной структуры, такой как экспрессионный вектор или полицистронная последовательность. Полинуклеотиды включают последовательности ДНК, РНК и кДНК (комплементарная ДНК).
В контексте настоящего документа термины «целевой ген» и «представляющий интерес ген» могут быть использованы взаимозаменяемо.
В контексте настоящего документа термин «дикий тип» относится к объекту, который встречается в природе. Например, полипептид или полинуклеотидная последовательность, присутствующие в организме, которые могут быть выделены из одного источника в природе и не были намеренно модифицированы человеком в лаборатории, являются встречающимися в природе. В контексте настоящего документа термины «встречающийся в природе» и «дикий тип» являются синонимами.
В контексте настоящего документа термины «идентичность последовательностей» и «процентная идентичность» относятся к проценту нуклеотидов или аминокислот, которые являются одинаковыми (т. е. идентичными) в двух или более полинуклеотидах или полипептидах. Идентичность последовательностей между двумя или более полинуклеотидами или полипептидами может быть определена путем выравнивания нуклеотидных последовательностей полинуклеотидов или аминокислотных последовательностей полипептидов и оценки количества положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки в выровненных полинуклеотидах или полипептидах идентичны, и сравнения количества этих положений с количеством положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки в выровненных полинуклеотидах или полипептидах отличаются. Полинуклеотиды могут отличаться в одном положении, например, содержащем другой нуклеотид (т. е. замену или мутацию), или делецией нуклеотида (т. е. инсерцией или делецией нуклеотида в одном или двух полинуклеотидах). Полипептиды могут отличаться в одном положении, например, содержащем другую аминокислоту (т. е. замену или мутацию), или делецией аминокислоты (т. е. инсерцией или делецией аминокислоты в одном или двух полипептидах). Идентичность последовательностей может быть рассчитана путем деления количества положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки идентичны, на общее количество нуклеотидных или аминокислотных остатков в полинуклеотидах или полипептидах. Например, процент идентичности может быть рассчитан путем деления количества положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки идентичны, на общее количество нуклеотидных или аминокислотных остатков в полинуклеотидах или полипептидах и умножения результата на 100.
В некоторых вариантах осуществления две или более последовательностей или подпоследовательностей при сравнении и выравнивании при максимальном соответствии алгоритмом выравнивания последовательностей или путем измерения посредством визуального контроля обладают по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% «идентичностью последовательностей» или «процентной идентичностью» нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность по существу идентична по всей длине одного или обоих сравниваемых биополимеров (например, полинуклеотидов).
В контексте настоящего документа термин «комплементарный» относится к гибридизации или спариванию оснований между нуклеотидами и нуклеотидами, например, между двумя цепями двухцепочечной молекулы ДНК или между олигонуклеотидным праймером и сайтом связывания праймера на одноцепочечном нуклеотиде, подлежащем секвенированию или амплификации.
В контексте настоящего документа термин «высокожесткие условия» означает, что после стандартных процедур блоттинга ДНК зонд длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительно гибридизуется или гибридизуется в течение 12-24 часов при 42 °C в 5X SSPE (солевой фосфат натрия-ЭДТА), 0,3% SDS (додецилсульфат натрия), 200 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК сперматозоида лосося и 50% формамида. Наконец, векторный материал промывают три раза при 65 °С с 2X SSC и 0,2% SDS, каждый раз в течение 15 мин.
В контексте настоящего документа термин «очень высокожесткие условия» означает, что после стандартных процедур блоттинга ДНК зонд длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительно гибридизуется или гибридизуется в течение 12-24 часов при 42 °C в 5X SSPE (солевой фосфат натрия-ЭДТА), 0,3% SDS, 200 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК сперматозоида лосося и 50% формамида. Наконец, векторный материал промывают три раза при 70 °С с 2X SSC и 0,2% SDS, каждый раз в течение 15 мин.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такие же значения, которые обычно подразумеваются специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые методы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы для реализации или тестирования настоящего изобретения, методы и материалы, описанные в настоящем документе, являются предпочтительными.
Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано со ссылкой на конкретные примеры. Следует иметь в виду, что эти примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Экспериментальные методики и экспериментальные методы, используемые в примерах, если не указано иное, представляют собой все обычные методики и методы, например, экспериментальные методы, для которых в следующих примерах не указаны конкретные условия, обычно проводили в соответствии с обычными условиями, такими как условия, описанные Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), или условиями, которые рекомендованы производителями. Все материалы, реагенты и т. д., использованные в примерах, если не указано иное, являются коммерчески доступными.
Пример 1. Конструирование плазмиды, характеризующей силу промотора гена pyc Corynebacterium glutamicum
Чтобы охарактеризовать силу промотора гена pyc Corynebacterium glutamicum, в настоящем изобретении сначала сконструировали характеризующий вектор, и на основе каркаса плазмиды pEC-XK99E 60 аминокислот на N-конце гена pyc, C-пептид и ген красного флуоресцентного белка были экспрессированы промотором гена pyc. На основе раскрытой геномной последовательности и информации об аннотации гена pyc Corynebacterium glutamicum ATCC13032 были сконструированы праймеры pyc-F/R и был получен фрагмент ДНК размером 180 п. о. промотора гена pyc и N-конца путем ПЦР-амплификации с использованием генома ATCC13032 в качестве матрицы. Плазмиду pEC-XK99E-rfp[3], описанную в литературе, использовали в качестве матрицы, а pEC-F/R - в качестве праймеров для амплификации фрагмента ДНК каркаса плазмиды pEC-XK99E, С-пептида и гена красного флуоресцентного белка. Два вышеуказанных фрагмента лигировали с помощью набора для одностадийного клонирования от Vazyme (Vazyme’s One Step Cloning Kit) с получением характеризующего вектора pEC-XK99E-Ppyc-rfp. Карта плазмидного вектора была такой, как показано на ФИГ. 1. Последовательности праймеров, как использовано выше, были перечислены в таблице 1.
Таблица 1 | ||
Праймер | Нуклеотидная последовательность | SEQ ID NO: |
pyc-F | CCTGATGCGGTATTTTCTCCGAAAACCCAGGATTGCTTTGTG | SEQ ID NO: 22 |
pyc-R | GCGGACAGCTTCAGAAGCAAAAG | SEQ ID NO: 23 |
pEC-F | TTGCTTCTGAAGCTGTCCGCGGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCGGCGGTGGCTCTGCTTCCTCCGAAGACGTTATCAAAG | SEQ ID NO: 24 |
pEC-R | GGAGAAAATACCGCATCAGGC | SEQ ID NO: 25 |
Пример 2. Скрининг и характеристика силы мутантов промотора гена pyc Corynebacterium glutamicum
(1) Конструирование библиотеки мутантов промотора гена pyc Corynebacterium glutamicum
Согласно настоящему изобретению были выполнены мутации коровой области промотора гена pyc Corynebacterium glutamicum:
«», где подчеркнутые части были основными последовательностями области -35 и области -10 промотора. Согласно настоящему изобретению были выполнены мутации соответствующих положений вышеуказанной коровой области с получением «». Два фрагмента плазмиды амплифицировали с использованием праймеров pyc-M1/ M2 и pyc-M3/M4 соответственно и лигировали с помощью набора для одностадийного клонирования от Vazyme. Все полученные клонированные бактерии собирали и экстрагировали плазмиды с получением библиотеки мутантов промотора гена pyc. Вышеуказанную библиотеку и контроль дикого типа pEC-XK99E-Ppyc-rfp, полученный в примере 1, трансформировали в Corynebacterium glutamicum ATCC13032 соответственно и наносили на планшет TSB. Планшет, на котором были выращены сотни клонов, был сфотографирован для определения флуоресценции с помощью системы флуоресцентной визуализации. Мутанты с улучшенной интенсивностью экспрессии предварительно подвергали скринингу в соответствии с яркостью флуоресценции клонов. Ингредиенты (г/л) среды планшета TSB были следующими: глюкоза, 5 г/л; сухие дрожжи, 5 г/л; соевый пептон, 9 г/л; мочевина, 3 г/л; янтарная кислота, 0,5 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,1 г/л; биотин, 0,01 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; MOPS (3-морфолинопропансульфоновая кислота), 20 г/л; и порошок агара, 15 г/л. Согласно настоящему изобретению был выполнен первоначальный скрининг на более чем 10000 клонов, и, как показано на ФИГ. 2, было получено приблизительно 30 мутантов с повышенной интенсивностью флуоресценции. Последовательности праймеров, использованных выше, были перечислены в таблице 2.
Таблица 2 | ||
Праймер | Нуклеотидная последовательность | SEQ ID NO: |
pyc-M1 | CCCGAAAACATTGAGAGGAAAACAAAAACNNNNNNTTGATTNNNNNNNNNNNNNNNTANNATNNNNNNACGCAGTGACTGCTATCACCC | SEQ ID NO: 26 |
pyc-M2 | AACCTTCCATACGAACTTTGAAACG | SEQ ID NO: 27 |
pyc-M3 | CAAAGTTCGTATGGAAGGTTCCG | SEQ ID NO: 28 |
pyc-M4 | TTCCTCTCAATGTTTTCGGGC | SEQ ID NO: 29 |
(2) Скрининг библиотеки мутантов промотора гена pyc Corynebacterium glutamicum
Все мутанты с повышенной интенсивностью флуоресценции, наблюдаемой в планшете, как описано выше, культивировали в 96-луночном планшете, чтобы охарактеризовать силу промоторов. Ингредиенты (г/л) жидкой среды TSB были следующими: глюкоза, 5 г/л; сухие дрожжи, 5 г/л; соевый пептон, 9 г/л; мочевина, 3 г/л; янтарная кислота, 0,5 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л;MgSO4·7H2O, 0,1 г/л; биотин, 0,01 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; и MOPS, 20 г/л. Штаммы, полученные из планшета, инокулировали зубочистками в 96-луночный планшет, содержащий 200 мкл жидкой среды TSB в каждой лунке. Для каждого штамма отбирали по три образца. Скорость вращения шейкера для планшетов составляла 800 об/мин. После культивирования при 30 °C в течение 24 часов определяли интенсивность флуоресценции штаммов и секвенировали штаммы с улучшенной интенсивностью флуоресценции по сравнению с контролем дикого типа. Результаты приведены в таблице 3. Некоторые из мутантов промотора имеют одинаковую последовательность. Наконец, согласно настоящему изобретению было успешно получило 20 различных мутантов промотора (нуклеотидные последовательности соответствующих мутированных промоторов были пронумерованы как SEQ ID NO: 1-20) с улучшенной интенсивностью экспрессии по сравнению с промотором дикого типа, и диапазон кратности увеличения составлял от 1,8 до 16,1 раза, что могло обеспечить элементы с повсеместной активностью для модификации экспрессии генов, таких как pyc.
Таблица 3 | ||||
Промотор № | Интенсивность флуоресценции (RFU/OD600) | Кратность увеличения по сравнению с диким типом | Последовательность коровой области промотора | SEQ ID NO: полной последовательности промотора |
Дикий тип | 208±3 | CGATGTTTGATTGGGGGAATCGGGGGTTACGATACTAGG | SEQ ID NO: 21 | |
Ppyc-1 | 578±13 | 1,8 | CTAATTTTGATTCGTACTGATTTCTGCTACGATGAGTCA | SEQ ID NO: 1 |
Ppyc-2 | 822±5 | 3,0 | GGATTGTTGATTTGAGCTTGATGAGCGTACAATCAACTT | SEQ ID NO: 2 |
Ppyc-3 | 833±7 | 3,0 | TTCTCCTTGATTGCGCCTTAACCGTGGTATGATTCGATA | SEQ ID NO: 3 |
Ppyc-4 | 1185±34 | 4,7 | ATTGATTTGATTGGAACCTTACTGTGCTATGATTTGGTA | SEQ ID NO: 4 |
Ppyc-5 | 1203±27 | 4,8 | TCGAGTTTGATTTCACAACGTGTGTGATAGGATATAATA | SEQ ID NO: 5 |
Ppyc-6 | 1208±28 | 4,8 | TTGCGTTTGATTAAAGTATGCAAGGGCTAGTATGGTGAT | SEQ ID NO: 6 |
Ppyc-7 | 1495±46 | 6,2 | ATCATTTTGATTCCGGCGCACATGTGGTAATATGGTATT | SEQ ID NO: 7 |
Ppyc-8 | 1498±23 | 6,2 | TCGCCATTGATTGCCCGCCATCCATGCTATAATCGGAAG | SEQ ID NO: 8 |
Ppyc-9 | 1544±25 | 6,4 | TTCCGCTTGATTGTGGCCATAGTATGATATTATTAATTA | SEQ ID NO: 9 |
Ppyc-10 | 1776±127 | 7,5 | CGGATCTTGATTTTATGATGGGTATTGTATAATCTTGGT | SEQ ID NO: 10 |
Ppyc-11 | 1819±14 | 7,7 | CGGATATTGATTTGGCCGGTGTTGTGGTAGTATCGTGTT | SEQ ID NO: 11 |
Ppyc-12 | 1834±67 | 7,8 | AGGGGTTTGATTGGCCGCTCGGTGTGTTATCATGGAGAG | SEQ ID NO: 12 |
Ppyc-13 | 2066±15 | 8,9 | GAGTTGTTGATTTCGTTGGTGCACGTATACAATGGTTTT | SEQ ID NO: 13 |
Ppyc-14 | 2248±142 | 9,8 | CTTGGCTTGATTTTTGTTTGAGGGTTGTATAATGTTATT | SEQ ID NO: 14 |
Ppyc-15 | 2305±87 | 10,1 | GACTAGTTGATTTCCGCCCTTGGTTGATATTATGCTTGA | SEQ ID NO: 15 |
Ppyc-16 | 2725±160 | 12,1 | ATCCGCTTGATTTAGGCGTACGTTTAATAGTATATTGAA | SEQ ID NO: 16 |
Ppyc-17 | 2987±103 | 13,4 | CGGGGCTTGATTTCCTTGTCGTGGCGTTATTATAATGGA | SEQ ID NO: 17 |
Ppyc-18 | 3093±159 | 13,9 | ATGGAGTTGATTATACGATACTACAGATACTATACTGGT | SEQ ID NO: 18 |
Ppyc-19 | 3382±211 | 15,3 | CCGTAGTTGATTGACTTGGGCAGTATATAGTATAATGAA | SEQ ID NO: 19 |
Ppyc-20 | 3560±202 | 16,1 | CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG | SEQ ID NO: 20 |
Пример 3. Применение мутантов промотора гена pyc Corynebacterium glutamicum для получения целевых продуктов
(1) Конструирование рекомбинантного вектора мутанта промотора гена pyc Corynebacterium glutamicum
Основываясь на известной геномной последовательности Corynebacterium glutamicum ATCC13032, восходящие и нисходящие гомологичные плечи мутантов промотора Ppyc-1, Ppyc-9, Ppyc-16 и Ppyc-20 подвергали ПЦР-амплификации с использованием генома ATCC13032 в качестве матрицы и с использованием pyc-UF/ pyc-UR1 и pyc-DF1/ pyc-DR, pyc-UF/ pyc-UR9 и pyc-DF9/ pyc-DR, pyc-UF/ pyc-UR16 и pyc-DF16/ pyc-DR, и pyc-UF/ pyc-UR20 и pyc-DF20/ pyc-DR в качестве праймеров, соответственно; и в то же время каркас pK18mobsacB амплифицировали с использованием pK18-1/2 в качестве праймеров. Вышеуказанные ПЦР-фрагменты выделяли и затем лигировали с помощью набора для одностадийного клонирования от Vazyme, и получали рекомбинантные векторы pK18- Ppyc-1, pK18- Ppyc-9, pK18- Ppyc-16 и pK18- Ppyc-20 с мутированными промоторами, соответственно. Последовательности праймеров, использованных выше, были перечислены в таблице 4.
Таблица 4 | ||
Праймер | Нуклеотидная последовательность | SEQ ID NO: |
pyc-UF | CAGGAAACAGCTATGACATGGTATCGCCATGTATCACGCACTC | SEQ ID NO: 30 |
pyc-UR1 | TCAGTACGAATCAAAATTAGGTTTTTGTTTTCCTCTCAATGTTTTC | SEQ ID NO: 31 |
pyc-UR9 | ATGGCCACAATCAAGCGGAAGTTTTTGTTTTCCTCTCAATGTTTTC | SEQ ID NO: 32 |
pyc-UR16 | TACGCCTAAATCAAGCGGATGTTTTTGTTTTCCTCTCAATGTTTTC | SEQ ID NO: 33 |
pyc-UR20 | TATCTTACAATCAAGGCCCGGTTTTTGTTTTCCTCTCAATGTTTTC | SEQ ID NO: 34 |
pyc-DF1 | CTAATTTTGATTCGTACTGATTTCTGCTACGATGAGTCAACGCAGTGACTGCTATCACCC | SEQ ID NO: 35 |
pyc-DF9 | TTCCGCTTGATTGTGGCCATAGTATGATATTATTAATTAACGCAGTGACTGCTATCACCC | SEQ ID NO: 36 |
pyc-DF16 | ATCCGCTTGATTTAGGCGTACGTTTAATAGTATATTGAAACGCAGTGACTGCTATCACCC | SEQ ID NO: 37 |
pyc-DF20 | CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAGACGCAGTGACTGCTATCACCC | SEQ ID NO: 38 |
pyc-DR | TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTAATTTGCGAAGCTCATCAGGTG | SEQ ID NO: 39 |
pK18-1 | GCACTGGCCGTCGTTTTAC | SEQ ID NO: 40 |
pK18-2 | CATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG | SEQ ID NO: 41 |
(2) Конструирование мутантов промотора гена pyc лизин-продуцирующего штамма Corynebacterium glutamicum
Рекомбинантные векторы pK18- Ppyc-1, pK18- Ppyc-9, pK18- Ppyc-16 и pK18- Ppyc-20, как сконструировано выше, трансформировали в лизин-продуцирующий штамм SCgL30 (в котором Thr в положении 311 аспартаткиназы Corynebacterium glutamicum ATCC13032 был мутирован в Ile [4]) Corynebacterium glutamicum, соответственно. Штамм наносили на твердую среду LBHIS, содержащую 5 г/л глюкозы и 25 мкг/мл канамицина, и культивировали при 30 °С с получением первых рекомбинантных трансформантов. Правильные первые рекомбинантные трансформанты инокулировали в среду LB, содержащую 5 г/л глюкозы соответственно, и культивировали в течение ночи. Затем 1% культуры переносили в среду LB, содержащую 100 г/л сахарозы, и культивировали в течение ночи при 30 °С, а затем наносили соответственно на твердую среду LB, содержащую 100 г/л сахарозы, для скрининга. Проводили секвенирование для подтверждения получения штаммов SCgL33, SCgL34, SCgL35 и SCgL36 с мутированными промоторами pyc, соответственно.
(3) Оценка продуктивности лизина у мутантов промотора гена pyc в лизин-продуцирующем штамме Corynebacterium glutamicum
Чтобы проверить влияние применения мутации промотора pyc в Corynebacterium glutamicum на продуцирование лизина штаммами, были проведены испытания на ферментацию в SCgL30, SCgL33, SCgL34, SCgL35 и SCgL36, соответственно. Ингредиенты ферментационной среды были следующими: глюкоза, 80 г/л; сухие дрожжи, 1 г/л; соевый пептон, 1 г/л; NaCl, 1 г/л; сульфат аммония, 1 г/л; мочевина, 8 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,45 г/л; FeSO4·7H2O, 0,05 г/л; биотин, 0,4 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; MOPS, 40 г/л; и исходный pH 7,2. Штаммы сначала инокулировали в жидкую среду TSB и культивировали в течение 8 ч. Культуры инокулировали в виде инокулянтов в 24-луночный планшет, содержащий 800 мкл ферментационной среды в каждой лунке с начальным значением OD600, контролируемым при приблизительно 0,1, и культивировали при 30 °С в течение 20 ч. Скорость вращения шейкера для планшетов составляла 800 об/мин. Для каждого штамма отбирали по три образца. После ферментации измеряли выходы лизина. Результаты приведены в таблице 5. Все выходы лизина штаммов после мутации промотора pyc были значительно увеличены, и увеличение становилось более значительным по мере увеличения силы промотора.
Таблица 5 | |
Штамм | Выход лизина (г/л) |
SCgL30 | 1,67±0,03 |
SCgL33 | 1,77±0,04 |
SCgL34 | 2,07±0,06 |
SCgL35 | 2,37±0,15 |
SCgL36 | 3,27±0,15 |
Пример 4. Применение мутантов промотора гена pyc Corynebacterium glutamicum для продуцирования пролина
(1) Применение Ppyc-20 в конструировании пролин-продуцирующих штаммов
В настоящем изобретении мутацию G149K вводили в штамм Corynebacterium glutamicum ATCC13032, и кодон мутировали из GGT в AAG, тем самым получая штамм SLCgP1. Штамм SLCgP1 дополнительно применяли в настоящем изобретении для интеграции экспрессионной кассеты, которая была сверхэкспрессирована с использованием промотора Ppyc-20, глутаматкиназы proBG149K, которая ослабляет ингибирование по типу обратной связи, глутамат-5-полуальдегиддегидрогеназы proA вместе с пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназой proC в ген putA, для получения пролин-продуцирующего штамма, обозначенного как штамм SLCgP2.
Штамм SLCgP2 был специально сконструирован следующим образом: 1) во-первых, конструировали промотор Ppyc-20 на плазмиде pEC-XK99E для экспрессии экспрессионной кассеты proBG149K, proA, наряду с proC. Фрагмент промотора Ppyc-20 амплифицировали с использованием генома штамма SCgL36 в качестве матрицы и pyc-a/b в качестве праймеров; фрагменты proBG149K, proA и proC амплифицировали с использованием генома штамма SLCgP1 в качестве матрицы и proB-1/2, proA-1/2 и proC-1/2 в качестве праймеров, соответственно; и в то же время каркас pEC-XK99E амплифицировали с использованием pEC-1/2 в качестве праймеров. Вышеуказанные 5 фрагментов лигировали с помощью набора для одностадийного клонирования от Vazyme с получением плазмиды pEC- proBG149KproAproC. 2) Конструирование рекомбинантного вектора, содержащего вышеуказанную экспрессионную кассету, вставленную в ген putA на хромосоме. Вышележащие и нижележащие гомологичные плечи, вставленные в ген putA, амплифицировали с использованием генома штамма SCgL36 в качестве матрицы и putA-1/2 и putA-3/4 в качестве праймеров, соответственно; фрагмент экспрессионной кассеты амплифицировали с использованием плазмиды pEC- proBG149KproAproC в качестве матрицы и ABC-F/R в качестве праймеров; и в то же время каркас pK18mobsacB амплифицировали с использованием pK18-1/2 в качестве праймеров. Вышеуказанные ПЦР-фрагменты лигировали с помощью набора для одностадийного клонирования от Vazyme с получением рекомбинантного вектора pK18-proBG149KproAproC. 3) Рекомбинантный вектор pK18-proBG149KproAproC трансформировали в штамм SLCgP1. Штамм наносили на твердую среду LBHIS, содержащую 5 г/л глюкозы и 25 мкг/мл канамицина, и культивировали при 30 °С с получением первых рекомбинантных трансформантов. Правильные первые рекомбинантные трансформанты инокулировали в среду LB, содержащую 5 г/л глюкозы соответственно, и культивировали в течение ночи. Затем 1% культуры переносили в среду LB, содержащую 100 г/л сахарозы, и культивировали в течение ночи при 30 °С, а затем наносили соответственно на твердую среду LB, содержащую 100 г/л сахарозы, для скрининга. Правильные мутанты подтверждали с помощью ПЦР со специфическими праймерами и секвенированием для получения штаммов SLCgP2, соответственно. Последовательности праймеров, использованных выше, были перечислены в таблице 6.
Таблица 6 | ||
Праймер | Нуклеотидная последовательность | SEQ ID NO: |
pEC-1 | GGAGAAAATACCGCATCAGGC | SEQ ID NO: 42 |
pEC-2 | CTGTTTTGGCGGATGAGAGAAG | SEQ ID NO: 43 |
pyc-a | CCTGATGCGGTATTTTCTCCGAAAACCCAGGATTGCTTTGTG | SEQ ID NO: 44 |
pyc-b | TTGGAGATGCGCTCACGCATTAGAGTAATTATTCCTTTCAACAAGAG | SEQ ID NO: 45 |
proB-1 | ATGCGTGAGCGCATCTCCAAC | SEQ ID NO: 46 |
proB-2 | TTACGCGCGGCTGGCGTAGTTG | SEQ ID NO: 47 |
proA-1 | ACTACGCCAGCCGCGCGTAAGCCTTTTATGGTGTGATCCGAC | SEQ ID NO: 48 |
proA-2 | TTAAGGCCTAATTTGTCCTGTGCC | SEQ ID NO: 49 |
proC-1 | CAGGACAAATTAGGCCTTAATTTGTCGTTTTGGGCCCCC | SEQ ID NO: 50 |
proC-2 | TCTCTCATCCGCCAAAACAGCTAGCGCTTTCCGAGTTCTTCAG | SEQ ID NO: 51 |
putA-1 | CAGGAAACAGCTATGACATGTTCTAGGGCATCGACGAACCAG | SEQ ID NO: 52 |
putA-2 | GAAATTGTTAAAAGCGCAGCGC | SEQ ID NO: 53 |
ABC-F | GCTGCGCTTTTAACAATTTCGAAAACCCAGGATTGCTTTGTG | SEQ ID NO: 54 |
ABC-R | TCGAAGCCGCACGTCATCTAG | SEQ ID NO: 55 |
putA-3 | TAGATGACGTGCGGCTTCGATCCGTGAACGCCTATCTGTACG | SEQ ID NO: 56 |
putA-4 | TGTAAAACGACGGCCAGTGCGATCGATTCCACGCCCAAAC | SEQ ID NO: 57 |
pK18-1 | GCACTGGCCGTCGTTTTAC | SEQ ID NO: 58 |
pK18-2 | CATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG | SEQ ID NO: 59 |
(2) Оценка продуктивности пролина у штаммов, модифицированных мутантом промотора Ppyc-20
Для проверки влияния применения мутанта промотора Ppyc-20 у Corynebacterium glutamicum на продукцию пролина штаммами проводили ферментационные тесты в SLCgP1 и SLCgP2 соответственно. Ингредиенты ферментационной среды были следующими: глюкоза, 72 г/л; сухие дрожжи, 1 г/л; соевый пептон, 1 г/л; NaCl, 1 г/л; сульфат аммония, 1 г/л; мочевина, 10 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,45 г/л; FeSO4·7H2O, 0,05 г/л; биотин, 0,4 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; MOPS, 40 г/л; и исходный pH 7,2. Штаммы сначала инокулировали в жидкую среду TSB и культивировали в течение 8 ч. Культуры инокулировали в виде инокулянтов в 24-луночный планшет, содержащий 800 мкл ферментационной среды в каждой лунке при количестве инокулянта 12 мкл, и культивировали при 30 °С в течение 18 ч. Скорость вращения шейкера для планшетов составляла 800 об/мин. Для каждого штамма отбирали по три образца. После ферментации измеряли выходы пролина. Результаты приведены в таблице 7. Выходы пролина у штаммов были значительно увеличены после того, как промотор Ppyc-20, экспрессирующий экспрессионную кассету proBG149K, proA вместе с proC был вставлен в хромосому, и SLCgP2 продемонстрировал увеличение на 77% по сравнению с SLCgP1.
Таблица 7 | |
Штамм | Выход пролина (г/л) |
SLCgP1 | 3,10±0,15 |
SLCgP2 | 5,48±0,23 |
Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что мутанты с усиленным промотором гена pyc могут применяться для экспрессии различных целевых генов Corynebacterium glutamicum и применены для получения различных продуктов. Во-первых, мутанты с усиленным промотором гена pyc могут применяться для усиления экспрессии непосредственно гена pyc в Corynebacterium glutamicum для повышения активности Pyc, тем самым усиливая синтез из пировиноградной кислоты до щавелевоуксусной кислоты, что может быть использовано для продуцирования целевых продуктов, зависящих от поступления щавелевоуксусной кислоты в качестве предшественника, включая биологическое продуцирование аминокислот с щавелевоуксусной кислотой в качестве основного метаболического предшественника, таких как аминокислоты семейства аспарагиновой кислоты (лизин, треонин, изолейцин и метионин), аминокислоты семейства глутаминовой кислоты (глутаминовая кислота, пролин, гидроксипролин, аргинин и глутамин) и 5-аминолевулиновая кислота. Настоящее изобретение подтвердило в примерах, что мутанты с усиленным промотором гена pyc могут применяться для продуцирования лизина в качестве аминокислоты семейства аспарагиновой кислоты и пролина в качестве аминокислоты семейства глутаминовой кислоты. Было проверено, что повышенная экспрессия и активность Pyc пригодны для продуцирования вышеуказанных продуктов, например: 1) Peters-Wendisch PG et al. сообщили, что сверхэкспрессия Pyc может улучшить выходы глутаминовой кислоты, лизина и треонина [5]; 2) Pyc является основным ферментом в Corynebacterium glutamicum для катализа продуцирования C4 щавелевоуксусной кислоты из C3 (PEP (фосфоенолпировиноградная кислота) или пировиноградная кислота), и сверхэкспрессия и повышенная активность Pyc являются важными целями для продуцирования аминокислот с щавелевоуксусной кислотой в качестве предшественника [6]; 3) в патентном источнике [7] раскрыто, что повышенная активность ферментов (фосфоенолпируваткарбоксилазы или пируваткарбоксилазы), которые облегчают синтез щавелевоуксусной кислоты, может улучшить выход 5-аминолевулиновой кислоты. Все мутанты промотора гена pyc в пируваткарбоксилазе Corynebacterium glutamicum в настоящем изобретении могут применяться для усиления экспрессии и активности Pyc. Следовательно, мутанты промотора гена pyc согласно настоящему изобретению также могут применяться для продуцирования 5-аминолевулиновой кислоты. Далее, примеры настоящего изобретения также демонстрируют, что мутанты с усиленным промотором гена pyc также могут применяться для экспрессии генов, таких как proB, proA и proC, что свидетельствует о том, что мутанты промотора гена pyc согласно настоящему изобретению имеют хорошую универсальность, которую можно использовать для экспрессии большего количества генов и, следовательно, продуцирования большего количества продуктов.
Цитируемые источники
[3] Wang, YC et al. Screening efficient constitutive promoters in Corynebacterium glutamicum based on time-series transcriptome analysis. Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(11):1760 - 1771.
[4] CN112877269A
[5] Peters-Wendisch P G, Schiel B, Wendisch V F, et al. Pyruvate carboxylase is a major bottleneck for glutamate and lysine production by Corynebacterium glutamicum. [J]. J Mol Microbiol Biotechnol, 2001, 3(2):295 - 300.
[6] Uwe Sauer, Bernhard J. Eikmanns. The PEP-pyruvate-oxaloacetate node as the switch point for carbon flux distribution in bacteria [M]// FEMS Microbiology Reviews.
[7] CN103981203B
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ТЯНЬЦЗИНЬ ИНСТИТЬЮТ ОФ ИНДАСТРИАЛ БАЙОТЕКНОЛОДЖИ, ЧАЙНИЗ
ЭКЭДЕМИ ОФ САЙЕНСИЗ
<120> МУТАНТ ПРОМОТОРА ГЕНА ПИРУВАТКАРБОКСИЛАЗЫ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130> 6A17-2163278RU
<150> CN202010696983.2
<151> 2020-07-20
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacct aattttgatt cgtactgatt
300
tctgctacga tgagtcaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 2
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacgg attgttgatt tgagcttgat
300
gagcgtacaa tcaacttacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 3
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaactt ctccttgatt gcgccttaac
300
cgtggtatga ttcgataacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 4
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacat tgatttgatt ggaaccttac
300
tgtgctatga tttggtaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 5
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 5
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaactc gagtttgatt tcacaacgtg
300
tgtgatagga tataataacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 6
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaactt gcgtttgatt aaagtatgca
300
agggctagta tggtgatacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 7
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 7
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacat cattttgatt ccggcgcaca
300
tgtggtaata tggtattacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 8
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 8
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaactc gccattgatt gcccgccatc
300
catgctataa tcggaagacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 9
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 9
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaactt ccgcttgatt gtggccatag
300
tatgatatta ttaattaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 10
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 10
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaaccg gatcttgatt ttatgatggg
300
tattgtataa tcttggtacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 11
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 11
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaaccg gatattgatt tggccggtgt
300
tgtggtagta tcgtgttacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 12
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 12
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacag gggtttgatt ggccgctcgg
300
tgtgttatca tggagagacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 13
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 13
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacga gttgttgatt tcgttggtgc
300
acgtatacaa tggttttacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 14
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 14
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacct tggcttgatt tttgtttgag
300
ggttgtataa tgttattacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 15
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 15
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacga ctagttgatt tccgcccttg
300
gttgatatta tgcttgaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 16
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 16
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacat ccgcttgatt taggcgtacg
300
tttaatagta tattgaaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 17
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 17
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaaccg gggcttgatt tccttgtcgt
300
ggcgttatta taatggaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 18
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 18
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaacat ggagttgatt atacgatact
300
acagatacta tactggtacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 19
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 19
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaaccc gtagttgatt gacttgggca
300
gtatatagta taatgaaacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 20
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 20
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaaccg ggccttgatt gtaagataag
300
acatttagta taattagacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 21
<211> 373
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 21
gaaaacccag gattgctttg tgcactcctg ggttttcact ttgttaagca gttttgggga
60
aaagtgcaaa gtttgcaaag tttagaaata ttttaagagg taagatgtct gcaggtggaa
120
gcgtttaaat gcgttaaact tggccaaatg tggcaacctt tgcaaggtga aaaactgggg
180
cggggttaga tcctgggggg tttatttcat tcactttggc ttgaagtcgt gcaggtcagg
240
ggagtgttgc ccgaaaacat tgagaggaaa acaaaaaccg atgtttgatt gggggaatcg
300
ggggttacga tactaggacg cagtgactgc tatcaccctt ggcggtctct tgttgaaagg
360
aataattact cta
373
<210> 22
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 22
cctgatgcgg tattttctcc gaaaacccag gattgctttg tg
42
<210> 23
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 23
gcggacagct tcagaagcaa aag
23
<210> 24
<211> 84
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 24
ttgcttctga agctgtccgc ggcggtggct ctggaggtgg tgggtccggc ggtggctctg
60
cttcctccga agacgttatc aaag
84
<210> 25
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 25
ggagaaaata ccgcatcagg c
21
<210> 26
<211> 89
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 26
cccgaaaaca ttgagaggaa aacaaaaacn nnnnnttgat tnnnnnnnnn nnnnnntann
60
atnnnnnnac gcagtgactg ctatcaccc
89
<210> 27
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 27
aaccttccat acgaactttg aaacg
25
<210> 28
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 28
caaagttcgt atggaaggtt ccg
23
<210> 29
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 29
ttcctctcaa tgttttcggg c
21
<210> 30
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 30
caggaaacag ctatgacatg gtatcgccat gtatcacgca ctc
43
<210> 31
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 31
tcagtacgaa tcaaaattag gtttttgttt tcctctcaat gttttc
46
<210> 32
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 32
atggccacaa tcaagcggaa gtttttgttt tcctctcaat gttttc
46
<210> 33
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 33
tacgcctaaa tcaagcggat gtttttgttt tcctctcaat gttttc
46
<210> 34
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 34
tatcttacaa tcaaggcccg gtttttgttt tcctctcaat gttttc
46
<210> 35
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 35
ctaattttga ttcgtactga tttctgctac gatgagtcaa cgcagtgact gctatcaccc
60
<210> 36
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 36
ttccgcttga ttgtggccat agtatgatat tattaattaa cgcagtgact gctatcaccc
60
<210> 37
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 37
atccgcttga tttaggcgta cgtttaatag tatattgaaa cgcagtgact gctatcaccc
60
<210> 38
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 38
cgggccttga ttgtaagata agacatttag tataattaga cgcagtgact gctatcaccc
60
<210> 39
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 39
tgtaaaacga cggccagtgc ctaatttgcg aagctcatca ggtg
44
<210> 40
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 40
gcactggccg tcgttttac
19
<210> 41
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 41
catgtcatag ctgtttcctg tgtg
24
<210> 42
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 42
ggagaaaata ccgcatcagg c
21
<210> 43
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 43
ctgttttggc ggatgagaga ag
22
<210> 44
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 44
cctgatgcgg tattttctcc gaaaacccag gattgctttg tg
42
<210> 45
<211> 47
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 45
ttggagatgc gctcacgcat tagagtaatt attcctttca acaagag
47
<210> 46
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 46
atgcgtgagc gcatctccaa c
21
<210> 47
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 47
ttacgcgcgg ctggcgtagt tg
22
<210> 48
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 48
actacgccag ccgcgcgtaa gccttttatg gtgtgatccg ac
42
<210> 49
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 49
ttaaggccta atttgtcctg tgcc
24
<210> 50
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 50
caggacaaat taggccttaa tttgtcgttt tgggccccc
39
<210> 51
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 51
tctctcatcc gccaaaacag ctagcgcttt ccgagttctt cag
43
<210> 52
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 52
caggaaacag ctatgacatg ttctagggca tcgacgaacc ag
42
<210> 53
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 53
gaaattgtta aaagcgcagc gc
22
<210> 54
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 54
gctgcgcttt taacaatttc gaaaacccag gattgctttg tg
42
<210> 55
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 55
tcgaagccgc acgtcatcta g
21
<210> 56
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 56
tagatgacgt gcggcttcga tccgtgaacg cctatctgta cg
42
<210> 57
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 57
tgtaaaacga cggccagtgc gatcgattcc acgcccaaac
40
<210> 58
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 58
gcactggccg tcgttttac
19
<210> 59
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 59
catgtcatag ctgtttcctg tgtg
24
<---
Claims (43)
1. Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы Corynebacterium glutamicum, где мутант обладает промоторной активностью и нуклеотидная последовательность мутанта в положениях, соответствующих положениям с 279 по 317 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 21, является следующей:
где N выбран из A, T, C или G;
где нуклеотидная последовательность мутанта не является CGATGTTTGATTGGGGGAATCGGGGGTTACGATACTAGG в положениях, соответствующих положениям с 279 по 317 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 21.
2. Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы по п. 1, где мутант обладает промоторной активностью, повышенной в от 1 до 17 раз или более по сравнению с промотором гена пируваткарбоксилазы, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.
3. Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы по п. 1 или 2, где нуклеотидная последовательность коровой области в положениях с 279 по 317 мутанта представляет собой одну из следующих последовательностей:
1) CTAATTTTGATTCGTACTGATTTCTGCTACGATGAGTCA;
2) GGATTGTTGATTTGAGCTTGATGAGCGTACAATCAACTT;
3) TTCTCCTTGATTGCGCCTTAACCGTGGTATGATTCGATA;
4) ATTGATTTGATTGGAACCTTACTGTGCTATGATTTGGTA;
5) TCGAGTTTGATTTCACAACGTGTGTGATAGGATATAATA;
6) TTGCGTTTGATTAAAGTATGCAAGGGCTAGTATGGTGAT;
7) ATCATTTTGATTCCGGCGCACATGTGGTAATATGGTATT;
8) TCGCCATTGATTGCCCGCCATCCATGCTATAATCGGAAG;
9) TTCCGCTTGATTGTGGCCATAGTATGATATTATTAATTA;
10) CGGATCTTGATTTTATGATGGGTATTGTATAATCTTGGT;
11) CGGATATTGATTTGGCCGGTGTTGTGGTAGTATCGTGTT;
12) AGGGGTTTGATTGGCCGCTCGGTGTGTTATCATGGAGAG;
13) GAGTTGTTGATTTCGTTGGTGCACGTATACAATGGTTTT;
14) CTTGGCTTGATTTTTGTTTGAGGGTTGTATAATGTTATT;
15) GACTAGTTGATTTCCGCCCTTGGTTGATATTATGCTTGA;
16) ATCCGCTTGATTTAGGCGTACGTTTAATAGTATATTGAA;
17) CGGGGCTTGATTTCCTTGTCGTGGCGTTATTATAATGGA;
18) ATGGAGTTGATTATACGATACTACAGATACTATACTGGT;
19) CCGTAGTTGATTGACTTGGGCAGTATATAGTATAATGAA; или
20) CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG.
4. Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы по любому из пп. 1-3, где нуклеотидная последовательность мутанта представлена в любой из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 20.
5. Экспрессионная кассета, содержащая мутант промотора гена пируваткарбоксилазы по любому из пп. 1-4.
6. Экспрессионный вектор, содержащий мутант промотора гена пируваткарбоксилазы по любому из пп. 1-4 или экспрессионную кассету по п. 5.
7. Рекомбинантная клетка-хозяин для ферментативного продуцирования целевых продуктов, содержащая мутант промотора гена пируваткарбоксилазы по любому из пп. 1-4, экспрессионную кассету по п. 5 или экспрессионный вектор по п. 6.
8. Рекомбинантная клетка-хозяин по п. 7, где клетка-хозяин принадлежит к роду Enterobacter или роду Corynebacterium, предпочтительно роду Corynebacterium, еще более предпочтительно Corynebacterium glutamicum, более конкретно Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum B253, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 и их производным штаммам.
9. Применение мутанта промотора гена пируваткарбоксилазы по любому из пп. 1-4, экспрессионной кассеты по п. 5, экспрессионного вектора по п. 6 или рекомбинантной клетки-хозяина по п. 7 или 8 для повышения уровня транскрипции гена или получения реагента или набора для повышения уровня транскрипции гена.
10. Способ повышения экспрессии целевого гена, включающий функциональное лигирование мутанта промотора гена пируваткарбоксилазы по любому из пп. 1-4 с целевым геном или целевой РНК.
11. Способ по п. 10, где целевая РНК включает по меньшей мере одну из тРНК (транспортная РНК) или sРНК (растворимая РНК).
12. Способ по п. 10, где целевой ген включает по меньшей мере один из кодирующего гена белка, связанного с синтезом целевого продукта, кодирующего гена белка, регулирующего экспрессию гена, или кодирующего гена белка, связанного с мембранным транспортом.
13. Способ по п. 10, где целевой ген включает по меньшей мере один из следующих кодирующих генов ферментов: ген pyc пируваткарбоксилазы, ген gdh глутаматдегидрогеназы, ген lysC аспартаткиназы, ген thrABC треонинового оперона, ген asd аспартат-полуальдегиддегидрогеназы, ген aspB аспартат-аммоний-лиазы, ген hom гомосериндегидрогеназы, ген metX гомосерин-O-ацетилтрансферазы, ген dapA дигидродипиколинатсинтазы, ген dapB дигидродипиколинатредуктазы, ген ddh мезо-диаминопимелатдегидрогеназы, ген proB глутаматкиназы, ген proA глутамат-5-полуальдегиддегидрогеназы, ген proC пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназы, ген putA пролиндегидрогеназы/пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназы, ген hemA глутамил-тРНК-редуктазы, ген ppc фосфоенолпируваткарбоксилазы, ген lysE белка-транспортера аминокислот, кодирующий ген, ассоциированный с системой ptsG, ген aceE пируватдегидрогеназы, ген gapN глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ген cadA/ldcC лизиндекарбоксилазы.
14. Способ получения белка, включающий стадию экспрессии белка с помощью экспрессионной кассеты по п. 5, экспрессионного вектора по п. 6 или рекомбинантной клетки-хозяина по п. 7 или 8.
15. Способ по п. 14, где белок представляет собой белок, связанный с синтезом целевого продукта, белок, связанный с мембранным транспортом, или белок, регулирующий экспрессию гена.
16. Способ по п. 14 или 15, где способ дополнительно включает стадию выделения или очистки белка.
17. Способ получения целевого продукта, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей мутант промотора гена пируваткарбоксилазы по любому из пп. 1-4, который функционально лигирован с геном, связанным с синтезом целевого продукта, и сбор полученного целевого продукта.
18. Способ по п. 17, где целевой продукт представляет собой аминокислоту.
19. Способ по п. 17, где ген, связанный с синтезом целевого продукта, представляет собой ген, связанный с синтезом аминокислоты или ее производного.
20. Способ по п. 19, где аминокислота и ее производное выбраны из одной или комбинации двух или более из: пролина, гидроксипролина, лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, орнитина, глутамина, треонина, глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, цистеина, метионина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гистидина, фенилаланина, тирозина, триптофана, 5-аминолевулиновой кислоты или производных любой из аминокислот, описанных выше.
21. Способ по п. 17, где в качестве предшественника целевого продукта используется щавелевоуксусная кислота; предпочтительно целевой продукт, в качестве предшественника которого используется щавелевоуксусная кислота, включает одно или более из: лизина, треонина, изолейцина, метионина, глутаминовой кислоты, пролина, гидроксипролина, аргинина, глутамина, 5-аминолевулиновой кислоты, пентандиамина, 5-аминовалериановой кислоты или производного любого из вышеперечисленных.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010696983.2 | 2020-07-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2812048C1 RU2812048C1 (ru) | 2024-01-22 |
RU2812048C9 true RU2812048C9 (ru) | 2024-03-15 |
Family
ID=
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1425071A (zh) * | 2000-01-07 | 2003-06-18 | 金克克国际有限公司 | 突变的aprE启动子 |
RU2405040C2 (ru) * | 2006-02-02 | 2010-11-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислоты |
US20110129885A1 (en) * | 2007-04-20 | 2011-06-02 | Organo-Balance Gmbh | Microorganism for the production of succinic acid |
US20180362991A1 (en) * | 2015-12-07 | 2018-12-20 | Zymergen Inc. | Promoters from corynebacterium glutamicum |
CN110951662A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-03 | 新疆梅花氨基酸有限责任公司 | 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用 |
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1425071A (zh) * | 2000-01-07 | 2003-06-18 | 金克克国际有限公司 | 突变的aprE启动子 |
RU2405040C2 (ru) * | 2006-02-02 | 2010-11-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислоты |
US20110129885A1 (en) * | 2007-04-20 | 2011-06-02 | Organo-Balance Gmbh | Microorganism for the production of succinic acid |
US20180362991A1 (en) * | 2015-12-07 | 2018-12-20 | Zymergen Inc. | Promoters from corynebacterium glutamicum |
CN110951662A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-03 | 新疆梅花氨基酸有限责任公司 | 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Kim et al. Plant Molecular Biology, 24: 105-117, 1994. См. стр. 108, таблица 1; стр. 109, таблица 2. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2022017221A1 (zh) | 谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体及其应用 | |
WO2022199460A1 (zh) | 一种天冬氨酸激酶基因表达调控序列及其应用 | |
JP2020524492A (ja) | Corynebacterium glutamicum由来のプロモーターおよび補助遺伝子発現の制御におけるその使用 | |
WO2022037338A1 (zh) | 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产氨基酸中的应用 | |
US20230272366A1 (en) | Mutant of Pyruvate Carboxylase Gene Promoter and Use Thereof | |
WO2023284419A1 (zh) | 丙酮酸脱氢酶的突变体及其用于生产l-氨基酸的方法 | |
US20230242952A1 (en) | Microorganism that produces lysine and method for producing lysine | |
EP3498853A1 (en) | Method for the fermentative production of l-lysine | |
RU2812048C9 (ru) | Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы и его применение | |
RU2812048C1 (ru) | Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы и его применение | |
CN113278620B (zh) | 一种突变的高渗诱导型启动子PproP及其应用 | |
CN113201539B (zh) | 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途 | |
US20240084314A1 (en) | Mdh gene-based polynucleotide having promoter activity and use thereof | |
CN115449519B (zh) | 基于dapB基因的具有启动子活性的多核苷酸及其用途 | |
CN114478724B (zh) | 一种ramB突变体及其构建赖氨酸生产菌株的方法 | |
CN115948396B (zh) | 谷氨酸脱氢酶启动子突变体及其应用 | |
CN115506035B (zh) | 启动子突变体文库的构建方法及启动子突变体文库 | |
RU2797843C1 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий лизин, и способ продуцирования лизина | |
RU2797843C9 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий лизин, и способ продуцирования лизина | |
CN115927325B (zh) | 柠檬酸合酶启动子突变体及其应用 | |
EP4293115A1 (en) | Polynucleotide having promoter activity and use thereof in production of traget compounds | |
CN115490761A (zh) | 基于赖氨酸外排蛋白构建的重组微生物及生产赖氨酸的方法 | |
CN116004501A (zh) | Nadp-铁氧还蛋白还原酶突变体及其在生产谷氨酸中的应用 | |
CN116144564A (zh) | 一种谷氨酸生产菌株的构建方法及其在生产谷氨酸中的用途 | |
CN115725532A (zh) | 一种生物素合酶突变体及其在构建谷氨酸生产菌株中的应用 |