CN115725532A - 一种生物素合酶突变体及其在构建谷氨酸生产菌株中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及突变型生物素合酶及其在提高L‑谷氨酸产量和转化率中的应用。该突变体在对应于SEQ ID NO:3所示的生物素合酶或其同源酶的基础上，其第293位的亮氨酸被苯丙氨酸取代。所述突变体能够明显提高L‑谷氨酸产量及糖酸转化率，在L‑谷氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景，因此可以降低谷氨酸的生产成本，为大规模生产提供了新的策略，具有较大应用价值。

Description

一种生物素合酶突变体及其在构建谷氨酸生产菌株中的应用

技术领域

本发明涉及微生物与生物技术领域，具体涉及一种突变型生物素合酶，以及该突变体构建L-谷氨酸生产菌株，生产L-谷氨酸的方法。

背景技术

L-谷氨酸是世界第一大氨基酸产品，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应，主要用于生产味精、鸡精等调味料以及各种食品，并在医药、化工、畜牧等领域应用广泛。由于需求量大，产能高，L-谷氨酸的工业发酵一直是我国重要的发酵产业之一。

当前，L-谷氨酸的生产主要采用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）来生产。谷氨酸棒杆菌是一种生物素营养缺陷型菌株，不具备完整的生物素合成通路，基因组中只存在参与生物素环结构组装的三种酶——BioA、BioD和BioB，因此只能利用外源生物素或脱硫生物素等中间代谢物维持细胞正常生长（P. Peters-Wendisch, et al., Biotinprotein ligase from Corynebacterium glutamicum: role for growth and L-lysineproduction. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, 93(6), 2493-2502.）。而在生物素限制的条件下，谷氨酸棒杆菌脂肪酸合成受阻，细胞膜的张力发生变化，机械敏感通道蛋白MscCG被激活，可以触发L-谷氨酸大量外排和积累（Nakayama, Y, Corynebacterium glutamicum Mechanosensing: From Osmoregulation to L-Glutamate Secretion forthe Avian Microbiota-Gut-Brain Axis. Microorganisms, 2021, 9, 201.）。因此，生物素“亚适量”工艺是谷氨酸生产经常使用的条件，其中生物素添加量和代谢控制至关重要。目前尚没有研究关注生物素合成关键酶对谷氨酸合成的影响。作为催化生物素合成途径最后一步的生物素合酶BioB与谷氨酸棒杆菌L-谷氨酸生产之间的作用有待解析，以便进一步提高L-谷氨酸的生产。

发明内容

本发明通过对前期筛选获得的谷氨酸高产菌株SL4基因组序列分析，发现其生物素合酶基因编码基因bioB存在点突变，并进一步研究发现由其编码的293位突变的生物素合酶可以提高菌株的谷氨酸产量，进而可以提升谷氨酸的生产效率，降低生产成本。在此基础上，完成本发明。

第一方面，本发明提供生物素合酶突变体，所述突变体为氨基酸序列在对应于SEQID NO：3所示序列的293的亮氨酸被苯丙酸酸取代。

进一步地，所述生物素合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，本文所述的“生物素合酶”及其缩写名称“BioB”是指来源于谷氨酸棒杆菌，其编码基因是Gene ID为BBD29_00525的蛋白。如本文所使用，BioB不被具体限制，只要其具有相应的活性，并且其可以是衍生自谷氨酸棒状杆菌，但是不限于此。例如，BioB可以是如SEQ ID NO:3的氨基酸序列的野生型序列或者与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的氨基酸序列。另外，如果氨基酸序列与上述序列具有同源性并且与SEQ ID NO:3的蛋白质具有基本上相同或相应的生物学活性，则具有缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列也应当属于本公开内容的范围是显而易见的。在本发明中，编码BioB的任何多核苷酸序列都属于本公开内容的范围。例如，多核苷酸序列可以是与SEQ ID NO:4的多核苷酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的多核苷酸序列。另外，基于密码子简并性或考虑生物体表达蛋白质优选的密码子，编码蛋白质的多核苷酸序列可以在不改变从编码区表达的蛋白质的氨基酸序列的范围内具有编码区上的各种变体。

所述“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰（例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合）的氨基酸聚合物。

所述“片段”意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个（例如，若干个）氨基酸的一种多肽或一个催化或碳水化合物结合模块。在具体的实施方式中，所述片段具有柠檬酸合酶活性。

所述“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本发明中野生型的生物素合酶是指野生型BioB蛋白，也即如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。

所述“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即，取代、插入和/或缺的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。在具体的实施方式中，所述“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变（subsititution）或点突变（point mutation）。

所述“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本发明中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。

在一些实施方式中，所述的“突变”包含在SEQ ID NO：3所示序列的第293位亮氨酸被苯丙氨酸取代。与SEQ ID NO：3所示序列的生物素合酶相比，含有该突变体的菌株其L-谷氨酸产量提高13%以上。

第二方面，本发明提供了编码所述生物素合酶的编码多核苷酸。

所述“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

具体地，本发明的生物素合酶的编码多核苷酸包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸，且在其877位突变的多核苷酸。此外，本发明的多核苷酸还包括与SEQ ID NO:2所示多核苷酸具有75％或更高，具体地80％或更高，更具体地85％或更高，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和99％或更高的同源性的任何多核苷酸。

本发明的术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。一个部分与另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域中已知的技术测定。例如，同源性可以通过使用容易可获得的计算机程序直接排列两个多核苷酸分子或两个多肽分子的序列信息来测定。计算机程序的实例可以包括BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLCbio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc.)等。另外，多核苷酸之间的同源性可以通过如下步骤来测定：在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，利用单链特异性核酸酶分解，然后对分解的片段进行大小测定。

第三方面，本发明提供了含有第一方面的生物素合酶或第二方面的编码基因的重组宿主细胞。特别是，所述宿主细胞是L-谷氨酸的生产菌株。

本发明所述的L-谷氨酸生产菌株的构建，是通过将生物素合酶或其编码基因转化进入宿主细胞中来实现的。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

本发明所述“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株。

在一些实施方式中，对于谷氨酸生产菌株，可以是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869基础上改造获得的菌株，这些改造包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a. 编码机械敏感通道蛋白的yggB基因（CN108250278A）；

b. 编码磷酸转酮酶的fxpk基因（WO2006016705A1）；

c. 编码丙酮酸羧化酶的pyc基因（WO2004069996A2）；

d．编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因（CN103205390A）；

e．编码碳酸酐酶的基因（WO2011024583A1）。

在一些实施方式中，所述谷氨酸生产菌株中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：

a.编码α-酮戊二酸脱氢酶的odhA基因(WO2006028298A2)；

b.编码转录调控基因的amtR基因(EP2276845A1)；

c.编码转录抑制子的acnR基因(CN111334535A)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌，进一步地经过改良，具体地是在所述菌中的NCgl1221同源基因（BBD29_06760或yggB）中引入A111V突变，获得谷氨酸生产菌株SCgGC5。

在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

第四方面，本发明提供所述生物素合酶突变体或其编码基因或重组宿主细胞在提高L-谷氨酸产量和转化率中的应用。

第五方面，本发明提供了一种生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括培养第三方面的宿主细胞使之生产L-谷氨酸，进一步包括例如从培养基中分离提取或回收L-谷氨酸的步骤。

本发明的有益效果：本发明提供的生物素合酶突变体，可以提高菌株L-谷氨酸的产量和转化率，可降低谷氨酸的生产成本，为大规模生产提供了新的策略。

具体实施方式

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选此处提供的方法和材料。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例中所用的培养基如下：

TSB平板培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K₂HPO₄·3H₂O，1 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L；琼脂粉，15 g/L。

TSB液体培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K₂HPO₄·3H₂O，1 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L。

谷氨酸发酵实验使用的种子培养基成份为：葡萄糖，25 g/L；KH₂PO₄·3H₂O，2.2 g/L；尿素，3 g/L；玉米浆，33 mL；MgSO₄·7H₂O，0.9 g/L；豆饼水解液，22 mL；MOPS，20 g/L；初始pH7.2。

谷氨酸发酵实验使用的发酵培养基成份为：葡萄糖，80 g/L；KH₂PO₄，1 g/L；尿素，10 g/L；玉米浆干粉，5 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.4 g/L；FeSO₄·7H₂O，10 mg/L；MnSO₄·4H₂O，10mg/L；VB₁，200 μg/L；MOPS，40 g/L；初始pH7.5。

实施例1 突变型BioB编辑质粒构建

发明人前期通过诱变筛选，获得一株能够高产谷氨酸的突变菌株，并命名为SL4（Liu Jiao, et al., Mutations in Peptidoglycan Synthesis Gene ponA ImproveElectrotransformation Efficiency of Corynebacterium glutamicum ATCC 13869.Appl. Environ. Microbiol., 2018, 84, e02225-02218.）。通过对SL4菌株的基因组进行测序分析，发现参与生物素合成的3个基因bioD、bioA和bioB，只有bioB基因的第877位由C突变为T，对应的氨基酸由亮氨酸变成苯丙氨酸。鉴于生物素对谷氨酸合成的关键作用，我们预测该突变可能是提高谷氨酸产量的新靶点。

根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列及野生型BioB的序列（其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示），设计扩增引物BioB-F1/R1和BioB-F2/R2，以ATCC 13869基因组为模板，扩增包含BioB^L293F突变体的上游和下游重组片段。根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mobsacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。本实施例所用引物见表1。上述三片段回收后重组连接，获得带有BioB^L293F突变体的编辑质粒pK18-BioB^L293F。

表1 构建突变体编辑质粒引物

引物	核苷酸序列
		pK-F	AAGCTTGGCACTGGCCGTCG
pK-R	GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT
		BioB-F1	tgacatgattacgaattcAGTCATGGGTTAAGGTTGTC
BioB-R1	cctcccaggaaggcttgctcggaacc
		BioB-F2	agcaagccttcctgggaggcatcaat
BioB-R2	cgacggccagtgccaagcttCTTCGATGAAGTGTTGTTGG

实施例2 突变型BioB的谷氨酸生产菌株构建

本实施例首先构建一株可以生产L-谷氨酸的菌株，其构建过程如下：

已有文献报道了在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组NCgl1221同源基因（BBD29_06760或yggB）中引入A111V突变，可以使菌株具备组成型合成分泌L-谷氨酸的能力。根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计引物A111V-UH-F/R和A111V-DH-F/R。以ATCC13869基因组为模板，分别利用上述引物通过PCR扩增获得带有YggB^A111V突变的DNA片段；根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mobsacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段；上述三片段回收后重组连接，对化转后所获得的克隆进行收集并提取质粒，获得YggB^A111V突变的编辑载体pK18-YggB^A111V。

采用文献报道的方法制备C. glutamicum ATCC 13869感受态细胞（Biotechnology Letters, 2015, 37: 2445-52.），向上述制备获得的13869感受态细胞电转化1 μg的pK18-YggB^A111V质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养1天，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养6 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得L-谷氨酸生产菌株SCgGC5。本实施例所用引物见表2。

表2本实施例所用引物

引物	核苷酸序列
		A111V-UH-F	tgacatgattacgaattcATCCACTGGAGTTTTGCCAATTCTC
A111V-UH-R	gtcttggtGTGcagtcgattgttgcg
		A111V-DH-F	atcgactgCACaccaagaccaatggc
A111V-DH-R	cgacggccagtgccaagcttTGGAGGAATAGAGCGGGTCATACAC

采用文献报道的方法制备L-谷氨酸生产菌株SCgGC5感受态细胞，向上述制备获得的SCgGC5感受态细胞电转化1 μg的pK18-BioB^L293F质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养24h，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养4 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得带有突变型BioB的L-谷氨酸生产菌株SCgGC5-BioB^L293F。即该菌株中含有了突变后的BioB（其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示）。

实施例3 BioB突变体对L-谷氨酸合成的影响

为了验证BioB突变体对谷氨酸产量的效果，对上述构建的SCgGC5-BioB^L293F菌株进行发酵测试，同时以菌株ATCC 13869、SCgGC5作为对照。

首先将菌株接种到种子培养基中培养8 h，培养物作为种子接种到每孔含有800 μL发酵培养基的24孔板中，初始OD₆₀₀控制约为0.5，孔板摇床转速为800 rpm，每个菌株3个平行，30℃培养，17 h、20 h和23 h补加5 g/L尿素，25 h发酵结束，检测L-谷氨酸产量和葡萄糖消耗量，并计算从葡萄糖到L-谷氨酸的糖酸转化率。结果如表3所示。

表3 L-谷氨酸生产

菌株	L-谷氨酸（g/L）	糖酸转化率（g/g，%）
			ATCC 13869	0.20±0.00	0.27±0.00
SCgGC5	4.26±0.19	5.27±0.28
			SCgGC5-BioB<sup>L293F</sup>	4.82±0.05	5.97±0.08

从表中可知，突变体BioB^L293F能够明显提高L-谷氨酸产量及糖酸转化率，在L-谷氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景。

Claims (10)

1.一种生物素合酶突变体，其特征在于，所述突变体在对应于SEQ ID NO:3所示的生物素合酶或其同源基因编码的生物素合酶的基础上，其第293位的亮氨酸被苯丙氨酸取代；

优选地，所述同源基因编码的生物素合酶是指其序列一致性具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性，且仍具有生物素合酶功能，更优选地，其来自于谷氨酸棒杆菌。

2.如权利要求1所述生物素合酶突变体的编码基因。

3.含有如权利要求2所述的编码基因的重组载体。

4.含有如权利要求2所述的编码基因的重组宿主细胞，优选地，其是谷氨酸棒杆菌。

5.一种产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株中包含权利要求1所述的生物素合酶突变体，或权利要求2所述的编码基因。

6.如权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其出发菌株选自谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，或由上述菌株制备的产生L-谷氨酸的菌株。

7.如权利要求5或6任一项所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述宿主细胞是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基础上，选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：

编码α-酮戊二酸脱氢酶的odhA基因；

编码琥珀酸脱氢酶的sucA基因；

更优选地，所述宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a. 编码丙酮酸羧化酶的pyc基因；

b. 编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因；

c. 编码柠檬酸合酶的gltA基因；

d. 编码天磷酸转酮酶的fxpk基因；

e.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；

f. 编码磷酸盐转运蛋白的pitA基因；

g.编码机械敏感通道蛋白的yggB基因。

8.如权利要求5-7任一项所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌中的NCgl1221基因或其同源基因（如BBD29_06760或yggB）的111位丙氨酸被缬氨酸取代。

9.如权利要求1所述的生物素合酶突变体或其编码基因或其重组宿主细胞在生产L-谷氨酸中的应用。

10.一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，包括培养如权利要求5至8任一项所述的谷氨酸棒杆菌使之生产L-谷氨酸，进一步包括分离提取或回收L-谷氨酸的步骤。