CN117737021A - 突变型柠檬酸合酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体涉及突变型柠檬酸合酶及其应用。本发明提供的柠檬酸合酶突变体，可以提高菌株柠檬酸下游产物谷氨酸的产量和转化率，降低谷氨酸的生产成本，为大规模生产提供了新的策略，具有较大应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及柠檬酸合酶的突变体，以及利用该突变体生产柠檬酸及其下游产物的方法和应用。
背景技术
柠檬酸合酶，由gltA基因编码，在目前已知的菌株中几乎都存在该酶，可催化草酰乙酸和乙酰辅酶A生成柠檬酸和辅酶A，该反应是TCA循环的起始步骤。柠檬酸合酶活性的提高可以将更多的碳流引入到TCA 循环中，从而增加柠檬酸及其下游产物的含量。如Buch AD等人报道了在荧光假单胞菌中引入来自大肠杆菌的柠檬酸合酶，可增加菌株的柠檬酸合成（Enhanced citricacid biosynthesis in Pseudomonas fluorescensATCC 13525 byoverexpression of the Escherichia coli citrate synthase gene. Microbiology,2009, 155(8): 2620–2629.）。专利文献CN1261627A报道，在大肠杆菌中引入来自乳发酵短杆菌的柠檬酸合酶，可以提高大肠杆菌的谷氨酸产量。另有研究表明强化柠檬酸合酶的表达可以有效提高衣康酸（代谢工程改造大肠杆菌生产衣康酸.重庆理工大学学报(自然科学),2020,34(11):207-214.）、α-酮戊二酸（敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响.食品与发酵工业,2017,43(08):1-7.）、琥珀酸（Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for efficient productionof succinate from lignocellulosic hydrolysate. Biotechnology for Biofuels,2018, 11: 95.）、精氨酸（过量表达钝齿棒杆菌柠檬酸合酶编码基因prpC2对L-精氨酸合成的影响. 中国生物工程杂志,2015,35(3):49-55.）、鸟氨酸（Metabolic engineering ofCorynebacteriumglutamicum S9114 to enhance the production of L-ornithinedriven by glucose andxylose. Bioresource Technology, 2019;284:204–213）、5-氨基乙酰丙酸（代谢工程构建谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸. 食品与发酵工业,2022,48(14):9-15）等柠檬酸下游产物的产量。
然而，上述报道中柠檬酸合酶活性的增强主要都是通过编码基因gltA的过表达实现，目前，尚未报道有更高活性的柠檬酸合酶突变体，本领域急需更高活性的柠檬酸合酶突变体，以便进一步提高菌株的柠檬酸及其下游产物的生产性能。
发明内容
本发明通过对柠檬酸合酶结构的模拟，预测其361位是蛋白活性的关键靶点之一，进而对该位点进行饱和突变，获得了一系列活性增强的突变体，这些突变体以及突变体的过表达可以提高菌株的谷氨酸产量，进而可以提升谷氨酸的生产效率，降低生产成本。在此基础上，完成本发明。
第一方面，本发明提供柠檬酸合酶突变体，所述突变体为氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，且361位的半胱氨酸被赖氨酸、丝氨酸、亮氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代。
其中，本文所述的“柠檬酸合酶”及其缩写名称“GltA”是指能够草酰乙酸和乙酰辅酶A生成柠檬酸和辅酶A。作为谷氨酸生物合成途径中的关键酶之一，其过表达有利于谷氨酸的合成。如本文所使用，柠檬酸合酶不被具体限制，只要其具有相应的活性，并且其可以是衍生自棒状杆菌属——具体地，谷氨酸棒状杆菌——的微生物的柠檬酸合酶，但是不限于此。例如，柠檬酸合酶可以是SEQ ID NO:1的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的氨基酸序列。另外，如果氨基酸序列与上述序列具有同源性并且与SEQ ID NO:1的蛋白质具有基本上相同或相应的生物学活性，则具有缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列也应当属于本公开内容的范围是显而易见的。在本发明中，编码柠檬酸合酶的任何多核苷酸序列可以属于本公开内容的范围。例如，多核苷酸序列可以是与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的多核苷酸序列。另外，基于密码子简并性或考虑生物体表达蛋白质优选的密码子，编码蛋白质的多核苷酸序列可以在不改变从编码区表达的蛋白质的氨基酸序列的范围内具有编码区上的各种变体。
所述“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰（例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合）的氨基酸聚合物。
所述“片段”意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个（例如，若干个）氨基酸的一种多肽或一个催化或碳水化合物结合模块。在具体的实施方式中，所述片段具有柠檬酸合酶活性。
所述“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本公开中野生型的柠檬酸合酶是指野生型GltA蛋白，也即如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽。
所述“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即，取代、插入和/或缺的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。在具体的实施方式中，所述“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变（subsititution）或点突变（point mutation）。
所述“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本发明中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。
在一些实施方式中，所述的“突变”包含在SEQ ID NO：1所示序列的第361位半胱氨酸被赖氨酸、丝氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代。与SEQ ID NO：1所示序列的柠檬酸合酶相比，突变体能够提高谷氨酸的产量，是野生型的至少1.05倍以上。
第二方面，本发明提供了编码所述柠檬酸合酶突变体的编码多核苷酸。
所述“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
具体地，本发明的柠檬酸合酶突变体的编码多核苷酸包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸，且在其1081-1083位突变的多核苷酸。此外，本发明的多核苷酸还包括与SEQ IDNO:2所示多核苷酸具有75％或更高，具体地80％或更高，更具体地85％或更高，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和99％或更高的同源性的任何多核苷酸。
本发明的术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。一个部分与另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域中已知的技术测定。例如，同源性可以通过使用容易可获得的计算机程序直接排列两个多核苷酸分子或两个多肽分子的序列信息来测定。计算机程序的实例可以包括BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLCbio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc.)等。另外，多核苷酸之间的同源性可以通过如下步骤来测定：在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，利用单链特异性核酸酶分解，然后对分解的片段进行大小测定。
第三方面，本发明提供了含有所述柠檬酸合酶突变体的编码核苷酸的载体，尤其是重组表达载体。
本发明的术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
本发明的术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目标基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i）对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii）转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii）适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
第四方面，本发明提供了含有所述柠檬酸合酶基因启动子的突变体的重组宿主细胞。
重组宿主细胞具体通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本发明所述“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株。
在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌，进一步地经过改良，具体地是在所述菌中的NCgl1221同源基因（BBD29_06760或yggB）中引入A111V突变，获得谷氨酸生产菌株SCgGC5。
在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
第五方面，本发明提供所述柠檬酸合酶突变体或其编码核苷酸在生产柠檬酸及其下游产物中的应用。优选地，柠檬酸下游产物包括琥珀酸、苹果酸、衣康酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸等。
第六方面，本发明提供了一种生产柠檬酸及其下游产物的方法，所述方法包括培养第四方面的宿主细胞使之生产柠檬酸及其下游产物，进一步包括从培养基中分离提取或回收柠檬酸及其下游产物的步骤。
所述柠檬酸下游产物包括琥珀酸、苹果酸、衣康酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸等。
本发明的有益效果：本发明提供的柠檬酸合酶突变体，可以提高菌株柠檬酸下游产物谷氨酸的产量和转化率，可降低谷氨酸的生产成本，为大规模生产提供了新的策略。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选此处提供的方法和材料。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例中所用的培养基如下：
TSB平板培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K2HPO4·3H2O，1 g/L；MgSO4·7H2O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L；琼脂粉，15 g/L。
TSB液体培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K2HPO4·3H2O，1 g/L；MgSO4·7H2O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L。
谷氨酸发酵实验使用的种子培养基成份为：葡萄糖，25 g/L；KH2PO4·3H2O，2.2 g/L；尿素，3 g/L；玉米浆，33 mL；MgSO4·7H2O，0.9 g/L；豆饼水解液，22 mL；MOPS，20 g/L；初始pH7.2。
谷氨酸发酵实验使用的发酵培养基成份为：葡萄糖，80 g/L；KH2PO4，1 g/L；尿素，10 g/L；玉米浆干粉，5 g/L；MgSO4·7H2O，0.4 g/L；FeSO4·7H2O，10 mg/L；MnSO4·4H2O，10mg/L；VB1，200 μg/L；MOPS，40 g/L；初始pH7.5。
实施例1柠檬酸合酶过表达载体构建
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计扩增引物gltA-F/R，以ATCC 13869基因组为模板，扩增获得编码内源柠檬酸合酶的基因片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)。以pXMJ19质粒为模板，以pXMJ19-F/R为引物扩增pXMJ19质粒骨架。本实施例所用引物见表1。上述片段回收纯化后利用诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pXMJ19-GltAWT过表达载体。
实施例2突变型柠檬酸合酶过表达载体构建
通过前期对柠檬酸合酶GltA蛋白空间结构的模拟，预测其361位是蛋白活性的关键靶点。随后，对该位点进行了饱和突变，构建过程如下：根据pXMJ19-GltAWT载体序列，设计引物gltA-1-F/R，通过PCR扩增获得载体片段。同时，设计引物gltA-F/L/I/M/V/S/P/T/A/H/Q/N/K/D/E/W/R/G/Y-F，分别与引物gltA-2-R以pXMJ19-GltAWT为模板扩增获得含有GltAC361F、GltAC361L、GltAC361I、GltAC361M、GltAC361V、GltAC361S、GltAC361P、GltAC361T、GltAC361A、GltAC361H、GltAC361Q、GltAC361N、GltAC361K、GltAC361D、GltAC361E、GltAC361W、GltAC361R、GltAC361G和GltAC361Y突变位点的基因片段，将柠檬酸合酶第361位的半胱氨酸(C)残基突变为苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、组氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)。上述片段回收纯化后分别与载体片段利用诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得过表达突变型柠檬酸合酶的过表达载体pXMJ19-GltAC361F、pXMJ19-GltAC361L、pXMJ19-GltAC361I、pXMJ19-GltAC361M、pXMJ19-GltAC361V、pXMJ19-GltAC361S、pXMJ19-GltAC361P、pXMJ19-GltAC361T、pXMJ19-GltAC361A、pXMJ19-GltAC361H、pXMJ19-GltAC361Q、pXMJ19-GltAC361N、pXMJ19-GltAC361K、pXMJ19-GltAC361D、pXMJ19-GltAC361E、pXMJ19-GltAC361W、pXMJ19-GltAC361R、pXMJ19-GltAC361G和pXMJ19-GltAC361Y。
表1 构建过表达质粒引物
| 引物 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO： |
| gltA-F | TGCAGGAAGGAGATATACATATGTTTGAAAGGGATATCGTGGC | SEQ ID NO：3 |
| gltA-R | ACCCGGGGATCCTCTAGAGTTTAGCGCTCCTCGCGAGGAA | SEQ ID NO：4 |
| pXMJ19-F | ACTCTAGAGGATCCCCGGGTAC | SEQ ID NO：5 |
| pXMJ19-R | ATGTATATCTCCTTCCTGCAGGCATG | SEQ ID NO：6 |
| gltA-1-F | GTCAAACTTGATCAGGTGTCTACCTGGGG | SEQ ID NO：7 |
| gltA-1-R | ATCATCAGCCAGTGCAATTTCTTCCAG | SEQ ID NO：8 |
| gltA-F-F | GCACTGGCTGATGATTTCTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：9 |
| gltA-L-F | GCACTGGCTGATGATCTGTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：10 |
| gltA-I-F | GCACTGGCTGATGATATCTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：11 |
| gltA-M-F | GCACTGGCTGATGATATGTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：12 |
| gltA-V-F | GCACTGGCTGATGATGTGTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：13 |
| gltA-S-F | GCACTGGCTGATGATTCCTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：14 |
| gltA-P-F | GCACTGGCTGATGATCCATTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：15 |
| gltA-T-F | GCACTGGCTGATGATACCTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：16 |
| gltA-A-F | GCACTGGCTGATGATGCATTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：17 |
| gltA-H-F | GCACTGGCTGATGATCACTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：18 |
| gltA-Q-F | GCACTGGCTGATGATCAGTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：19 |
| gltA-N-F | GCACTGGCTGATGATAACTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：20 |
| gltA-K-F | GCACTGGCTGATGATAAGTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：21 |
| gltA-D-F | GCACTGGCTGATGATGATTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：22 |
| gltA-E-F | GCACTGGCTGATGATGAATTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：23 |
| gltA-W-F | GCACTGGCTGATGATTGGTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：24 |
| gltA-R-F | GCACTGGCTGATGATCGCTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：25 |
| gltA-G-F | GCACTGGCTGATGATGGCTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：26 |
| gltA-Y-F | GCACTGGCTGATGATTACTTCATCTCCCGCAAGCTCTA | SEQ ID NO：27 |
| gltA-2-R | GACACCTGATCAAGTTTGACCCCGTG | SEQ ID NO：28 |
实施例3突变型柠檬酸合酶对L-谷氨酸合成的影响
（1）L-谷氨酸生产菌株构建
已有文献报道了在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组NCgl1221同源基因（BBD29_06760或yggB）中引入A111V突变，可以使菌株具备组成型合成分泌L-谷氨酸的能力。为了验证上述启动子在L-谷氨酸生产中的应用，首先在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组中引入上述突变。
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计引物A111V-UH-F/R和A111V-DH-F/R。以ATCC13869基因组为模板，分别利用上述引物通过PCR扩增获得带有YggBA111V突变的DNA片段；根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mobsacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段；上述三片段回收后重组连接，对化转后所获得的克隆进行收集并提取质粒，获得YggBA111V突变的编辑载体pK18-YggBA111V。
采用文献报道的方法制备C. glutamicum ATCC 13869感受态细胞（Biotechnology Letters, 2015, 37: 2445-52.），向上述制备获得的13869感受态细胞电转化1 μg的pK18-YggBA111V质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养1天，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养6 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得L-谷氨酸生产菌株SCgGC5。本实施例所用引物见表2。
表2本实施例所用引物
| 引物 | 核苷酸序列 | 序列号 |
| A111V-UH-F | tgacatgattacgaattcATCCACTGGAGTTTTGCCAATTCTC | SEQ ID NO：29 |
| A111V-UH-R | gtcttggtGTGcagtcgattgttgcg | SEQ ID NO：30 |
| A111V-DH-F | atcgactgCACaccaagaccaatggc | SEQ ID NO：31 |
| A111V-DH-R | cgacggccagtgccaagcttTGGAGGAATAGAGCGGGTCATACAC | SEQ ID NO：32 |
| pK-F | AAGCTTGGCACTGGCCGTCG | SEQ ID NO：33 |
| pK-R | GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT | SEQ ID NO：34 |
采用文献报道的方法制备L-谷氨酸生产菌株SCgGC5感受态细胞（Improving theelectro-transformation efficiency of Corynebacterium glutamicum by weakeningits cell wall and increasing the cytoplasmic membrane fluidity, BiotechnologyLetters, 2015, 37: 2445-52.），向上述制备获得的SCgGC5感受态细胞分别电转化1 μg的pXMJ19、pXMJ19-GltAWT、pXMJ19-GltAC361F、pXMJ19-GltAC361L、pXMJ19-GltAC361I、pXMJ19-GltAC361M、pXMJ19-GltAC361V、pXMJ19-GltAC361S、pXMJ19-GltAC361P、pXMJ19-GltAC361T、pXMJ19-GltAC361A、pXMJ19-GltAC361H、pXMJ19-GltAC361Q、pXMJ19-GltAC361N、pXMJ19-GltAC361K、pXMJ19-GltAC361D、pXMJ19-GltAC361E、pXMJ19-GltAC361W、pXMJ19-GltAC361R和pXMJ19-GltAC361F，加入1mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育2 h，涂布含有5 μg/mL氯霉素的TSB固体培养基，30℃培养1天，获得重组菌株SCgGC5/pXMJ19、SCgGC5/pXMJ19-GltAWT、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361F、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361L、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361I、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361M、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361V、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361S、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361P、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361T、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361A、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361H、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361Q、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361N、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361K、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361D、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361E、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361W、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361R、SCgGC5/pXMJ19-GltAC361G和SCgGC5/pXMJ19-GltAC361Y菌株。
（2）突变型柠檬酸合酶对L-谷氨酸合成的影响
为了验证突变型柠檬酸合酶对L-谷氨酸合成的影响，对上述构建的重组菌株进行发酵测试，以SCgGC5/pXMJ19和SCgGC5/pXMJ19-GltAWT作为对照菌株分析突变体的应用效果。
首先将上述菌株接种到种子培养基中，培养8 h，培养物接种到每孔含有800 μL添加5 μg/mL氯霉素和10 µM IPTG的发酵培养基的24孔板中，初始OD600控制约为0.5，孔板摇床转速为800 rpm，每个菌株3个平行，30℃培养，17 h、20 h和23 h时分别补加5 g/L尿素控制pH在7左右，25 h发酵结束，检测L-谷氨酸产量。数据显示过表达野生型柠檬酸合酶的重组菌株谷L-氨酸产量为4.64 g/L，比携带空质粒的对照菌株提高17%，但表达GltAC361K、GltAC361S、GltAC361W、GltAC361Y、GltAC361F、GltAC361L、GltAC361M和GltAC361N突变体的菌株L-谷氨酸产量进一步提高，其L-谷氨酸的产量较表达野生型柠檬酸合酶的菌株提高了约5%-35%，表明上述突变体均有利于L-谷氨酸的合成，在L-谷氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景。而其他残基的突变不能增加菌株的L-谷氨酸产量。
实施例4 GltAC361Y突变体应用于L-谷氨酸生产
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计引物gltA-F1/R1和gltA-F2/R2，以ATCC 13869基因组为模板，扩增包含GltAC361Y突变体的上游和下游重组片段。根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mobsacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。上述三片段回收后重组连接，获得带有GltAC361Y突变体的编辑质粒pK18-GltAC361Y。
采用文献报道的方法制备L-谷氨酸生产菌株SCgGC5感受态细胞（Improving theelectro-transformation efficiency of Corynebacterium glutamicum by weakeningits cell wall and increasing the cytoplasmic membrane fluidity,BiotechnologyLetters, 2015, 37: 2445-52.），向上述制备获得的SCgGC5感受态细胞电转化1 μg的pK18-GltAC361Y质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养24 h，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养4 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得带有GltAC361Y突变体的菌株SCgGC7。
为了验证GltAC361Y突变体对L-谷氨酸合成的影响，对上述构建的菌株进行发酵测试，以SCgGC5作为对照菌株分析突变体的应用效果。首先将上述菌株接种到种子培养基中，培养8 h，培养物接种到每孔含有800 μL发酵培养基的24孔板中，初始OD600控制约为0.5，孔板摇床转速为800 rpm，每个菌株3个平行，30℃培养，18 h、20 h和22 h时分别补加2 g/L尿素控制pH在7左右，25 h发酵结束，检测L-谷氨酸产量和葡萄糖消耗量，并计算从葡萄糖到L-谷氨酸的糖酸转化率。
表3构建GltAC361Y突变体菌株的引物
| 引物 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO： |
| gltA-F1 | tgacatgattacgaattcTTTGACCCAGGTTATGTGAG | SEQ ID NO：35 |
| gltA-R1 | aatcatcagccagtgcaatttct | SEQ ID NO：36 |
| gltA-F2 | cactggctgatgattActtcatctcccgcaa | SEQ ID NO：37 |
| gltA-R2 | cgacggccagtgccaagcttCGGAAATCATAGAGCGACAA | SEQ ID NO：38 |
| pK-F | AAGCTTGGCACTGGCCGTCG | SEQ ID NO：39 |
| pK-R | GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT | SEQ ID NO：40 |
实验结果如表4所述。
表4GltAC361Y突变体对L-谷氨酸产量的影响
| 菌株 | L-Glu（g/L） | 糖酸转化率（g/g，%） |
| SCgGC5 | 4.50±0.22 | 5.86±0.33 |
| SCgGC7 | 8.53±0.31 | 12.03±0.0.56 |
其中数据显示GltAC361Y突变体显著提高了L-谷氨酸产量和糖酸转化率，表明GltAC361Y突变体有利于L-谷氨酸的合成，在L-谷氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景。
Claims (10)
1.一种柠檬酸合酶突变体，其特征在于，所述突变体为以下组中的任一个：
1）氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且其361位半胱氨酸突变为赖氨酸、丝氨酸、亮氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸中的任一个；
2）在SEQ ID NO:1所示多肽的两端添加、缺失一个或多个碱基，且在对应于SEQ ID NO:1的361位为赖氨酸、丝氨酸、亮氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸中的任一个；优选地，在SEQ ID NO:1所示多肽的两端添加、缺失1、2、3、4、5、6个碱基。
2.如权利要求1所述柠檬酸合酶突变体的编码核酸。
3.含有如权利要求2所述的柠檬酸合酶突变体的编码核酸的表达盒。
4.含有如权利要求2所述的柠檬酸合酶突变体的编码核酸的载体。
5.含有如权利要求2所述的柠檬酸合酶突变体的编码核酸的宿主细胞；优选地，所述的宿主细胞是埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属（Corynebacterium）的微生物；更优选地，所述宿主细胞是棒状杆菌属的微生物；可选地，所述棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067菌株以及衍生菌株。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述菌株的出发菌株具有合成L-谷氨酸的能力。
7.如权利要求1所述的柠檬酸合酶突变体或其编码核酸在生产柠檬酸或其下游产物中的应用。
8.含有如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述柠檬酸下游产物选自琥珀酸、苹果酸、衣康酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸。
9.一种生产柠檬酸或其下游产物的方法，其特征在于，包括培养如权利要求6所述的宿主细胞使之生产柠檬酸或其下游产物，进一步包括从培养基中分离提取或回收柠檬酸或其下游产物的步骤。
10.含有如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸下游产物选自琥珀酸、衣康酸、苹果酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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