CN116445379A - N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶的失活及其在生产谷氨酸中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种产L‑谷氨酸的谷氨酸棒杆菌，所述菌株中N‑乙酰氨基葡萄糖6‑磷酸脱乙酰酶编码基因失活或表达弱化，或所述菌株中含有SEQ ID NO:1所示的N‑乙酰氨基葡萄糖6‑磷酸脱乙酰酶突变体。此外，还包括利用上述菌株生产L‑谷氨酸、提高L‑谷氨酸产量和转化率的方法。

Description

N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶的失活及其在生产谷氨酸 中的应用

技术领域

本发明涉及微生物与生物技术领域，具体涉及一种突变型N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶，以及该突变体构建L-谷氨酸生产菌株，生产L-谷氨酸的方法。

背景技术

L-谷氨酸是世界第一大氨基酸产品，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应，主要用于生产味精、鸡精等调味料以及各种食品，并在医药、化工、畜牧等领域应用广泛。由于需求量大，产能高，L-谷氨酸的工业发酵一直是我国重要的发酵产业之一。

当前，L-谷氨酸的生产主要采用微生物发酵法来生产，通常使用的工业发酵微生物包括棒杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）的菌株。由于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的生理优越性，其已成为工业中最重要的谷氨酸生产菌株。早期，谷氨酸的生产菌株大多是通过多轮的诱变筛选获得，菌株的遗传背景不清楚，随着谷氨酸棒杆菌遗传改造工具的不断发展，以及代谢工程手段的进步，对谷氨酸棒杆菌进行代谢工程改造提高其谷氨酸产量的报道逐渐增多，如加强L-谷氨酸合成关键酶谷氨酸脱氢酶的表达提高菌株的谷氨酸产量（WO0053726A1），加强四碳回补途径维持L-谷氨酸的高效合成，加强L-谷氨酸外排蛋白MscCG的表达提高L-谷氨酸的产量等（Wang Y, Cao G, XuD, et al. A novel Corynebacterium glutamicum L-glutamate exporter. Appliedand Environment Microbiology, 2018, 84(6): e02691–02617）。

虽然上述这些手段可以提高菌株的L-谷氨酸产量，但是由于L-谷氨酸工业菌种主要通过多轮诱变获得，菌株遗传背景复杂，同时由于L-谷氨酸合成途径较短，可改造靶点和策略相对有限，因此工业菌种水平进一步改造提升的难度很大，本领域仍需深入开发L-谷氨酸合成相关的靶点研究，以便进一步提高工业菌株的发酵水平，提高L-谷氨酸的产能。

发明内容

本发明通过对谷氨酸棒杆菌的全基因组进行分析和功能元件挖掘，出乎意料地发现N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶的突变体可以提高菌株的谷氨酸产量，并进一步对菌株中的N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶的编码基因进行敲除或表达弱化，进而提升谷氨酸的生产效率，降低生产成本。在此基础上，完成本发明。

第一方面，本发明提供一种产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌，所述菌株中N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶编码基因失活或表达弱化，或所述菌株中含有表达N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶基因的突变体。

其中，本文所述的“N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶”及其缩写名称“NagA1”是指来源于谷氨酸棒杆菌，其编码基因是Gene ID为BBD29_12930的蛋白。如本文所使用，NagA1不被具体限制，只要其具有相应的活性，并且其可以是衍生自谷氨酸棒状杆菌，但是不限于此。例如，NagA1可以是如SEQ ID NO:3的氨基酸序列的野生型序列或者与SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的氨基酸序列。另外，如果氨基酸序列与上述序列具有同源性并且与SEQ ID NO:3的蛋白质具有基本上相同或相应的生物学活性，则具有缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列也应当属于本公开内容的范围是显而易见的。在本发明中，编码NagA1的任何多核苷酸序列可以属于本公开内容的范围。例如，多核苷酸序列可以是与SEQ ID NO:4的多核苷酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的多核苷酸序列。另外，基于密码子简并性或考虑生物体表达蛋白质优选的密码子，编码蛋白质的多核苷酸序列可以在不改变从编码区表达的蛋白质的氨基酸序列的范围内具有编码区上的各种变体。

所述“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰（例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合）的氨基酸聚合物。

所述“失活”、“表达弱化”是指，与野生型菌株相比，NagA1的表达被降低、减弱甚至完全消失，或指产生不表达的基因，或尽管表达但表达产物不具有活性或者具有降低的活性。

在具体实施方式中，相比于野生型或内源性多肽，突变后基因的转录、表达或编码的蛋白的活性降低至少30%，优选至少40%，更优选至少50%，例如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%，或者该野生型或内源性多肽的编码基因被去除。

所述“失活”、“表达弱化”可以通过修饰来实现，包括但不限于通过删除部分或全部编码基因、基因阅读框移码突变、弱化转录或翻译强度、或使用编码具有较低活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因，或使对应基因或酶失去活性，及任选地组合使用这些方法。采用合适的培养方法或基因表达的信号结构的遗传修饰(突变)可以实现基因表达的降低，例如基因表达的信号结构是阻遏基因，活性基因，操纵基因，启动子，弱化子，核糖体结合位点，起始密码子和终止子。基于本公开的教导，本领域技术人员知晓，可以通过失活NagA1的编码基因，或者使得NagA1在细胞中不能正常发挥功能来提高L-谷氨酸的产量。本领域技术人员可以通过本领域已知的技术手段实现上述目的。

所述“野生型的”指在自然界中可以找到的对象，包括天然的菌株、天然的基因和蛋白等等。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本公开中野生型的N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶是指野生型NagA1蛋白，也即如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。

所述“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即，取代、插入和/或缺的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。在具体的实施方式中，所述“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变（subsititution）或点突变（point mutation）。

所述“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本发明中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。

在一些实施方式中，所述的“突变”包含在SEQ ID NO：3所示序列的第317位丙氨酸被缬氨酸取代。与SEQ ID NO：3所示序列的N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶相比，含有该突变体的菌株其L-谷氨酸产量提高13%以上。

本发明所述的L-谷氨酸生产菌株的构建，是通过将N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶或其编码基因转化进入宿主细胞中来实现的。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

本发明所述“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-谷氨酸的突变体或菌株。

在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌，进一步地经过改良，即所述菌株中NCgl1221基因或其同源基因（如BBD29_06760或yggB）存在突变以使所述菌株具有更高的产L-谷氨酸能力。更具体地，是在所述菌中的NCgl1221同源基因（BBD29_06760或yggB）中引入A111V突变，获得产谷氨酸能力更主的生产菌株SCgGC5。

第二方面，本发明提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶突变体，所述突变体在对应于SEQ ID NO:3的317位的丙氨酸被缬氨酸取代。

进一步地，本发明还提供了编码所述N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶突变体的多核苷酸。

所述“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

具体地，本发明的N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶的编码多核苷酸包括SEQ IDNO:2所示的多核苷酸，且在其950位突变的多核苷酸。此外，本发明的多核苷酸还包括与SEQID NO:2所示多核苷酸具有75％或更高，具体地80％或更高，更具体地85％或更高，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和99％或更高的同源性的任何多核苷酸。

本发明的术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。一个部分与另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域中已知的技术测定。例如，同源性可以通过使用容易可获得的计算机程序直接排列两个多核苷酸分子或两个多肽分子的序列信息来测定。计算机程序的实例可以包括BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLCbio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc.)等。另外，多核苷酸之间的同源性可以通过如下步骤来测定：在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，利用单链特异性核酸酶分解，然后对分解的片段进行大小测定。

第三方面，本发明提供所述N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶突变体或其编码核苷酸在提高L-谷氨酸产量和转化率中的应用。以及提供N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶突变体或其编码核苷酸在制备提高L-谷氨酸产量的谷氨酸杆菌中的应用。

第四方面，本发明提供了一种生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括培养第一方面的宿主细胞使之生产L-谷氨酸，进一步包括从培养基中分离提取或回收L-谷氨酸的步骤。

在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

本发明的有益效果：本发明提供的N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶编码基因失活或表达弱化的菌株，或含有N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶突变体的菌株，其相对于野生型菌株而言，L-谷氨酸的产量和转化率均有所提高，在生产中可降低谷氨酸的生产成本，为大规模生产提供了新的策略。

具体实施方式

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选此处提供的方法和材料。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例中所用的培养基如下：

TSB平板培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K₂HPO₄·3H₂O，1 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L；琼脂粉，15 g/L。

TSB液体培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K₂HPO₄·3H₂O，1 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L。

谷氨酸发酵实验使用的种子培养基成份为：葡萄糖，25 g/L；KH₂PO₄·3H₂O，2.2 g/L；尿素，3 g/L；玉米浆，33 mL；MgSO₄·7H₂O，0.9 g/L；豆饼水解液，22 mL；MOPS，20 g/L；初始pH7.2。

谷氨酸发酵实验使用的发酵培养基成份为：葡萄糖，80 g/L；KH₂PO₄，1 g/L；尿素，10 g/L；玉米浆干粉，5 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.4 g/L；FeSO₄·7H₂O，10 mg/L；MnSO₄·4H₂O，10mg/L；VB₁，200 μg/L；MOPS，40 g/L；初始pH7.5。

实施例1 突变型NagA1编辑质粒构建

本发明通过对谷氨酸棒杆菌的全基因组进行分析和功能元件挖掘，出乎意料地发现N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶参与碳源代谢和利用，可能是潜在的提高L-谷氨酸的遗传改造靶点，因此对该靶点进行了进一步的改造。

首先，根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列及野生型NagA1的序列（其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示），设计扩增引物nagA1-F1/R1和nagA1-F2/R2，以ATCC 13869基因组为模板，扩增包含NagA1^A317V突变体的上游和下游重组片段。根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mobsacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。本实施例所用引物见表1。上述三片段回收后重组连接，获得带有NagA1^A317V突变体的编辑质粒pK18-NagA1^A317V。

表1 构建突变体编辑质粒引物

引物	核苷酸序列
		pK-F	AAGCTTGGCACTGGCCGTCG
pK-R	GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT
		nagA1-F1	tgacatgattacgaattcCATGAGACGGTAGTGATCAG
nagA1-R1	GATGGCGGCGTCATCGCCGGGGGCACC
		nagA1-F2	CCCCGGCGATGACGCCGCCATCGCGCAG
nagA1-R2	cgacggccagtgccaagcttCTAAAAACGCAGGATTCCAC

SEQ ID NO：3序列如下：

MAEVVHYQENAGQAVKKIEGRIVAPHGVIDGFLQLENGIITELSGEPAPKNAGFHPELPTIVPGFIDLHNHGGNGGAFPTGTQDQARNAAQYHREHGTTVMLASMVSAPADALAAQVENLIPLCEEGLLCGIHLEGPFINACRCGAQNPDFIFPGNPTDLARVIHAGKGWIKSITVAPETDNLSELLDLCAAHHIIASFGHTDADFDTTTSAIALAKEKNVTVTATHLFNAMPPLHHRAPGSVGALLAAARAGDAYVELIADGVHLADGTVDLARSNNAFFITDAMEAAGMPDGEYILGVLNVTVTDGVARLRDGGAIAGGTSTLASQFVHHVRRGMTLIDATLHTSTVAAKILGLGDHEIAKSNPANFVVFDSNGQVQKVHLGHQVL。

SEQ ID NO：4序列如下：

atggcagaagtggtgcattatcaagaaaatgcaggtcaagcagttaaaaaaattgagggaagaattgttgccccccacggggtgattgatggctttctccaactcgaaaacggcatcatcacggaactctctggagaaccagcacctaaaaacgcaggattccaccccgaactccccacgattgttcccggttttattgatcttcataatcacggtggaaacggtggcgcgtttcctacgggaacgcaggaccaggcgaggaacgccgcgcagtatcaccgcgaacatggcacgaccgtgatgttggcaagcatggtttcggcgccggctgacgcactggcagcgcaggtggaaaaccttattcccttgtgtgaagagggcctgctgtgcggcattcacctcgagggccctttcatcaacgcatgccgttgtggtgctcaaaacccggatttcatttttcccggcaacccaacagatcttgcccgggtgatccatgcgggaaaaggttggatcaaatcgatcacagtagcgccggaaactgacaatctttctgagcttctcgatctctgcgcagcgcaccacatcattgcttccttcgggcacactgatgcagattttgataccactaccagcgcaattgccttggctaaagagaaaaatgtgacggtcacggctacgcatttgttcaatgcgatgcctccgctgcatcatagggctcccggcagcgtgggcgctttgcttgctgcggcacgtgccggggacgcatatgttgagttgatcgccgacggcgtgcatttggccgatggaacggtcgatctagctcgttccaacaacgcctttttcatcacggacgccatggaagccgccggaatgccagacggtgagtacattttgggcgttttgaacgtcaccgtcaccgatggagtcgcccgtctgcgcgatggcggcgccatcgccgggggcaccagcacactagcgagtcagttcgtgcaccacgtgcgcaggggtatgacgcttatcgacgcgaccctccacacctcaaccgtcgccgctaaaattctcggtcttggcgatcacgaaatcgctaaatccaaccctgcaaattttgtggtctttgactcaaacggccaggtgcaaaaggtccatttaggtcatcaagtactttaa。

实施例2突变型NagA1的谷氨酸生产菌株构建

本实施例首先构建一株可以生产L-谷氨酸的菌株，其构建过程如下：

已有文献报道了在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组NCgl1221同源基因（BBD29_06760或yggB）中引入A111V突变，可以使菌株具备组成型合成分泌L-谷氨酸的能力。根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计引物A111V-UH-F/R和A111V-DH-F/R。以ATCC13869基因组为模板，分别利用上述引物通过PCR扩增获得带有YggB^A111V突变的DNA片段；根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mobsacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段；上述三片段回收后重组连接，对化转后所获得的克隆进行收集并提取质粒，获得YggB^A111V突变的编辑载体pK18-YggB^A111V。其中，野生型的谷氨酸棒杆菌是可以产谷氨酸的，但是需要在特定的培养基中才产（例如生物素限制、提升温度等等，这样可以提高细胞膜的通透性），普通培养基中产量极低。

采用文献报道的方法制备C. glutamicum ATCC 13869感受态细胞（Biotechnology Letters, 2015, 37: 2445-52.），向上述制备获得的13869感受态细胞电转化1 μg的pK18-YggB^A111V质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养1天，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养6 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得L-谷氨酸生产菌株SCgGC5。本实施例所用引物见表2。

表2本实施例所用引物

引物	核苷酸序列
		A111V-UH-F	tgacatgattacgaattcATCCACTGGAGTTTTGCCAATTCTC
A111V-UH-R	gtcttggtGTGcagtcgattgttgcg
		A111V-DH-F	atcgactgCACaccaagaccaatggc
A111V-DH-R	cgacggccagtgccaagcttTGGAGGAATAGAGCGGGTCATACAC

采用文献报道的方法制备L-谷氨酸生产菌株SCgGC5感受态细胞，向上述制备获得的SCgGC5感受态细胞电转化1 μg的pK18-NagA1^A317V质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养24h，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养4 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得带有突变型NagA1的L-谷氨酸生产菌株SCgGC5-NagA1^A317V。即该菌株中含有了突变后的NagA1（其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示）。

SEQ ID NO：1序列如下：

MAEVVHYQENAGQAVKKIEGRIVAPHGVIDGFLQLENGIITELSGEPAPKNAGFHPELPTIVPGFIDLHNHGGNGGAFPTGTQDQARNAAQYHREHGTTVMLASMVSAPADALAAQVENLIPLCEEGLLCGIHLEGPFINACRCGAQNPDFIFPGNPTDLARVIHAGKGWIKSITVAPETDNLSELLDLCAAHHIIASFGHTDADFDTTTSAIALAKEKNVTVTATHLFNAMPPLHHRAPGSVGALLAAARAGDAYVELIADGVHLADGTVDLARSNNAFFITDAMEAAGMPDGEYILGVLNVTVTDGVARLRDGGVIAGGTSTLASQFVHHVRRGMTLIDATLHTSTVAAKILGLGDHEIAKSNPANFVVFDSNGQVQKVHLGHQVL。

SEQ ID NO：2序列如下：

atggcagaagtggtgcattatcaagaaaatgcaggtcaagcagttaaaaaaattgagggaagaattgttgccccccacggggtgattgatggctttctccaactcgaaaacggcatcatcacggaactctctggagaaccagcacctaaaaacgcaggattccaccccgaactccccacgattgttcccggttttattgatcttcataatcacggtggaaacggtggcgcgtttcctacgggaacgcaggaccaggcgaggaacgccgcgcagtatcaccgcgaacatggcacgaccgtgatgttggcaagcatggtttcggcgccggctgacgcactggcagcgcaggtggaaaaccttattcccttgtgtgaagagggcctgctgtgcggcattcacctcgagggccctttcatcaacgcatgccgttgtggtgctcaaaacccggatttcatttttcccggcaacccaacagatcttgcccgggtgatccatgcgggaaaaggttggatcaaatcgatcacagtagcgccggaaactgacaatctttctgagcttctcgatctctgcgcagcgcaccacatcattgcttccttcgggcacactgatgcagattttgataccactaccagcgcaattgccttggctaaagagaaaaatgtgacggtcacggctacgcatttgttcaatgcgatgcctccgctgcatcatagggctcccggcagcgtgggcgctttgcttgctgcggcacgtgccggggacgcatatgttgagttgatcgccgacggcgtgcatttggccgatggaacggtcgatctagctcgttccaacaacgcctttttcatcacggacgccatggaagccgccggaatgccagacggtgagtacattttgggcgttttgaacgtcaccgtcaccgatggagtcgcccgtctgcgcgatggcggcgTcatcgccgggggcaccagcacactagcgagtcagttcgtgcaccacgtgcgcaggggtatgacgcttatcgacgcgaccctccacacctcaaccgtcgccgctaaaattctcggtcttggcgatcacgaaatcgctaaatccaaccctgcaaattttgtggtctttgactcaaacggccaggtgcaaaaggtccatttaggtcatcaagtactttaa。

实施例3 谷氨酸棒杆菌NagA1缺失菌株的构建

根据已报道的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869中的野生型NagA1基因序列（如SEQ IDNO：4所示），分别设计引物NagA1-F3/R3和NagA1-F4/R4，以ATCC 13869基因组为模板通过PCR扩增获得用于NagA1缺失的上下游同源臂。根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mobsacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。上述三片段回收后重组连接，获得NagA1基因的缺失载体pK18-ΔNagA1。

按照实施例2中的转化方法，将上述载体pK18-ΔNagA1转化至SCgGC5感受态细胞，并按照实施例2中的步骤进行筛选，最终获得NagA1缺失的L-谷氨酸生产菌株SCgGC5-ΔNagA1。

实施例4 基于dCas9的NagA1弱化菌株构建

首先将pCas9 (LIU, Jiao, et al. Development of a CRISPR/Cas9 genomeediting toolbox for Corynebacterium glutamicum. Microbial cell factories,2017, 16.1: 205)质粒的Cas9基因进行D10A和H840A突变，同时将质粒骨架中的BsaI酶切位点去除，获得pdCas9质粒；再从pnCas9(D10A)‐AID‐gRNA‐ccdB ^TS (WANG, Yu, et al.Expanding targeting scope, editing window, and base transition capability ofbase editing in Corynebacterium glutamicum. Biotechnology and bioengineering,2019，116：3016-3029)质粒上扩增gRNA‐ccdB表达盒克隆至pdCas9的相同位置，获得可以高效构建的CRISPRi质粒pdCas9gRNA-ccdB。

利用上述基于dCas9的弱化系统，构建NagA1的弱化载体及其对照载体。根据已报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组序列，分别设计引物dCas-F/R，两条引物通过变性和退火程序，获得互补区片段。上述片段与BsaI酶切处理的pdCas9-ccdB质粒通过Goldengate连接，构建获得带有gRNA-NagA1的弱化载体pdCas-NagA1。将上述重组载体pdCas-NagA1转化SCgGC5菌株，获得NagA1的弱化菌株SCgGC5/pdCas-NagA1。本实施例所用引物见表3。

表3本实施例所用引物

引物	核苷酸序列
		NagA1-F3	tgacatgattacgaattcGACCTTTGTCAGTCCTGACAGAGAA
NagA1-R3	GAAATCGCTAAATCCAACCCTGCAA
		NagA1-F4	gttggatttagcgatttcATCAATCACCCCGTGGGG
NagA1-R4	cgacggccagtgccaagcttAGTGTTCTTCAATTTCCACATCGTG
		dCas-F	TTCAGGCATCATCACGGAACTCTC
dCas-R	AAACGAGAGTTCCGTGATGATGCC

实施例5 各菌株的L-谷氨酸产量验证

为了验证敲除、弱化NagA1，以及NagA1^A317V突变对谷氨酸产量的效果，对上述构建的SCgGC5、SCgGC5-NagA1^A317V、SCgGC5-ΔNagA1、SCgGC5/pdCas-NagA1菌株进行发酵测试，同时以菌株ATCC13869作为对照。

首先将菌株接种到种子培养基中培养8 h，培养物作为种子接种到每孔含有800 μL发酵培养基的24孔板中，初始OD₆₀₀控制约为0.5，孔板摇床转速为800 rpm，每个菌株3个平行，30℃培养，17 h、20 h和23 h补加5 g/L尿素，25 h发酵结束，检测L-谷氨酸产量和葡萄糖消耗量，并计算从葡萄糖到L-谷氨酸的糖酸转化率。结果如表4所示。

表4 L-谷氨酸生产

菌株	L-谷氨酸（g/L）	糖酸转化率（g/g，%）
			ATCC13869	0.20±0.12	0.27±0.00
SCgGC5	4.50±0.22	5.86±0.33
			SCgGC5-NagA1A317V	5.20±0.35	6.76±0.41
SCgGC5-ΔNagA1	5.10±0.36	6.56±0.28
			SCgGC5/pdCas-NagA1	5.17±0.27	6.57±0.32

从表中可知，敲除、弱化NagA1，以及NagA1^A317V突变能够明显提高L-谷氨酸产量及糖酸转化率，在L-谷氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景。

Claims (10)

1.一种产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株中存在下述突变，即N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶编码基因失活或表达弱化，或所述菌株中含有表达N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶编码基因的突变体。

2.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述突变体编码的氨基酸序列对应于SEQID NO:3的第317位的丙氨酸被缬氨酸取代；

优选地，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株中NCgl1221基因或其同源基因（如BBD29_06760或yggB）存在突变以使所述菌株具有更高的产L-谷氨酸能力。

4.如权利要求3所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株中NCgl1221基因或其同源基因（如BBD29_06760或yggB）编码的氨基酸序列的第111位丙氨酸被缬氨酸取代。

5.如权利要求1至4任一项所述谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述突变通过基因编辑方法引入所述菌株中。

6.一种N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶突变体，其特征在于，所述突变体在对应于SEQ ID NO:3的317位的丙氨酸被缬氨酸取代。

7.如权利要求6所述N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶突变体的编码核酸。

8.如权利要求6所述的N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶突变体或其编码核酸在生产L-谷氨酸中的应用。

9.如权利要求6所述的N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶突变体或其编码核酸在制备生产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌中的应用。

10.一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，包括培养如权利要求1至5任一项所述的谷氨酸棒杆菌使之生产L-谷氨酸，进一步包括从培养基中分离提取或回收L-谷氨酸的步骤。