KR20220101509A - GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법에 관한 것으로서, 일 예에 따른 GlxR 단백질 변이체는 미생물에 도입되어, 부산물의 생산량을 감소시키고, 쓰레오닌 생산능을 현저히 증가시킬 수 있다.

Description

GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법{GlxR protein variant or threonine production method using the same}

본 출원은 GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 또는 식품 첨가제, 의약품의 합성원료 및 의약용 수액제로 사용되고 있다. L-쓰레오닌은 주로 미생물 발효기술에 의해 생산되며, 예를 들면, 에스케리키아 (Escherichia), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 세라티아 (Serratia), 또는 프로비덴시아 (Providencia) 속 미생물 등을 이용하여 생산될 수 있다.

최근에는 코리네박테리움 속 균주를 이용한 L-쓰레오닌의 제조방법을 개선하기 위하여 많은 시도가 행해지고 있다. 유전자 재조합 기술이 발전함에 따라 무작위적 돌연변이법에 의해 개발된 L-쓰레오닌 생산주를 대상으로 부위특이적인 유전자 치환, 유전자증폭 및 결실 등을 도입하여 보다 향상된 L-쓰레오닌 생산주의 개발에 대한 기술들이 보고되고 있다. 또한, 다른 박테리아 유래의 외래 유전자를 도입하는 시도도 있다.

이와 같은 노력에도, L-쓰레오닌과 같은 유용 물질의 생산능을 향상시키는 기술의 개발은 여전히 요구되고 있다.

미국 공개특허 제2016-0369310호

일 예는 신규한 GlxR 단백질 변이체를 제공한다. 상기 GlxR 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 45번째, 66번째, 166번째, 및 168번째로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 및/또는 이에 (상기 선택된 하나 이상의 위치에) 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 대사과정을 조절하는 주요 전사 조절자 (transcriptional regulator)의 기능을 갖는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 GlxR 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

다른 예는 상기 GlxR 단백질 변이체, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 이의 조합을 포함하는 미생물을 제공한다.

다른 예는 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 쓰레오닌의 생산 방법을 제공한다.

상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.

본 출원에서 제공되는 일 예는 GlxR 단백질 및/또는 이를 암호화하는 glxR 유전자를 개량하여 쓰레오닌의 생산량이 향상된(증가된) 균주를 개발하는 것과 관련된 기술을 제공한다. 일 예에서 상기 쓰레오닌은 L-쓰레오닌일 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 일 양상은 GlxR 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 45번째, 66번째, 166번째, 및 168번째로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 및/또는 이에(상기 선택된 하나 이상의 위치에) 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 다른 종류의 아미노산 잔기로 치환된, GlxR 단백질 변이체를 제공하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, “GlxR (CRP-like cyclic AMP-dependent global transcriptional regulator; 예를 들면, Cg0350)”은 탄소 대사 뿐만 아니라 다양한 세포 기능을 조절에 관여하여 다양한 유전자를 조절하는 글로벌 조절인자(global regulator)를 의미할 수 있고, 예를 들면, 글리옥실산 바이패스 효소인 이소시트르산 분해효소 (isocitrate lyase) 및/또는 말레이트 합성효소 (malate synthase)를 암호화하는 유전자 (예를 들면, aceA(cg2560) 및 aceB(cg2559))의 발현을 조절하는 것일 수 있다.

상기 GlxR 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 GlxR 단백질을 암호화하는 glxR 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하거나 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열번호 2의 핵산 서열은 하기 표 1에 기재하였다.

상기 GlxR 단백질의 아미노산 서열 및 GlxR 단백질을 암호화하는 유전자(예를 들면, glxR)의 염기 서열(핵산 서열)은 미국 생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 당업계에 공지된 데이터 베이스로부터 용이하게 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. WP_003855810.1일 수 있다.

명칭	서열	서열번호
GlxR_amino acid	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGEPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 1
glxR_nucleic acid	GTGGAAGGTGTACAGGAGATCCTGTCGCGCGCCGGAATTTTTCAAGGCGTTGACCCAACGGCAGTCAATAACCTCATCCAGGATATGGAGACCGTTCGCTTCCCACGCGGAGCAACCATCTTCGACGAGGGCGAGCCAGGTGACCGCCTTTACATCATCACCTCCGGCAAAGTGAAGCTTGCGCGCCACGCACCGGACGGCCGCGAAAACCTGCTGACCATCATGGGTCCTTCCGACATGTTCGGTGAGCTCTCCATCTTCGACCCAGGCCCACGCACCTCCTCTGCAGTGTGTGTCACCGAAGTTCATGCAGCAACCATGAACTCTGACATGCTGCGCAACTGGGTAGCTGACCACCCAGCTATCGCTGAGCAGCTCCTGCGCGTTCTGGCTCGTCGTCTGCGTCGCACCAACGCTTCCCTGGCTGACCTCATCTTCACCGACGTCCCAGGCCGCGTTGCTAAGACCCTTCTGCAGCTGGCTAACCGCTTCGGCACCCAAGAAGCTGGCGCGCTGCGCGTGAACCACGACCTCACTCAGGAAGAAATCGCACAGCTCGTCGGTGCTTCCCGTGAAACTGTGAATAAGGCTCTTGCAACGTTCGCACACCGTGGCTGGATTCGCCTCGAGGGCAAGTCCGTCCTCATTGTGGACACCGAGCATTTGGCACGTCGCGCTCGATAA	서열번호 2

본 출원에서 용어, "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.

예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.

이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.

본 출원에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 "특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 포함한다 또는 상기 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다. 일 예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 "특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 포함한다 또는 상기 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 (i) 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 목적하는 기능은 미생물의 L-쓰레오닌 생산능을 증가시키거나 부여하는 기능을 의미할 수 있다.

본 출원에서, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성의 퍼센트를 의미한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자간의 서열 정보, 예를 들면 점수(score), 동일성(identity), 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 확인함으로써 결정할 수 있다.

본 출원에서, ‘상동성 (homology)’ 또는 ‘동일성 (identity)’은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터, 45번째, 66번째, 166번째, 및 168번째로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 및/또는 이에(상기 선택된 하나 이상의 위치에) 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 GlxR 단백질 변이체를 제공할 수 있다. 상기 “다른 아미노산” 이란 서열번호 1의 45번째, 66번째, 166번째, 및 168번째로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 및/또는 이에(상기 선택된 하나 이상의 위치에) 상응하는 위치에 위치하는 아미노산을 제외한 다른 아미노산을 의미할 수 있다.

일 예에 따른 변이체는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열에서 서열번호 1의 아미노산 서열의 45번째, 66번째, 166번째, 및 168번째로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 및/또는 이에(상기 선택된 하나 이상의 위치에) 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 다른 종류의 아미노산 잔기로 치환된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 GlxR 단백질과 동일하거나 상응하는 활성을 갖는 단백질이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

일 예에서, 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 군에서 선택된 변이를 포함하는, GlxR(glyoxylate bypass regulator) 단백질 변이체를 제공할 수 있다:

(1) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 45번째 아미노산 잔기(예를 들면, 글루탐산(glutamic acid, 글루타메이트, glutamate))가 알라닌(alanine), 세린(serine), 페닐알라닌(phenylalanine), 또는 라이신(lysine)으로 치환;

(2) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 66번째 아미노산 (예를 들면, 아스파르트산(aspartic acid, 아스파테이트, aspartate)) 잔기가 알라닌(alanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 또는 라이신(lysine)으로 치환;

(3) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 166번째 아미노산 잔기(예를 들면, 쓰레오닌(threonine))가 아스파르트산(aspartic acid, aspartate), 페닐알라닌(phenylalanine), 또는 라이신(lysine)으로 치환; 및

(4) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 168번째 아미노산 잔기(예를 들면, 글루탐산)가 알라닌(alanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 또는 라이신(lysine)으로 치환.

또한, 본 출원의 변이체는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 45번째, 66번째, 166번째, 및 168번째로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 및/또는 이에(상기 선택된 하나 이상의 위치에) 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 다른 종류의 아미노산 잔기로 치환되고, 상기 서열번호 3 내지 15 중 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

상기 “보존적 치환(conservative substitution)”은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 “변이체”는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 GlxR 단백질 변이체는 서열번호 3 내지 서열번호 15로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 서열번호 3 내지 서열번호 15의 아미노산 서열은 하기 표 2에 기재하였다.

명칭	서열	서열번호
GlxR_E45A	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGAPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 3
GlxR_E45S	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGSPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 4
GlxR_E45F	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGFPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 5
GlxR_E45K	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGKPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 6
GlxR_D66A	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGEPGDRLYIITSGKVKLARHAPAGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 7
GlxR_D66F	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGEPGDRLYIITSGKVKLARHAPFGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 8
GlxR_D66K	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGEPGDRLYIITSGKVKLARHAPKGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 9
GlxR_T166D	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGEPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGDQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 10
GlxR_T166F	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGEPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGFQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 11
GlxR_T166K	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGEPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGKQEAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 12
GlxR_E168A	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGEPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQAAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 13
GlxR_E168F	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGEPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQFAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 14
GlxR_E168K	MEGVQEILSRAGIFQGVDPTAVNNLIQDMETVRFPRGATIFDEGEPGDRLYIITSGKVKLARHAPDGRENLLTIMGPSDMFGELSIFDPGPRTSSAVCVTEVHAATMNSDMLRNWVADHPAIAEQLLRVLARRLRRTNASLADLIFTDVPGRVAKTLLQLANRFGTQKAGALRVNHDLTQEEIAQLVGASRETVNKALATFAHRGWIRLEGKSVLIVDTEHLARRAR	서열번호 15

일 예에 따른 GlxR 단백질 변이체는 변이 전의 GlxR 단백질 (예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 GlxR 단백질)과 같이, 글로벌 전사 조절자 (global transcriptional regulator)로서, 예를 들면, 글리옥실산 바이패스 유전자 (glyoxylate bypass genes; 예를 들면, ace A 및/또는 ace B)에 대한 조절자(regulator)의 기능을 갖는 것일 수 있다.

일 예에 따른 GlxR 단백질 변이체는 변이 전의 GlxR 단백질 (야생형 단백질 (예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 GlxR 단백질)) 보다 활성이 약화된 것일 수 있다. 상기 “GlxR 단백질의 활성이 약화”되었다는 것은 세포 내에서 글로벌 전사 조절자의 활성 정도가 변이 전의 단백질에 비하여 감소된 경우를 의미할 수 있다. 상기 약화는 GlxR 단백질을 암호화하는 유전자의 변이 등으로 단백질 자체의 활성이 본래 미생물 (예를 들면, 야생형, 모균주, 숙주 미생물, 비변형 미생물 등)이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, GlxR 단백질을 암호화하는 유전자의 전사(transcription) 저해 및/또는 번역(translation) 저해 등으로 상기 효소의 발현 수준이 저하되어 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함할 수 있다.

본 출원에서, 상기 GlxR 단백질 변이체는 변이형 GlxR 단백질, GlxR 변이체, 변이형 GlxR과 동일한 의미로 사용될 수 있다.

다른 양상은 GlxR 단백질 변이체를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다.

본 출원에서, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 일 예에 따른 GlxR 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면, 제한 없이 포함될 수 있다. 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터, 45번째, 66번째, 166번째, 및 168번째로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 및/또는 이에(상기 선택된 하나 이상의 위치에) 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 GlxR 단백질 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 상기 핵산 서열로 이루어질 수 있고, 예를 들면 서열번호 3 내지 서열번호 15로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 상기 핵산 서열로 이루어질 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 일 예에 따른 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 일 예에 따른 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 3 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 이와 상동성(또는 동일성)을 가지는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있다.

일 예에 따른 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 “엄격한 조건(stringent condition)”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들면, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 본 출원에서, “상보적”은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 50℃ 내지 65℃(예를 들면, 55 ℃)의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대,J. J.Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터를 제공할 수 있다. 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서, “벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일 예에서, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 단백질(예를 들면, GlxR 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 변이형 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 출원에서, "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드(예를 들면, 상기 GlxR 변이체)를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환시키는 방법은 유전자를 세포 내로 도입하는 방법이면 제한 없이 포함되며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및/또는 초산 리튬-DMSO법 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질(예를 들면, 상기 GlxR 변이체)을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열을 함유하는 DNA 제조물일 수 있다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서, "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

또 다른 양상은 상기 GlxR 단백질 변이체, 상기 GlxR 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 미생물 (또는, 균주, 재조합 세포)을 제공할 수 있다. 본 출원에서 “미생물”은 단세포 박테리아를 포함하는 것일 수 있다.

본 출원에서, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.

상기 미생물(또는, 균주, 재조합 세포)은 상기 GlxR 단백질 변이체, 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드 및 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 균주; 상기 GlxR 단백질 변이체 또는 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 균주; 상기 GlxR 단백질 변이체, 또는 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주 (예컨대, 재조합 균주); 또는 상기 GlxR 단백질 변이체 활성을 갖는 균주 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 예에서, 상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 쓰레오닌(예를 들면, L-쓰레오닌) 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 비변형 미생물, 재조합 전의 세포, 모균주, 및/또는 야생형 균주 보다 쓰레오닌 생산능이 향상되거나, 쓰레오닌 생산능이 없는 비변형 미생물, 재조합 전의 세포, 모균주 및/또는 야생형 균주와는 달리 쓰레오닌 생산능이 부여된 것일 수 있다.

본 출원에서, “쓰레오닌(예를 들면, L-쓰레오닌) 생산능을 갖는다”는 것은 자연적으로 쓰레오닌 생산능을 갖는 세포 및/또는 미생물, 또는 쓰레오닌 생산능이 없는 모균주에 쓰레오닌 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 일 예에 따른 GlxR 단백질 변이체가 도입됨으로써 상기 미생물이 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 경우 및/또는 L-쓰레오닌 생산능을 갖지 않는 미생물에 상기 GlxR 단백질 변이체가 도입됨으로써 상기 미생물이 L-쓰레오닌 생산능을 갖게 되는 경우를 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물이란 천연형 미생물 자체 또는 쓰레오닌 생산 기작과 관련된 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 약화 또는 불활성시켜 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미할 수 있다.

일 예에 따른 GlxR 단백질 변이가 도입된 미생물은 동종의 비변형 미생물과 비교하여, 쓰레오닌(예를 들면, L-쓰레오닌) 생산이 증가된 것일 수 있다. 본 출원에서, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 일 예에 따른 GlxR 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 “변형 전 균주”, “변형 전 미생물”, “비변이 균주”, “비변형 균주”, “비변이 미생물” 또는 “기준 미생물”과 혼용될 수 있다. 상기에서 GlxR 단백질 변이가 미생물에 도입된다는 것은 상기GlxR 단백질 변이체, 상기 GlxR 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 미생물에 도입하는 것을 의미할 수 있다. 일 예에서 상기 쓰레오닌 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 단백질 비변형 미생물은 ATCC13032 균주, KCCM12000P 균주, 및/또는 KCCM12120P 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, 쓰레오닌 생산능이 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 10.5% 이상, 약 11% 이상, 약 11.5%이상, 약 12% 이상, 약 12.5% 이상, 약 13% 이상, 약 13.5% 이상, 약 14% 이상, 약 14.5% 이상, 약 15% 이상, 약 15.5% 이상, 약 16% 이상, 약 16.5% 이상, 약 17% 이상, 약 17.5% 이상, 약 18% 이상, 약 18.5% 이상, 약 19% 이상, 약 19.5% 이상, 약 20% 이상, 약 20.5% 이상, 약 21% 이상, 약 21.5% 이상, 약 22% 이상, 약 22.5% 이상, 약 23% 이상, 약 23.5% 이상, 약 24% 이상, 약 24.5% 이상, 약 25% 이상, 약 25.5% 이상, 약 26% 이상, 약 26.5% 이상, 약 27% 이상, (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 또는 약 35% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, 쓰레오닌 생산능이 약 1.1배 이상 약 1.12배 이상, 약 1.13배 이상, 1.15배 이상, 1.16배 이상, 1.17배 이상, 1.18배 이상, 1.19배 이상, 약 1.2 배 이상, 약 1.25배 이상, 약 1.26배 이상, 또는 약 1.3배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 또는 약 2배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있다. 상기 용어 “약(about)”은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 삽입 또는 숙주 세포 내재 유전자 (예를 들면, glxR 유전자)가 GlxR 단백질 변이체를 암호화하도록 하는 변이 도입은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들면, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease ystem; 예를 들면, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이의 암호화 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물(예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예컨대, 리보핵산 융합단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 함께 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에 따른 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형(예컨대, 상술한 단백질 변이체를 코딩하기 위한 변형)은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)는 추가적으로 쓰레오닌 생산이 증가되도록 하는 변이를 포함할 수 있고, 상기 변이의 위치 및/또는 변이 대상이 되는 유전자 및/또는 단백질의 종류는 쓰레오닌 생산이 증가되도록 하는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 재조합 세포는 형질전환이 가능한 세포라면 제한 없이 사용 가능할 수 있다.

상기 GlxR 단백질 변이가 도입되어 쓰레오닌 생산능이 증가되거나 쓰레오닌 생산능이 부여된 미생물과 구별하기 위하여 GlxR 단백질 변이가 도입되기 전의 미생물을, 상기 GlxR 단백질 변이가 도입되기 전의 미생물을 숙주 미생물(또는 모균주, 비변형 미생물)로 표현할 수 있다.

일 예에서, 상기 GlxR 단백질 변이체, 상기 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물은,

(i) 유전체(genome)에 더하여, 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 재조합 벡터를 추가로 포함하거나, 및/또는

(ii) 내재의 GlxR 단백질 암호화 유전자 (예를 들면, glxR 유전자)로서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 의미할 수 있다.

상기 (ii) "내재의 GlxR 단백질 암호화 유전자 (예를 들면, glxR 유전자)로서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함" 한다는 것은 (a) 상기 폴리뉴클레오티드가 내재의 GlxR 단백질 암호화 유전자 (예를 들면, glxR 유전자)를 대체하여 포함(삽입)되거나, 및/또는 (b) 내재의 GlxR 단백질 암호화 유전자 (예를 들면, glxR 유전자)가 유전자 교정 (gene editing) 기술에 의하여 상기 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열 (즉, GlxR 단백질 변이체를 암호화하는 핵산 서열)을 가지도록 변이되는 것을 의미하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 GlxR 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자는 숙주 미생물 유래(내재)의 것 또는 이와 다른 미생물 유래(외래)의 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드가 염색체 내에 통합된 것일 수 있고, 예를 들면, 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드는 염색체 내의 유전자 부위에서 천연(native) glxR 유전자에 대해 교환되거나 추가의 유전자 부위에 통합된 것일 수 있다.

상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물일 수 있다.

상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아 게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris), 및/또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens) 등일 수 있다.

상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 형질전환을 통해 인공적으로 제조되거나, 또는 자연적으로 발생되는 것을 모두 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 일 예에 따른 GlxR 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.

상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드 서열이 염색체 내에 통합된 것일 수 있다. 상동 재조합은 일 예에 따른 벡터의 사용과 함께, 벡터에 의해 세포 내로 전달되는 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드에 대한 염색체 상의 DNA 절편의 교환을 허용한다. 벡터의 고리형 DNA 분자 및 염색체 상의 표적 DNA 사이의 효율적인 재조합을 위해, 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 교환될 DNA 영역에는 단부에 표적 부위에 상동성인 뉴클레오티드 서열이 제공되고; 이들은 벡터의 통합 및 DNA의 교환 부위를 결정한다. 예를 들면, 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드는 염색체 내에서 천연 유전자 부위에서 천연 glxR 유전자에 대해 교환될 수 있거나 추가의 유전자 부위에 통합될 수 있다.

다른 양상은 상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 쓰레오닌(threonine)의 생산 방법을 제공할 수 있다. 상기 쓰레오닌은 L-쓰레오닌일 수 있다. 상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 출원에서, "배양"은 상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있고 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다. 상기 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture), 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원에서, "배지"는 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 일 예에 따른 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 일 예에 따른 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

일 예에서, 미생물(또는 균주, 재조합 세포)을 배양하기 위한 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)] 을 참조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 예에 따르면, 상기 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 예에 따르면, 상기 배양 온도는 20℃ 내지 45℃, 25℃ 내지 40℃, 또는 30℃ 내지 37℃를 유지할 수 있다. 배양기간은 유용물질(예를 들면, L-쓰레오닌)이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면, 10 내지 160 시간일 수 있다.

일 예에 따른 쓰레오닌 생산방법은, 일 예에 따른 미생물(또는 균주, 재조합 세포)를 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.

일 예에 따른 쓰레오닌 생산방법은, 배양된 배지(배양 배지) 및/또는 미생물(또는 균주, 재조합 세포)에서 쓰레오닌을 분리 및/또는 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다. 상기 배양 배지는 미생물(또는 균주, 재조합 세포)를 배양한 배지를 의미할 수 있다

상기 쓰레오닌을 분리 및/또는 회수하는 단계는 배양방법(예를 들면, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등)에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지, 배양액, 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산 (예를 들면, L-쓰레오닌)을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들면, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), HPLC, 및/또는 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성, 액체, 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일 예에 따른 쓰레오닌의 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 상기 쓰레오닌 생산방법이 분리 및/또는 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 쓰레오닌을 정제하는 단계를 상기 분리 및/또는 회수하는 단계 이전이나 이후에 추가적으로 포함하거나 상기 분리 및/또는 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 이시적(또는 연속적)으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 양상은 상기 GlxR 단백질 변이체, 상기 GlxR 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 미생물(또는 균주, 재조합 세포)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 쓰레오닌(예를 들면, L-쓰레오닌) 생산용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 배지, 및 쓰레오닌 등은 전술한 바와 같다.

일 예에서, 상기 생산용 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 양상은 상기 GlxR 단백질 변이체, 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입(예를 들면, 형질전환)시키는 단계를 포함하는, 상기 미생물의 쓰레오닌(예를 들면, L-쓰레오닌) 생산능 증가 방법 또는 상기 미생물에 쓰레오닌(예를 들면, L-쓰레오닌) 생산능을 부여하는 방법을 제공할 수 있다.

일 예에 따른 GlxR 단백질 변이체는 미생물에 도입되어, 부산물의 생산량을 감소시키고, 쓰레오닌 생산능을 현저히 증가시킬 수 있다.

이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

　

실시예 1: glxR 유전자 ORF내 변이 도입용 벡터 라이브러리 제작

　

코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)의 GlxR 단백질(서열번호 1) 의 발현량 또는 이의 활성이 변화된 변이체를 발굴하기 위하여 아래의 방법으로 벡터 라이브러리를 제작하였다.

먼저 WT 균주(ATCC13032)로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 glxR 유전자의 염기 서열(서열번호 2) 에서 133 내지 135번째, 196 내지 198번째, 496 내지 498번째, 502 내지 504번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 1000bp 떨어진 위치에 5’단편 및 3’단편에 제한효소 SmaI 인식부위를 삽입한 프라이머 서열번호 16 및 서열번호 17을 합성하였다.

구체적으로, glxR 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들 (각 1000bp)이 pDZ 벡터(대한민국 공개특허 제10-2008-0025355호)에 연결된 형태로 제작되었다. WT 균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 16 및 18을 이용, 3’말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 17 및 19를 이용하여 PCR을 통해 제작되었다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 24회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다.

한편 제한효소 SmaI으로 처리한 후 65℃에서 60분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 20 및 21을 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-glxR(E45A)로 명명하였다.

동일한 방법으로 프라이머 서열번호 16 및 28, 17 및 29를 이용하여 pDZ-glxR(D66A), 프라이머 서열번호 16 및 34, 17 및 35를 이용하여 pDZ-glxR(T166D), 프라이머 서열번호 16 및 40, 17 및 41을 이용하여 pDZ-glxR(E168A)을 제작하였다.

본 실시예에서 사용한 프라이머의 핵산 서열은 하기 표 3에 기재하였다.

명칭	서열 (5’->3’)	서열번호
glxR L1	GAATTCGAGCTCGGTACCCTGAGACCCCACGCGAG	서열번호 16
glxR R2	GACTCTAGAGGATCCCCATCGACGGTGTCACCCCAC	서열번호 17
glxR(E45A) L2	GTAAAGGCGGTCACCTGGCgCGCCCTCGTCGAAGATGG	서열번호 18
glxR(E45A) R1	CCATCTTCGACGAGGGCGcGCCAGGTGACCGCCTTTAC	서열번호 19
pDZ_F	TATTACGCCAGCTGGCGAAAG	서열번호 20
pDZ_R	TTCCGGCTCGTATGTTGTGTG	서열번호 21
glxR(E45S) L2	GTAAAGGCGGTCACCTGGagaGCCCTCGTCGAAGATGG	서열번호 22
glxR(E45S) R1	CCATCTTCGACGAGGGCtctCCAGGTGACCGCCTTTAC	서열번호 23
glxR(E45F) L2	GTAAAGGCGGTCACCTGGaaaGCCCTCGTCGAAGATGG	서열번호 24
glxR(E45F) R1	CCATCTTCGACGAGGGCtttCCAGGTGACCGCCTTTAC	서열번호 25
glxR(E45K) L2	GTAAAGGCGGTCACCTGGCTtGCCCTCGTCGAAGATGG	서열번호 26
glxR(E45K) R1	CCATCTTCGACGAGGGCaAGCCAGGTGACCGCCTTTAC	서열번호 27
glxR(D66A) L2	GGTTTTCGCGGCCtgCCGGTGCGTGGCGCGCAAG	서열번호 28
glxR(D66A) R1	GCGCCACGCACCGGcaGGCCGCGAAAACCTGCTG	서열번호 29
glxR(D66F) L2	CAGCAGGTTTTCGCGGCCaaaCGGTGCGTGGCGC	서열번호 30
glxR(D66F) R1	GCGCCACGCACCGtttGGCCGCGAAAACCTGCTG	서열번호 31
glxR(D66K) L2	GGTTTTCGCGGCCtttCCGGTGCGTGGCGCGCAAG	서열번호 32
glxR(D66K) R1	GCGCCACGCACCGaaaGGCCGCGAAAACCTGCTG	서열번호 33
glxR(T166D) L2	GCCAGCTTCTTGGtcGCCGAAGCGGTTAGCCAGC	서열번호 34
glxR(T166D) R1	AACCGCTTCGGCgaCCAAGAAGCTGGCGCGCTG	서열번호 35
glxR(T166F) L2	GCCAGCTTCTTGGaaGCCGAAGCGGTTAGCCAGC	서열번호 36
glxR(T166F) R1	AACCGCTTCGGCttCCAAGAAGCTGGCGCGCTG	서열번호 37
glxR(T166K) L2	GCCAGCTTCTTGtttGCCGAAGCGGTTAGCCAGC	서열번호 38
glxR(T166K) R1	AACCGCTTCGGCaaaCAAGAAGCTGGCGCGCTG	서열번호 39
glxR(E168A) L2	AGCGCGCCAGCagCTTGGGCGCCGAAGCGGTTAG	서열번호 40
glxR(E168A) R1	CTTCGGCGCCCAAGctGCTGGCGCGCTGCGCGTG	서열번호 41
glxR(E168F) L2	AGCGCGCCAGCaaaTTGGGCGCCGAAGCGGTTAG	서열번호 42
glxR(E168F) R1	CTTCGGCGCCCAAtttGCTGGCGCGCTGCGCGTG	서열번호 43
glxR(E168K) L2	AGCGCGCCAGCcttTTGGGCGCCGAAGCGGTTAG	서열번호 44
glxR(E168K) R1	CTTCGGCGCCCAAaagGCTGGCGCGCTGCGCGTG	서열번호 45

상기와 같이 서열번호 1의 45번째, 66번째, 166번째, 168번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 폴리펩타이드를 포함하는 총 4종의 벡터 pDZ-glxR(E45A), pDZ-glxR(D66A), pDZ-glxR(T166D), pDZ-glxR(E168A)를 제작하였고, 이 벡터들은 각각 GlxR 단백질의 45번째 아미노산 글루타메이트(글루탐산, E)을 알라닌(A)으로, 66번째 아미노산 아스파테이트(아스파르트산, D)를 알라닌(A)으로, 166번째 아미노산 쓰레오닌(T)을 아스파테이트(D)로, 168번째 아미노산 글루타메이트(E)을 알라닌(A)으로 치환할 수 있는 벡터이다.

실시예 2: 야생형 코리네박테리움속 미생물 기반 glxR 변이주의 L-쓰레오닌 생산능 평가

본 실시예에서, 야생종 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 기반으로, ATCC13032균주가 내재적으로 갖는 야생형 GlxR 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 1)에서 45번째 아미노산인 글루타메이트를 알라닌으로, 66번째 아미노산인 아스파테이트를 알라닌으로, 166번째 아미노산인 쓰레오닌을 아스파테이트로, 168번째 아미노산인 글루타메이트를 알라닌으로 각각 치환된 glxR 변이주의 L-쓰레오닌 생산능을 평가해 보고자 하였다.

실시예 1에서 제작한 pDZ-glxR(E45A), pDZ-glxR(D66A), pDZ-glxR(T166D), pDZ-glxR(E168A) 벡터를 상기 ATCC13032 균주에 전기펄스법으로 형질 전환하였다. 이와 같이 glxR 유전자에 이종성 염기 치환변이가 도입된 균주를 각각 ATCC13032 △glxR::glxR(E45A), ATCC13032 △glxR::glxR(D66A), ATCC13032 △glxR::glxR(T166D), ATCC13032 △glxR::glxR(E168A)로 명명하였다. ATCC13032 균주를 대조군으로 사용하여 제작된 균주4종 [ATCC13032 △glxR::glxR(E45A), ATCC13032 △glxR::glxR(D66A), ATCC13032 △glxR::glxR(T166D), ATCC13032 △glxR::glxR(E168A)]을 아래와 같은 방법으로 배양하여 당 소모속도, 쓰레오닌 및 라이신 생산 수율을 측정하였다.

먼저, 종 배지 25㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 1㎖의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 24 시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기 표 4에 기재하였다. 배양 종료 후 HPLC (Waters 2478) 이용하여 L-라이신과 L-쓰레오닌의 농도를 측정하였고, Biochemistry analyzer(YSI 2900)를 이용하여 배지 내에 남아있는 당량(잔당량)을 분석하여 당 소모 속도를 측정하였으며, 그 결과는 표 5에 나타내었다.

배지 종류	성분
종 배지 (pH 7.0)	포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
L-쓰레오닌 생산배지 (pH 7.2)	포도당 30g, KH2PO4 2g, Urea 3g, (NH4)2SO4 40g, Peptone 2.5g, CSL(Sigma) 5g(10 ml), MgSO4·7H2O 0.5g, Leucine 400mg, CaCO3 20g(증류수 1 리터 기준)

균주	L-Thr 농도 (g/L)	당 소모속도 (g/hr)	L-LYS 농도 (g/L)
ATCC13032	0	3.65	1.2
ATCC13032 △glxR::glxR* (E45A)	0.22	4.22	0
ATCC13032 △glxR::glxR* (D66A)	0.16	3.98	0.2
ATCC13032 △glxR::glxR* (T166D)	0.1	-	1
ATCC13032 △glxR::glxR* (E168A)	0.06	-	0.7

표 5에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032균주 대비 GlxR 단백질의 45번째, 66번째, 166번째, 및 168번째 아미노산이 각각 치환되었을 때 생산된 L-쓰레오닌의 농도는 증가하고, 부산물인 L-라이신의 농도는 감소하였다.

또한, 표 5에 나타난 바와 같이, GlxR 단백질의 45번째 또는 66번째 아미노산이 알라닌으로 치환되었을 때, 당 소모 속도도 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 모균주 보다 45번째 또는 66번째 아미노산이 알라닌으로 치환된 변이체 (E45A 또는 D66A)가 도입된 균주는 당 소모속도가 빨라지므로, 같은 양의 L-쓰레오닌 생산하는데 걸리는 시간이 단축되며, L-쓰레오닌 생산능이 개선되었다.

실시예 3: glxR 유전자의 45, 66, 166, 168번째 아미노산이 다른 성질의 아미노산으로 치환된 벡터 라이브러리 제작

상기 실시예 2에서 GlxR 단백질의 45, 66, 166, 및 168번째 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환하였을 때 당 소모속도 및 L-쓰레오닌의 생성능이 향상되는 것을 확인하였다. GlxR 단백질 (서열번호 1)의 45, 66, 166, 및 168번째 아미노산을 또 다른 성질의 아미노산으로 치환하였을 때의 효과를 추가로 확인하기 위하여 야생형의 아미노산을 상기 변이를 포함하는 아미노산으로 치환을 시도하였다. 실시예 2에서 확인한 변이인 E45A, D66A, T166D, E168A를 포함한 총 13종의 이종성 염기 치환변이들을 도입하기 위하여 실시예 1과 동일한 방법으로 각각의 재조합 벡터를 제작하였다.　

프라이머 서열번호 16 및 22, 17 및 23을 이용하여 pDZ-glxR(E45S), 프라이머 서열번호 16 및 24, 17 및 25를 이용하여 pDZ-glxR(E45F), 프라이머 서열번호 16 및 26, 17 및 27을 이용하여 pDZ-glxR(E45K), 프라이머 서열번호 16 및 30, 17 및 31을 이용하여 pDZ-glxR(D66F), 프라이머 서열번호 16 및 32, 17 및 33을 이용하여 pDZ-glxR(D66K), 프라이머 서열번호 16 및 36, 17 및 37을 이용하여 pDZ-glxR(T166F), 프라이머 서열번호 16 및 38, 17 및 39를 이용하여 pDZ-glxR(T166K), 프라이머 서열번호 16 및 42, 17 및 43을 이용하여 pDZ-glxR(E168F), 프라이머 서열번호 16 및 44, 17 및 45를 이용하여 pDZ-glxR(E168K) 를 각각 제작하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머의 핵산 서열은 상기 표 3에 기재하였다.

실시예 4: 야생형 코리네박테리움속 미생물 기반 glxR 유전자의 45, 66, 166, 168번째 아미노산 변이주에 대한 L-쓰레오닌 생산능 분석

상기 실시예3에서 제작된 벡터 라이브러리를 ATCC13032 균주에 전기 펄스법으로 형질전환 하였다. 이와 같이 glxR 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 ATCC13032 △glxR::glxR* (E45S), ATCC13032 △glxR::glxR* (E45F), ATCC13032 △glxR::glxR* (E45K), ATCC13032 △glxR::glxR* (D66F), ATCC13032 △glxR::glxR* (D66K), ATCC13032 △glxR::glxR* (T166F), ATCC13032 △glxR::glxR* (T166K), ATCC13032 △glxR::glxR* (E168F), ATCC13032 △glxR::glxR* (E168K)로 명명하였다.

ATCC13032 균주를 대조군으로 사용하여 실시예 2와 같은 방법으로 배양하여 L-쓰레오닌과 L-라이신 생산능, 및 당 소모속도를 측정하고, 그 결과를 표 6에 기재하였다.

균주	L-Thr 농도 (g/L)	당 소모속도 (g/hr)	L-LYS 농도 (g/L)
ATCC13032	0	3.47	0.4
ATCC13032 △glxR::glxR* (E45A)	0.2	4.02	0.4
ATCC13032 △glxR::glxR* (E45S)	0.1	3.50	0.3
ATCC13032 △glxR::glxR* (E45F)	0.1	-	0.4
ATCC13032 △glxR::glxR* (E45K)	0.07	3.66	0.3
ATCC13032 △glxR::glxR* (D66A)	0.22	3.76	0.2
ATCC13032 △glxR::glxR* (D66F)	0.11	-	0.1
ATCC13032 △glxR::glxR* (D66K)	0.06	-	0.4
ATCC13032 △glxR::glxR* (T166D)	0.18	3.86	0.4
ATCC13032 △glxR::glxR* (T166F)	0.07	-	0.3
ATCC13032 △glxR::glxR* (T166K)	0.04	3.52	0.3
ATCC13032 △glxR::glxR* (E168A)	0.15	3.81	0.3
ATCC13032 △glxR::glxR* (E168F)	0.1	-	0.2
ATCC13032 △glxR::glxR* (E168K)	0.05	-	0.1

　실험 결과, GlxR 단백질(서열번호 1)에서 45번째 아미노산인 글루탐산이 알라닌, 세린, 페닐알라닌, 또는 라이신으로 치환된 경우, 균주에 L-쓰레오닌(Thr) 생산능이 부여되었으며, 당 소모속도도 개선되었고, 라이신과 같은 부산물의 생산은 감소하였다. 또한, GlxR 단백질(서열번호 1)에서 66번째 아미노산인 아스파테이트가 알라닌, 페닐알라닌, 또는 라이신으로 치환된 경우, 균주에 L-쓰레오닌 생산능이 부여되었으며, 라이신과 같은 부산물의 생산은 감소하였다. 또한, GlxR 단백질(서열번호 1)에서 166번째 아미노산인 쓰레오닌이 아스파테이트, 페닐알라닌, 또는 라이신으로 치환된 경우, 균주에 L-쓰레오닌 생산능이 부여되었으며, 라이신과 같은 부산물의 생산은 감소하였다. 또한 GlxR 단백질(서열번호 1)에서 168번째 아미노산인 글루탐산이 알라닌, 페닐알라닌, 또는 라이신으로 치환된 경우, 균주에 L-쓰레오닌 생산능이 부여되었으며, L-라이신과 같은 부산물의 생산은 감소하였다.

실시예 5: 쓰레오닌 생산주 기반 glxR 변이주에 대한 L-쓰레오닌 생산능 및 생장 속도 분석

본 실시예에서 glxR 변이 도입에 따른 쓰레오닌 농도 및 생장속도를 보다 명확히 살펴보기 위하여 실시예1에서 제작된 벡터 4종을 L-쓰레오닌 생산 균주에 도입하여 L-쓰레오닌의 생산능을 평가하고자 하였다. L-쓰레오닌 생산 균주를 제작하기 위하여 야생종 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 쓰레오닌 생합성 경로에서 첫번째 중요한 효소로 작용하는 LysC (aspartate kinase)의 피드백 저해(feedback inhibition) 해소를 위해 야생형 LysC 단백질을 암호화하는 유전자의 1128~1131번째 염기서열을 기존 TTG에서 AAG로 바꾸어, 야생형 LysC 단백질의 N 말단에서부터 377번째 아미노산인 류신이 라이신으로 치환된 형태의 변이체 LysC(L377K) 변이가 도입된 균주를 제작하였다. LysC(L377K)의 아미노산 서열은 서열번호 46으로서 하기 표 7에 기재하였다.

변이도입을 위한 재조합벡터는 아래와 같은 방법으로 제작되었다. LysC(L377K) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 ATCC13032 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 lysC 유전자의 1128~1131번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 500bp 떨어진 위치에 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 SmaI 인식 부위를 삽입한 프라이머 서열번호 47 및 48을 합성하였다. LysC(L377K) 이종성 염기 치환변이를 도입하기 위하여 lysC 유전자의 1128~1131번째 염기서열을 치환하기 위한 프라이머 서열번호 49 및 50을 합성하였다.

구체적으로, pDZ-lysC(L377K) 플라스미드는 lysC 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들이 (각 515, 538bp) pDZ 벡터 에 연결된 형태로 제작되었다. ATCC13032 균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 47 및 49를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 1분 변성, 56℃ 1분 어닐링, 72℃ 40초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 동일한 방법으로 lysC 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편은 서열번호 48 및 50 를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다.

한편 제한효소 SmaI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질 전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 47 및 48을 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-lysC(L377K)로 명명하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머의 핵산 서열은 하기 표 7에 기재하였다.

명칭	서열	서열번호
LysC_L377K	MALVVQKYGGSSLESAERIRNVAERIVATKKAGNDVVVVCSAMGDTTDELLELAAAVNPVPPAREMDMLLTAGERISNALVAMAIESLGAEAQSFTGSQAGVLTTERHGNARIVDVTPGRVREALDEGKICIVAGFQGVNKETRDVTTLGRGGSDTTAVALAAALNADVCEIYSDVDGVYTADPRIVPNAQKLEKLSFEEMLELAAVGSKILVLRSVEYARAFNVPLRVRSSYSNDPGTLIAGSMEDIPVEEAVLTGVATDKSEAKVTVLGISDKPGEAAKVFRALADAEINIDMVLQNVSSVEDGTTDITFTCPRSDGRRAMEILKKLQVQGNWTNVLYDDQVGKVSLVGAGMKSHPGVTAEFMEALRDVNVNIEKISTSEIRISVLIREDDLDAAARALHEQFQLGGEDEAVVYAGTGR	서열번호 46
LysC L1	TCGAGCTCGGTACCCGCTGCGCAGTGTTGAATAC	서열번호 47
LysC R2	CTCTAGAGGATCCCCGTTCACCTCAGAGACGATT	서열번호 48
lysC(L377K) L2	TGGAAATCTTTTCGATGTTCACGTTGACAT	서열번호 49
lysC(L377K) R1	ATGTCAACGTGAACATCGAAAAGATTTCC	서열번호 50

상기에서 제작된 pDZ-lysC(L377K)를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 전기펄스법으로 형질 전환하였다. 이와 같이 lysC 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 CJP1으로 명명하였다. 상기 CJP1은 CA01-2307로 명명되어, 2017년 3월 29일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12000P를 부여받았다.

상기 제작된 KCCM12000P 균주에 L-트레오닌, L-이소류신 생합성 경로의 공통적 중간체인 호모세린(homoserine)을 생산하는 호모세린 디하이드로게나제(homoserin dehydrogenase; Hom)를 암호화하는 유전자에 변이를 도입하였다. 구체적으로, 야생형 호모세린 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 1218~1221번째 염기서열을 기존 TTG에서 AAG로 치환하여, 야생형 호모세린 디하이드로게나제의 N 말단에서부터 407번째 아미노산인 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 형태의 변이체 Hom(R407H) 변이가 도입된 균주를 제작하였다. Hom(R407H)의 아미노산 서열은 서열번호 51로서 하기 표 8에 기재하였다. 변이도입을 위한 재조합벡터는 아래와 같은 방법으로 제작되었다.

먼저, ATCC13032 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 hom 유전자의 1219~1221번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 600bp 떨어진 위치에 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 SalI 인식 부위를 삽입한 프라이머 서열번호 52 및 53을 합성하였다. Hom(R407H) 이종성 염기 치환변이를 도입하기 위하여 hom 유전자의 1219~1221번째 염기서열을 치환하기 위한 프라이머 서열번호 54 및 55를 합성하였다.

구체적으로, pDZ-hom(R407H) 플라스미드는 hom 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들이 (각 600bp) pDZ 벡터에 연결된 형태로 제작되었다. WT균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 52 및 54를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 1분 변성, 56℃ 1분 어닐링, 72℃ 40초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 동일한 방법으로 hom 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편은 서열번호 53 및 55를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다.

한편 제한효소 SalI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질 전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 52 및 53을 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-hom(R407H)로 명명하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머의 핵산 서열은 하기 표 8에 기재하였다.

명칭	서열	서열번호
Hom_R407H	MTSASAPSFNPGKGPGSAVGIALLGFGTVGTEVMRLMTEYGDELAHRIGGPLEVRGIAVSDISKPREGVAPELLTEDAFALIEREDVDIVVEVIGGIEYPREVVLAALKAGKSVVTANKALVAAHSAELADAAEAANVDLYFEAAVAGAIPVVGPLRRSLAGDQIQSVMGIVNGTTNFILDAMDSTGADYADSLAEATRLGYAEADPTADVEGHDAASKAAILASIAFHTRVTADDVYCEGISNISAADIEAAQQAGHTIKLLAICEKFTNKEGKSAISARVHPTLLPVSHPLASVNKSFNAIFVEAEAAGRLMFYGNGAGGAPTASAVLGDVVGAARNKVHGGRAPGESTYANLPIADFGETTTRYHLDMDVEDRVGVLAELASLFSEQGISLRTIRQEERDDDAHLIVVTHSALESDLSRTVELLKAKPVVKAINSVIRLERD	서열번호 51
hom L1	ATCCTCTAGAGTCGACCCAACTGCAGACGTCGAA	서열번호 52
hom R2	ATGCCTGCAGGTCGACATAGACAGATTTGTCCACG	서열번호 53
hom(R407H) L2	GTGACCACGATCAGATGTGCATCATCATCGCGCTC	서열번호 54
hom(R407H) R1	GCGATGATGATGCACATCTGATCGTGGTCACCCAC	서열번호 55

상기에서 제작된 pDZ-hom(R407H)를 KCCM12000P에 전기 펄스법으로 형질 전환하였다. 이와 같이 hom 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 KCCM12000P-R398Q로 명명하였으며, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여 KCCM12120P로 기탁번호 (대한민국 등록특허 제10-1947959호)를 부여받았다.

실시예 1에서 제작한 pDZ-glxR(E45A), pDZ-glxR(D66A), pDZ-glxR(T166D), pDZ-glxR(E168A) 벡터를 각각 상기 KCCM12120P 균주에 전기펄스법으로 형질 전환하였다. 이와 같이 glxR 유전자에 염기 치환변이가 도입된 균주를 제작하였고, KCCM12120P △glxR::glxR* (E45A)은 CA09-2373으로, KCCM12120P △glxR::glxR* (D66A)은 CA09-2374로, KCCM12120P △glxR::glxR* (T166D)는 CA09-2325, KCCM12120P △glxR::glxR* (E168A)는 CA09-2324으로 각각 명명하였다.

L-쓰레오닌 생산 균주인 KCCM12120P균주를 대조군으로 사용하여 glxR 변이주 총4종을 아래의 방법으로 배양하여 L-쓰레오닌 생산 수율, 당 소모속도, 및 L-라이신과 같은 부산물 생산 농도를 측정하였다.

종배지 25㎖를 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 위에서 획득한 균주들을 각각 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24㎖를 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 1㎖의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기 표 9에 기재하였다. 배양 종료 후 HPLC 와 Biochemistry analyzer(YSI 2900)를 이용하여 L-라이신, L-쓰레오닌의 농도 및 당 소모 속도를 측정하고, 그 결과를 표 10에 나타내었다.

배지 종류	성분
종배지 (pH 7.0)	포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
L-쓰레오닌 생산배지 (pH 7.0)	포도당 100g, KH2PO4 2g, Urea 3g, (NH4)2SO4 25g, Peptone 2.5g, CSL(Sigma) 5g(10 ml), MgSO4·7H2O 0.5g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 3000 ㎍, CaCO3 30g (증류수 1 리터 기준)

균주	L-Thr 농도 (g/L)	당 소모속도 (g/hr)	L-LYS 농도 (g/L)
KCCM12120P	7.62	4.04	0.36
CA09-2373	9.23	4.66	0.28
CA09-2374	9.67	4.21	0.31
CA09-2325	8.87	4.13	0.35
CA09-2324	8.90	4.22	-

표 10에 나타난 바와 같이, L-쓰레오닌 생산 균주인 KCCM12120P균주를 대조군으로 glxR 변이주 4종 (CA09-2373, CA09-2374, CA09-2325, CA09-2324)을 배양하여 L-쓰레오닌과 부산물 (L-라이신) 생산 농도를 측정한 결과, 대조군 대비 glxR 유전자에 치환변이가 도입된 균주 4종은 모두 L-라이신을 포함한 타 부산물의 생산량을 감소시키거나 큰 변화가 없었지만, L-쓰레오닌의 생산량이 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, CA09-2373, CA09-2374, CA09-2325, 및 CA09-2324 균주 모두 대조군 보다 당 소모 속도가 개선되어, 같은 양의 L-쓰레오닌을 생산하는데 걸리는 시간이 단축되고 L-쓰레오닌 생산능이 개선된 것을 확인할 수 있었다.

상기 CA09-2373, CA09-2374, CA09-2325 및 CA09-2324 균주는 2020년 12월 17일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM)에 국제 기탁하여 각각 기탁번호 KCCM12901P, KCCM12902P, KCCM12900P, 및 KCCM12899P를 부여 받았다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM12899P 20201217 한국미생물보존센터(국외) KCCM12900P 20201217 한국미생물보존센터(국외) KCCM12901P 20201217 한국미생물보존센터(국외) KCCM12902P 20201217

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> GlxR protein variant or threonine production method using the same <130> DPP20203458KR <160> 55 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GlxR_amino acid <400> 1 Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly 1 5 10 15 Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val 20 25 30 Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp 35 40 45 Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala 50 55 60 Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met 65 70 75 80 Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala 85 90 95 Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu 100 105 110 Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg 115 120 125 Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu 130 135 140 Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu 145 150 155 160 Ala 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gcgctgcgcg tgaaccacga cctcactcag 540 gaagaaatcg cacagctcgt cggtgcttcc cgtgaaactg tgaataaggc tcttgcaacg 600 ttcgcacacc gtggctggat tcgcctcgag ggcaagtccg tcctcattgt ggacaccgag 660 catttggcac gtcgcgctcg ataa 684 <210> 3 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GlxR_E45A <400> 3 Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly 1 5 10 15 Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val 20 25 30 Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Ala Pro Gly Asp 35 40 45 Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala 50 55 60 Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met 65 70 75 80 Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala 85 90 95 Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu 100 105 110 Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg 115 120 125 Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu 130 135 140 Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val 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34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(D66A) R1 <400> 29 gcgccacgca ccggcaggcc gcgaaaacct gctg 34 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(D66F) L2 <400> 30 cagcaggttt tcgcggccaa acggtgcgtg gcgc 34 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(D66F) R1 <400> 31 gcgccacgca ccgtttggcc gcgaaaacct gctg 34 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(D66K) L2 <400> 32 ggttttcgcg gcctttccgg tgcgtggcgc gcaag 35 <210> 33 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(D66K) R1 <400> 33 gcgccacgca ccgaaaggcc gcgaaaacct gctg 34 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(T166D) L2 <400> 34 gccagcttct tggtcgccga agcggttagc cagc 34 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(T166D) R1 <400> 35 aaccgcttcg gcgaccaaga agctggcgcg ctg 33 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(T166F) L2 <400> 36 gccagcttct tggaagccga agcggttagc cagc 34 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(T166F) R1 <400> 37 aaccgcttcg gcttccaaga agctggcgcg ctg 33 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(T166K) L2 <400> 38 gccagcttct tgtttgccga agcggttagc cagc 34 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(T166K) R1 <400> 39 aaccgcttcg gcaaacaaga agctggcgcg ctg 33 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(E168A) L2 <400> 40 agcgcgccag cagcttgggc gccgaagcgg ttag 34 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(E168A) R1 <400> 41 cttcggcgcc caagctgctg gcgcgctgcg cgtg 34 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(E168F) L2 <400> 42 agcgcgccag caaattgggc gccgaagcgg ttag 34 <210> 43 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(E168F) R1 <400> 43 cttcggcgcc caatttgctg gcgcgctgcg cgtg 34 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(E168K) L2 <400> 44 agcgcgccag ccttttgggc gccgaagcgg ttag 34 <210> 45 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glxR(E168K) R1 <400> 45 cttcggcgcc caaaaggctg gcgcgctgcg cgtg 34 <210> 46 <211> 421 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LysC_L377K <400> 46 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Lys Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysC L1 <400> 47 tcgagctcgg tacccgctgc gcagtgttga atac 34 <210> 48 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysC R2 <400> 48 ctctagagga tccccgttca cctcagagac gatt 34 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysC(L377K) L2 <400> 49 tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysC(L377K) R1 <400> 50 atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcca 30 <210> 51 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hom_R407H <400> 51 Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu 20 25 30 Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile 35 40 45 Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala 65 70 75 80 Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly 85 90 95 Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys 100 105 110 Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu 115 120 125 Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala 130 135 140 Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160 Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr 165 170 175 Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp 180 185 190 Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr 195 200 205 Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240 Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala 245 250 255 Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys 260 265 270 Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro 275 280 285 Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe 290 295 300 Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320 Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala 325 330 335 Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr 340 345 350 Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365 Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu 385 390 395 400 Glu Arg Asp Asp Asp Ala His Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu 405 410 415 Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val 420 425 430 Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp 435 440 445 <210> 52 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hom L1 <400> 52 atcctctaga gtcgacccaa ctgcagacgt cgaa 34 <210> 53 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hom R2 <400> 53 atgcctgcag gtcgacatag acagatttgt ccacg 35 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hom(R407H) L2 <400> 54 gtgaccacga tcagatgtgc atcatcatcg cgctc 35 <210> 55 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hom(R407H) R1 <400> 55 gcgatgatga tgcacatctg atcgtggtca cccac 35

Claims (9)

1. 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 군에서 선택된 변이를 포함하는, GlxR(glyoxylate bypass regulator) 단백질 변이체:
   (1) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 45번째 아미노산 위치에 상응하는 잔기가 알라닌(alanine), 세린(serine), 페닐알라닌(phenylalanine), 또는 라이신(lysine)으로 치환;
   (2) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 66번째 아미노산 위치에 상응하는 잔기가 알라닌(alanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 또는 라이신(lysine)으로 치환;
   (3) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 166번째 아미노산 위치에 상응하는 잔기가 아스파르트산(aspartic acid), 페닐알라닌(phenylalanine), 또는 라이신(lysine)으로 치환; 및
   (4) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 168번째 아미노산 위치에 상응하는 잔기가 알라닌(alanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 또는 라이신(lysine)으로 치환.
2. 제1항의 GlxR 단백질 변이체를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
3. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
4. 제1항의 GlxR 단백질 변이체, 상기 GlxR 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 미생물.
5. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 것인, 미생물.
6. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 인, 미생물.
7. 제6항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌의 생산 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, L-쓰레오닌의 생산 방법.