KR20050026388A - 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 리신 합성을 위한리프레서 ｇｌｘＲ의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 cAMP에 결합하고 코리네박테리움 글루타미쿰의 aceB 유전자의 발현을 억제하는 능력을 가지며, 20％ 이하의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 서열 1로부터 수득될 수 있는, 서열 1의 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드 서열 또는 그의 뮤테인에 관한 것이다.

Description

코리네박테리움 글루타미쿰에서의 리신 합성을 위한 리프레서 ｇｌｘＲ의 용도 {Use of the Repressor glxR for the Synthesis of Lysine in Corynebacterium Glutamicum}

도 1. 글리옥실레이트 바이패스 및 관련된 코리네박테리움 글루타미쿰의 경로. 글리옥실레이트 바이패스는 이소시트레이트 분해효소 및 말레이트 합성효소에 의해 수행된다. 약어: ACK, 아세테이트 키나제; ICDH, 이소시트레이트 탈수소효소; ICL, 이소시트레이트 분해효소; MS, 말레이트 합성효소; OAA, 옥살로아세테이트; PTA, 포스포트랜스아세틸라제. 점선 화살표는 다중 단계를 지시한다.

도 2. 클론 및 서브클론의 개략도. 플라스미드 pSL329를 코리네박테리움 게놈 라이브러리로부터 단리하였다. 클로닝 벡터 pMT1은 도시되지 않는다. 각각의 클론을 운반하는 이. 콜라이 DH5αF'-145 세포의 콜로니 색상 (청색 또는 백색)을 X-gal, 테트라시클린 및 암피실린을 함유하는 LB 배지 상에서 시험하였다. 약어: B, BamHI; E, EcoRI; K, KpnI; Sa, SalI; Sc, ScaI; Sp, SphI; X, XhoI; Xb, XbaI.

도 3. GlxR 단백질의 개략도 (패널 A).

도 4. 다른 상동성 서열을 갖는 씨. 글루타미쿰의 GlxR 단백질의 다중 서열 정렬. 보존되고 기능적으로 유사한 아미노산은 각각 검은색 및 음영 박스로 표시된다. 시클릭 뉴클레오티드-모노포스페이트 결합 모티프 및 헬릭스-턴-헬릭스 DNA 결합 모티프는 연속선으로 표시된다. 약어: CG, 씨. 글루타미쿰의 GlxR (AF220150); MT, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 H37RV의 추정 전사 조절자 Rv3676 (E70790); SC, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르의 추정 전사 조절자 (T36556); VC, 비브리오 콜레라에의 CRP (NP232242); EC, 이. 콜라이의 CRP (J01598).

도 5. 이. 콜라이에서의 GlxR의 발현. (A) GlxR 단백질은 재료 및 방법란에 기재된 바와 같이 pKK-glxR 벡터로부터 발현되었다. 레인: 1, 이. 콜라이 JM105/pKK223-3; 2, 이. 콜라이 JM105/pKK-glxR (유도되지 않음); 3, 이. 콜라이 JM105/pKK-glxR (유도됨). (B) GlxR의 정제. 단백질은 pMAL-glxR로부터 발현되었다. 레인: 4, 총 단백질; 5, 가용성 분획; 6, 정제된 MBP-GlxR 융합 단백질; 7, 인자 X 처리 후; 8, 정제된 GlxR 단백질. M은 분자량 표준물을 지시한다.

도 6. 씨. 글루타미쿰에서의 glxR 발현, 및 성장에 대한 cAMP의 효과. 글루코스 (패널 A) 또는 아세테이트 (패널 B)는 단독 탄소 공급원으로서 사용되었다. 필요할 경우, cAMP를 최종 농도 8 mM로 첨가하였다. 기호: ●, pMT1 {공 (empty) 벡터}; ○, pMT1 및 cAMP; ■, pSL329-5 (glxR); □, pSL329-5 (glxR) 및 cAMP.

도 7. 정제된 GlxR을 이용한 겔 이동 분석. 정제된 GlxR 단백질을 프로브와 함게 인큐베이션하고, 혼합물을 6％ PAGE에 의해 분석하였다. 패널: A, aceB 프로모터 영역의 개략도; B, cAMP의 부재 하에서의 겔 이동; C, cAMP의 존재 하에서의 겔 이동. 시클릭 AMP를 분석 혼합물, 겔 및 PAGE 완충액에 첨가하였다 (0.2 mM까지). 레인: 1, 단백질 없음; 2, 0.03 ㎍; 3, 0.06 ㎍; 4, 0.13 ㎍; 5, 0.25 ㎍; 6, 0.5 ㎍; 7, 1.0 ㎍; 8, 2.0 ㎍의 정제된 GlxR 단백질. 화살표는 이동된 밴드를 지시한다.

본 발명은 적어도 코리네박테리움 글루타미쿰의 aceB 유전자의 유전자 발현을 억제하는 능력을 갖는 신규한 폴리펩티드 분자를 제공한다. 서열 1로 표시된 폴리펩티드 서열을 갖는 glxR 분자의 단리는 실험 부분란에 기재되어 있다.

cAMP에 결합하고 씨. 글루타미쿰의 말레이트 합성을 코딩하는 aceB 유전자의 전사를 억제하는 능력을 갖는 glxR 뮤테인의 제조는 실험 부분란에 기재되어 있다.

glxR 분자 및 glxR 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 유전 암호 및 화학적 합성에 따라 상응하는 폴리펩티드 서열의 역전사에 의해 제조될 수 있다. 서열 1에 따른 glxR 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 단리는 실험 부분란에 기재되어 있다.

본 발명의 또다른 측면은 적어도 씨. 글루타미쿰의 aceB 유전자의 발현을 조절하기 위한 glxR 분자 및 각각의 폴리뉴클레오티드 서열의 용도이다. 일 실시양태에서, glxR 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 기능적 aceB 유전자를 갖는 코리네박테리움 속의 숙주 유기체에 재조합적으로 도입된다. 적어도 상기 aceB 유전자의 발현은 코리네박테리움의 자연 발생 게놈 구성에 비해 전사적 수준으로 조절된다. 자연 발생량보다 현저히 높은 양으로 glxR 분자를 발현시킴으로써, aceB의 보다 효과적인 유전자 억제가 수행된다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, glxR 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 분자는 숙주 유기체에 도입된다. 상기 안티센스 분자는 glxR 유전자의 발현을 감소시키며, 숙주에서 자연 발생량보다 적은 양의 glxR 분자를 초래한다. 이는 aceB 유전자의 보다 높은 전사율을 초래한다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, glxR 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 유기체에서 부분적으로 또는 완전히 결실된다. 이는 aceB 유전자의 보다 높은 전사율을 초래한다.

aceB 유전자 발현의 조절에 의해, 글리옥실레이트 바이패스는 직접 영향을 받는다. 조절은 두 방향 모두, 즉 상향 조절 및 하향 조절일 수 있다. 글리옥실레이트 바이패스에 영향을 미침으로써, 아미노산 및 그의 중간체의 대사적 흐름은 코리네박테리움에서 효과적으로 영향을 받을 수 있다.

코리네박테리움이 아미노산, 바람직하게는 리신, 글루타메이트 및 메티오닌을 생산하기 위한 유기체로서 사용되기 때문에, glxR 분자를 통한 글리옥실레이트 바이패스에 대한 영향은 코리네박테리움에서 아미노산의 생산을 이동시키는데 사용될 수 있다. 일부의 경우에는 바람직한 아미노산의 생산을 보다 높은 양으로 이동시키는 것이 유리한 반면, 다른 경우에는 예를 들어 원하지 않는 중간체의 합성을 차단하기 위해 반대 방향의 이동이 바람직하다.

glxR 분자에 의한 글리옥실레이트 바이패스의 영향은 코리네박테리움의 대사 능력을 설계하는데 효과적인 방법이다.

실험 부분

glxR 의 단리. 단백질 생성물이 씨. 글루타미쿰 aceB 유전자의 발현에 대한 조절 효과를 발휘하는 유전자를 단리하기 위해, 본 발명자들은 코리네박테리움의 aceB의 하류에 융합된 장의 lac 오페론을 운반하는 pSL145 (문헌 [Kim et al, 2001])을 리포터 플라스미드로서 사용하였다. 상기 플라스미드를 이용하여, 프로모터 영역에서 aceB 발현의 조절은 β-갈락토시다제 활성도의 변화로서 반영되었다. pSL145를 운반하는 이. 콜라이 DH5αF' 세포 (이. 콜라이 DH5αF'-145)는 X-gal을 함유하는 LB 플레이트 상에 청색 콜로니를 형성하였고, 코리네박테리움 라이브러리의 스크리닝용 숙주로서 사용되었다. 단백질 생성물이 aceB의 프로모터 영역에 대한 조절 효과를 갖고, 따라서 lacZ의 발현에 영향을 미치는 클론을 운반하는 숙주 세포는 플레이트 상에 백색 콜로니를 형성할 것으로 예상되었다. 스크리닝된 총 20,000 콜로니 중에서, 4개의 백색 콜로니를 확인하였다. 클로닝된 DNA는 중복 인서트를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 클론 중에서, 7.8 kp 인서트를 운반하는 플라스미드 pSL329 (도 2)를 선택하고, 더 분석하였다. X-gal을 함유하는 LB 배지 상에서 서브클론을 운반하는 세포를 패칭함으로써 β-갈락토시다제 활성도를 조절하는 DNA 영역을 확인하였다 (도 2). 색상 시험 데이타에 따라, 플라스미드 pSL329를 운반하는 이. 콜라이 DH5αF'-145 세포는 27 mU의 β-갈락토시다제 활성도를 나타낸 모 균주에 비해 90％ 감소된 2.5 mU의 β-갈락토시다제 활성도를 나타내었다 (표 3). 상기 데이타는 클로닝된 DNA에 운반된 유전자 (glxR, 하기 참조)가 aceB 유전자의 프로모터 영역에 결합하여 lacZ의 발현을 방해할 수 있는 단백질을 발현함을 암시한다.

glxR 유전자의 서열 분석. 클론의 완전 뉴클레오티드 서열을 pSL329-5를 서열 주형으로서 사용하여 결정하였다. 684 bp로 이루어진 ORF는 클론의 중앙 영역에서 발견되었다. 다른 단백질과의 유사도를 기준으로 (하기 참조), GTG를 출발 코돈으로서 선택하였다 (도 3). AGGA의 잠재적 리보솜 결합 부위는 GTG로부터 9 bp 상류에 위치하였다 (도 3). ORF의 GC 함량은 59％였고, 이는 씨. 글루타미쿰 유전자에 전형적이다. 코돈 선호도는 또한 이미 보고된 코리네박테리움 유전자와 유사하였고, 흥미롭게도 또한 ORF는 낮은 수준으로 발현되는 단백질을 코딩할 수 있는 것으로 나타났다 (문헌 [Malumbres et al, 1993]).

추정 유전자 생성물은 7.0의 예상 등전점을 갖는 24,957 Da 단백질을 코딩하는 228개의 아미노산 (서열 1)으로 이루어졌다. ORF의 해독된 아미노산 서열을 단백질 데이타베이스 중의 서열과 비교하였다. 공지된 단백질 중에서, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) (E70790)의 전사 조절 단백질 및 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor) (T36556)의 추정 전사 조절 단백질은 각각 78％ 및 53％의 아미노산 동일성으로 가장 높은 점수를 가졌다. 역할이 공지된 단백질 중에서, 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae) (NP232242)의 시클릭 AMP 수용체 단백질 (CRP), 살로넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) (A26049), 및 이. 콜라이 (J01598)은 약 27％ 동일성으로 가장 높은 점수를 가졌다. 아미노산 서열의 정밀 분석은 효소의 촉매 활성도에 관련될 수 있는 2개의 보존된 모티프를 밝혀내었다 (도 3). 13 내지 102의 아미노산은 cAMP 결합 도메인에 대해 예상된 보존된 잔기의 패턴을 나타내었고, cAMP 결합 도메인에 대한 보존 서열과 31％ 동일성을 나타내었다 (도 4). 그리고, CRP/FNR 군의 헬릭스-턴-헬릭스 (helix-turn-helix) DNA 결합 모티프는 코딩된 단백질의 카르복시 말단 영역 (아미노산 170 내지 218로부터)에서 확인되었다. 이는 CRP의 헬릭스-턴-헬릭스 모티프와 41％ 동일성을 나타내었다 (도 4). 클로닝된 유전자의 특성을 기준으로 (하기 참조), 본 발명자들은 코리네박테리움 유전자를 glxR {글리옥실레이트 바이패스 조절자 ( gl yo x ylate bypass r egulator)}로 명명하였다.

코딩된 단백질의 분석. RBS를 포함하는 glxR 코딩 영역을 pKK223-3 벡터 내로 클로닝하고, 생성된 벡터를 이. 콜라이 내로 도입하여 SDS-PAGE 상의 M _r 25,000 단백질을 발현시켰다. 측정된 분자량은 단백질의 예상된 Mw와 일치하였다. GlxR 단백질을 MBP 융합 기술을 이용하여 정제하였다. 예상된 바와 같이, 정제된 단백질은 SDS-PAGE 상에서 25,000의 M _r를 나타내었다 (도 5B). 정제된 단백질의 원 Mw는 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에 의해 측정된 것으로서 44,000 Da이었다 (데이타는 나타내지 않음). 이는 단백질이 대부분의 다른 DNA 결합 단백질과 같이 이합체를 형성하는 것을 암시한다.

cAMP의 관련. glxR의 역할을 연구하는 첫번째 단계로서, glxR 클론인 플라스미드 pSL329-5를 씨. 글루타미쿰 AS019E12 내로 도입하고, 효과를 모니터링하였다. 도 6AB에 나타난 바와 같이, 다중카피에서의 glxR 클론의 존재는 탄소 공급원으로서 글루코스 또는 아세테이트 상에서 성장된 숙주 세포의 성장에 상당히 영향을 미쳤다. 표 2에 나타난 바와 같이, 아세테이트 최소 배지에서 관찰된 성장 손상은 명백히 말레이트 합성효소 및 이소시트레이트 분해효소와 같은 글리옥실레이트 바이패스 효소의 감소 때문이다. 이소시트레이트 탈수소효소, TCA 회로 효소의 효소 활성도는 영향을 받지 않았다. 활성도의 감소는 SDS-PAGE에 의해 판단된 바와 같이, 발현된 효소의 양의 감소 때문이다 (데이타는 나타내지 않음). 그러나, 성장 실험이 cAMP의 존재 하에서 수행되었을 경우, 흥미로운 결과가 관찰되었다. 글루코스 최소 배지에서의 성장 (도 6A)과 달리, 아세테이트 최소 배지에서 glxR 클론을 운반하는 세포의 성장은 cAMP에 의해 심하게 영향을 받았다 (도 6B). 탄소 공급원으로서 글루코스 또는 아세테이트를 갖는 두 가지 성장 조건 모두 하에서, 발현된 GlxR의 양은 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증된 바와 같이 영향을 받지 않았다 (데이타는 나타내지 않음). 데이타와 일치하게, 표 3에 나타난 바와 같이 코리네박테리움 aceB 프로모터에서의 glxR 클론의 조절 활성은 이. 콜라이의 cya 돌연변이체 균주에서는 관찰되지 않았다. 그리고, 정제된 GlxR 단백질은 cAMP의 존재 하에서의 트립신에 의한 소화에 보다 내성이 있었다 (데이타는 나타내지 않음). 상기 데이타는 cAMP가 다양한 탄소 공급원의 이용에 관련된 유전자의 발현을 조절하는 신호화 분자일 수 있음을 암시한다.

GlxR의 DNA 결합 활성. GlxR이 aceB의 발현을 조절하는데 관련된다는 것을 알고, 본 발명자들은 aceB 유전자의 프로모터 영역에서 정제된 GlxR의 결합을 시험하였다. 상기 목적을 위해, aceB 유전자의 프로모터 영역을 운반하는 DNA 단편을 이용하였다 (도 7A). cAMP의 존재 하에서, 증가하는 양의 정제된 GlxR 단백질을 프로브에 첨가하여 2개의 상이하게 이동된 밴드를 초래하였다 (도 7C). 상부 밴드는 하부 밴드보다 이후의 것으로 보였으며, 이는 상부 밴드가 GlxR 단백질의 올리고머화에 기인할 수 있음을 암시한다. cAMP를 글리옥실레이트 바이패스 효소에 대한 조절자로서 제시된 아세틸-CoA로 대체한 것 (문헌 [Wendisch et al, 1997])은 프로브를 이용한 어떠한 DNA 이동도 초래하지 않았다 (데이타는 나타내지 않음). GlxR 단백질이 겔 이동성 분석에 의해 증명된 바와 같이 올리고머를 형성할 수 있음을 알고, 본 발명자들은 가교제인 EDAC를 이용하여 정제된 GlxR의 올리고머화를 시험하였다. cAMP의 존재와 관계 없이, 이합체 및 사합체의 가교 구조가 관찰되었다.

glxR 단백질의 뮤테인. 원래 glxR 폴리펩티드 서열 (서열 1)로부터 출발하여, 많은 기능적 동등 glxR 뮤테인을 서열 1의 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 제조하였다. 기능적 동등 뮤테인은 상기 뮤테인이 여전히 cAMP에 결합하고 발현, 특히 C. 글루타미쿰의 aceB 유전자의 전사를 서열 1를 갖는 glxR과 동일한 크기의 정도로 억제하는 능력을 갖는 것을 의미한다. glxR 뮤테인의 제조는 바람직하게는 상응하는 코딩 뉴클레오티드 서열의 부위 지정 돌연변이 유발법과 같은 널리 공지된 유전 공학 기술에 의해 수행된다.

glxR 뮤테인은 서열 1의 서열과 아미노산 서열의 20％ 이하, 바람직하게는 15％ 이하, 가장 바람직하게는 10％ 이하, 매우 가장 바람직하게는 5％ 이하로 상이하다.

glxR 뮤테인은 예를 들어 도 4에 정의된 바와 같이, 무손상 cAMP 결합 도메인 및 무손상 헬릭스-턴-헬릭스 DNa 결합 모티프를 갖는다는 것이 중요하다.

재료 및 방법

박테리아 균주, 플라스미드, 및 성장 조건. 본 연구에 사용된 모든 균주 및 플라스미드는 표 1에 열거되어 있다. 이. 콜라이 DH5αF'를 플라스미드의 제작 및 증식을 위해 사용하였다. 이. 콜라이 JM105을 pKK-glxR로부터 GlxR을 발현시키는데 사용하였다. 플라스미드 pRS415 상에 제작된 P _aceB -lacZ의 오페론 융합체를 시몬스 (Simons) 등 (문헌 [Simons et al, 1987])에 의해 기재된 바와 같이 λRS415 람다 파지를 이용하여 이. 콜라이 균주의 염색체에 전달하였다. 다르게 언급하면, 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰 세포를 각각 37℃에서 LB에서 (문헌 [Sambrook et al, 1989]), 그리고 30℃에서 MB에서 (문헌 [Follettie et al, 1993]) 배양하였다. 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰을 위한 최소 배지는 각각 M9 (문헌 [Sambrook et al, 1989]) 및 MCGC (문헌 [von der Osten, 1989])이었다. 탄소 공급원을 하기 양으로 최소 배지에 첨가하였다: 글루코스 1％; 아세테이트 2％. 항생제를 하기 양으로 첨가하였다: 암피실린 50 ㎍/ml; 테트라시클린, 20 ㎍/ml; 카나마이신 20 ㎍/ml. X-gal 및 cAMP를 각각 40 ㎍/ml 및 8 mM로 배지에 첨가하였다. 단백질의 발현을 위해, IPTG를 최종 농도 1 mM 또는 0.3 mM로 첨가하였다.

DNA 기술. 표준 분자 클로닝, 형질전환, 및 전기영동 방법을 이용하였다 (문헌 [Sambrook et al, 1989]). 플라스미드를 전기천공에 의해 씨. 글루타미쿰 세포 내로 도입하였다 (문헌 [Follettie et al, 1993]). 씨. 글루타미쿰 세포를 위한 미니 플라스미드 제조를 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Yoshihama et al, 1985]). 씨. 글루타미쿰 AS019로부터의 염색체 DNA를 기재된 바와 같이 제조하였다 (문헌 [Tomioka et al, 1981]). 제한 효소 및 DNA 변형 효소를 다카라 슈조 캄파니 (Takara Shuzo Co.) (일본 시가 소재) 및 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs) (미국 비버리 소재)로부터 구입하고, 제조자가 권고한 바와 같이 사용하였다.

클로닝 및 시퀀싱. 씨. 글루타미쿰 AS019의 게놈 라이브러리를 이미 기재된 바와 같이 제작하였다 (문헌 [Lee and Sinskey, 1994]). 이는 이. 콜라이-코리네박테리움 셔틀 벡터 pMT1 내로 클로닝된 4 내지 13 kb MboI 단편으로 제조되었다. 이. 콜라이 DH5αF' 세포를 pSL145로 형질전환시키고 (문헌 [Kim et al, 2001]), 얻어진 이. 콜라이 DH5αF'-145 균주를 라이브러리의 스크리닝을 위한 숙주로서 사용하였다. 플라스미드 pSL 145는 aceB 프로모터 영역의 하류에 융합된 lacZYA를 운반한다.

glxR의 뉴클레오티드 서열 분석을 위해, 플라스미드 pSL329-5를 주형으로서 사용하였다. glxR의 완전 뉴클레오티드 서열을 유니버설 및 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 한국 기초 과학 연구 센터 (Korea Research Center for Basic Sciences) (한국 대전 소재)에서 상업적으로 결정하였다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 서열 유사성 연구를 BLAST (문헌 [Altschul et al, 1990]; [Altschul et al, 1997])를 이용하여 국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에서 수행하였다. 쌍별 서열 정렬을 ClustalW 정렬 방법 (문헌 [Thompson et al, 1994])을 이용하여 ExPASy 프로테오믹스 툴스 (ExPASy Proteomics Tools)의 웹사이트 (http://www.expasy.ch/tools/)에서 수행하였다.

플라스미드의 제작. 플라스미드 pSL329-1, pSL329-2, pSL329-3 및 pSL329-5를 pSL329의 5.1 kb EcoRI-XbaI 단편, 5.2 kb XhoI 단편, 2.7 kb SmaI-Eco RI 단편, 및 1.8 kb KpnI 단편을 각각 SmaI-XbaI, XhoI, 및 KpnI로 다이제스팅된 pMT1 벡터 내로 리게이션함으로써 제작하였다. 플라스미드 pSL329-4를 pSL329-3의 0.2 kb SalI 단편을 결실시킴으로써 제작하였다. 플라스미드 pSL08-glxR를 pSL329-5의 1.8 kb KpnI-BamHI 단편을 XbaI로 다이제스팅되고 클레노우 (Klenow) 효소로 평활 말단화 pSL08 내로 삽입함으로써 제작하였다. 클로닝된 glxR 유전자의 전사 방향은 aceB 유전자와 반대였다. 플라스미드 pKK-glxR를 C1 및 C2 프라이머를 갖는 828 bp pSL329-5의 단편을 증폭하고, 얻어진 단편을 pKK223-3의 EcoRI 부위 내로 삽입함으로써 제작하였다. 828 bp 단편은 glxR 유전자 및 그의 리보솜 결합 부위를 운반하였다. 플라스미드 pMAL-glxR을 하기와 같이 제작하였다. glxR 코딩 영역을 플라스미드 pSL329-5를 주형으로서 사용하여 D1 및 D2의 프라이머로 증폭하였다. 0.89 kb PCR 생성물을 EcoRI 및 SalI로 처리하고, EcoRI-SalI 분해 및 탈인산화된 pMAL-c2 내로 리게이션하였다.

GlxR의 정제. 플라스미드 pMAL-glxR를 GlxR을 발현시키기 위해 사용하였다. 벡터는 malE로 융합된 glxR을 운반하고, MBP-GlxR 융합 단백질을 발현시킨다. 인자 Xa를 이용한 융합 단백질의 절단은 단백질의 N-말단에 부착된 일련의 아미노산 (Ile-Ser-Val-Phe)을 갖는 유리 GlxR 단백질을 방출한다. 융합 단백질은 벡터 pMAL-c2의 제조자 (미국 비버리 소재, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 의해 제시된 바와 같이 발현되고 정제되었다. GlxR를 25 내지 500 mM의 선형 NaCl 구배를 이용한 Q-세파로스 패스트 플로우 (Q-Sepharose Fast Flow) 컬럼 크로마토그래피 {아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech), 2.8 cm ×11 cm}에 의해 MBP로부터 분리하였다. GlxR을 함유한 분획을 풀링하고, 단백질을 PEG 8,000에 대한 투석에 의해 농축하였다.

겔 이동도 이동 분석. 프로브 DNA를 하기와 같이 제조하였다. aceB 유전자의 상류 영역 (ATG 출발 코돈으로부터 120 내지 320 bp 상류)을 포함하는 200 bp DNA 단편을 E1 및 E2 프라이머를 이용하여 증폭하고, 이어서 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 이용하여 [γ-³²P]dATP로 표지하였다. 10 ㎕의 결합 반응 혼합물은 표지된 DNA 단편, 다양한 양의 정제된 GlxR, 10 mM 인산염 완충액, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 소 혈청 알부민 3 ㎍, 및 폴리[dI-dC]·폴리[dI-dC] 1 ㎍을 함유하였다. GlxR의 프로브 DNA로의 결합을 실온에서 15분 동안 수행하고, 혼합물을 기재된 바와 같이 6％ 천연 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다 (문헌 [Sambrook et al, 1989]). 필요할 경우, 0.2 mM cAMP를 결합 완충액, 겔 및 전개 완충액에 포함시켰다.

항체의 생화학적 분석 및 제조. 코리네박테리움 세포를 기재된 바와 같이 제조하였다 (문헌 [Follettie et al, 1993]). β-갈락토시다제, 말레이트 합성효소, 이소시트레이트 분해효소, 이소시트레이트 탈수소효소, 및 아세테이트 키나제의 효소 활성도를 이미 기재된 바와 같이 측정하였다 (문헌 [Miller, 1972]; [Gubler et al, 1993]; [Dixon and Kornberg, 1959]; [Garnak and Reeves, 1979]; [van Dyk and LaRossa, 1987]). 단백질을 소 혈청 알부민을 표준물로서 이용하여 브래드포드 (Bradford)의 방법에 의해 측정하였다 (문헌 [Bradford, 1976]). SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 문헌 [Laemmli, 1970]에 이미 기재된 바와 같이 수행하였다. 안티-GlxR 항혈청은 마우스를 숙주로서 이용하여 코마 바이오텍 (Koma Biotech) (한국 서울 소재)에서 상업적으로 제조되었다.

진뱅크 (GenBank) 수탁 번호. glxR의 뉴클레오티드 서열을 수탁 번호 AF293334 하에 진뱅크에 기탁하였다.

논의

본 연구에서, 본 발명자들은 탄소 공급원으로서 아세테이트의 이용에 관련된 aceB 유전자의 조절에 GlxR이 관련됨을 제시하였다. 증거는 1) 수용체 운반 이. 콜라이에서의 β-갈락토시다제 활성의 조절, 2) 코딩된 단백질 서열에서의 추정 DNA 결합 도메인의 존재, 3) 도입된 glxR 클론의 존재 하에서 글리옥실레이트 바이패스 효소의 발현의 감소, 및 4) aceB 프로모터 영역 상에 정제된 GlxR의 DNA 결합이었다. 그리고, 다른 DNA 결합 단백질과 같이, 단백질이 상대적으로 염기성인 pI를 갖는 이합체로서 존재한다는 발견은 또한 단백질에 대한 조절 역할을 지지한다. 본 발명자들의 데이타는 glxR 유전자가 aceA 및 aceB와 같은 글리옥실레이트 바이패스 유전자의 조절에 주로 관련될 수 있음을 암시하지만, 본 발명자들은 상기 유전자가 또한 다른 유전자의 발현에 관련될 수 있는 가능성을 배제할 수는 없다. 글루코스 최소 배지에서 glxR에 의한 성장 지연은 GlxR 단백질과 다른 프로모터의 상호작용을 암시할 수 있지만, 이는 CRP로 관찰된 바와 같이 DNA의 서열-비의존성 친화성 때문일 수 있다. 수많은 시도에도 불구하고, 클로닝된 DNA를 이용한 glxR 돌연변이체 균주의 제작의 실패는 다른 유전자의 발현에 대한 glxR 유전자의 관련을 암시하는 유전자의 필수성을 암시할 수 있다 (데이타는 나타내지 않음). 이 점에 관해서, 이. 콜라이의 CRP와 같이, GlxR 단백질은 유전자를 필수적이게 하는 다른 유전자에 대한 활성자로서 기능할 수 있다.

glxR 유전자의 코딩된 단백질 서열이 장 박테리아의 CRP와 상동성을 나타낸다는 것을 발견한 것은 흥미롭다. CRP는 이. 콜라이과 같은 장 박테리아에서 cAMP에 의해 지배받는 탄소 동화 억제에서 역할을 한다. GlxR와 CRP 간의 주요한 유사성의 예로는 1) 아미노산 서열 유사성, 2) cAMP 결합 모티프의 존재, 3) DNA 결합 활성의 조절에 대한 cAMP의 관련, 및 4) cAMP의 존재 하에서 프로테아제에 대한 단백질의 판별적인 민감성을 들 수 있다. 그러나, 상기 유사성에도 불구하고, GlxR의 역할은 CRP와 구별되는 것으로 보인다. 예를 들어, glxR 유전자는 이. 콜라이의 crp 돌연변이체를 보완할 수 없다 (데이타는 나타내지 않음).

시클릭 AMP는 많은 유전자의 발현을 조절하는 중요한 신호화 분자이다. cAMP의 관련은 장 박테리아, 바실러스 종, 및 스트렙토마이세스 종과 같은 많은 박테리아에서 보고되었다 (문헌 [Botsford and Harman, 1992]). 이. 콜라이에서, 상기 분자는 락토스 및 아라비노스 오페론과 같은 탄소 동화 유전자에 중요한 역할을 한다 (문헌 [Epstein et al, 1975]). 탄소 결핍 조건 하에서, cAMP의 세포내 농도는 상승한다. 이는 일반적 현상이지만, 또한 예외도 있다. 예를 들어, 브레비박테리움 (Brevibacterium) 종은 글루코스 최소 배지 상에서 성장될 경우 명백히 cAMP의 농도를 낮게 유지한다 (문헌 [Peter et al, 1991]). 이는 본 발명자들이 씨. 글루타미쿰에 대해 발견한 것과 유사하다. 성장 실험에서 증명된 바와 같이 (도 6), cAMP의 세포내 농도는 아세테이트 상에서 성장될 경우 낮게 유지될 수 있다. cAMP의 존재 하에서 glxR 클론을 운반하는 세포의 성장 감소는 상기 가설을 지지할 수 있다. 이는 cAMP로 명백한 효과를 나타내지 않은 글루코스 최소 배지에서 얻은 결과에 의해 더 지지된다. 이는 이. 콜라이, 스트렙토마이세스 종에서 확립된 견해와 반대되지만, cAMP는 글루코스가 제한된 조건보다 급속한 성장 기간 동안 가장 높은 수준으로 존재하며, 따라서 탄소 공급원의 부족보다 이용가능성을 신호화한다고 주장되었다 (문헌 [Dobrova et al., 1984]). 바실러스 종과 같은 낮은 GC 함량 Gm+ 박테리아에서 동화 억제의 cAMP-비의존성 메카니즘이 상세히 연구되었지만, 코리네박테리움 종과 같은 높은 GC 함량 Gm+ 박테리아에서의 정보는 전적으로 부족하다 (검토를 위해 문헌 [Botsford and Harman, 1992; Saier Jr., 1996]을 참고한다). 이 점에 관해서, 본 연구는 탄소 이용에 관련된 유전자의 발현에서 cAMP의 관련에 대한 첫번째 증거를 보이고 있다. 결론적으로, 본 발명자들은 코리네박테리움 aceB 프로모터 및 장 lac 오페론을 운반하는 리포터 플라스미드를 이용하여 씨. 글루타미쿰으로부터 조절 유전자를 성공적으로 단리하였다. glxR 유전자는 aceA 및 aceB 유전자에 대한 리프레서 유사 단백질을 코딩하는 것으로 보이지만, 상기 유전자는 또한 다른 유전자의 발현에 관련될 수 있는 가능성이 있다.

참고문헌

서론

코리네박테리움 글루타미쿰은 그램 양성 유기체이며, 글루타메이트 및 리신과 같은 아미노산의 산업적 제조용 숙주 유기체로서 널리 공지되어 있다 (문헌[Kinoshita, 1995]). 상기 유기체의 아미노산 제조에서의 역할 때문에, 산업적으로 중요한 아미노산을 생성하는 이화 및 동화 경로는 지난 수십년간 상세하게 연구되었다 (검토를 위해, 문헌 [Sahm et al, 1995]; [Malumbres and Martin, 1996]을 참조한다). 물질대사 경로의 심도있는 이해를 위해 필요하지만, 상기 유기체에서의 유전자 발현의 조절 메카니즘에 대한 정보는 매우 제한되어 있다.

씨. 글루타미쿰의 글리옥실레이트 바이패스 (bypass)는 유전자 발현의 조절 메카니즘 연구용으로 우수한 후보자인데, 이는 바이패스 (도 1)를 촉매하는 이소시트레이트 분해효소 및 말레이트 합성효소의 발현이 탄소 공급원의 이용가능성에 의해 밀접하게 조절되기 때문이다 (문헌 [Wendisch et al, 1997]). aceA 유전자를 코딩하는 이소시트레이트 분해효소는 TCA 중간체인 이소시트레이트가 글리옥실레이트 및 숙시네이트로 전환되는 것을 촉매한다 (문헌 [Reinscheid et al, 1994a]). aceB 유전자를 코딩하는 말레이트 합성효소는 글리옥실레이트가 아세틸-CoA와 연속적으로 축합하여 말레이트를 생성하고, 다시 TCA 회로로 들어가는 것을 촉매한다 (문헌 [Lee and Sinskey, 1994]; [Reinscheid et al, 1994b]). aceA 및 aceB 유전자는 탄소의 단독 공급원으로서 제공되는 아세테이트와 같은 2개 탄소 화합물에 의해 활성화되는데, 이는 TCA 회로의 CO₂ 생성 단계를 바이패싱함으로써 세포 물질의 생합성을 위한 아세테이트 탄소를 보존한다. 탄소 공급원으로서 공급된 글루코스는 aceA 및 aceB 유전자를 억제한다. 글리옥실레이트 바이패스 효소의 발현은 이용가능한 탄소 공급원의 전사 수준에서 조절되지만 (문헌 [Wendisch et al, 1997]), 웬디쉬 (Wendisch) 등이 신호화 분자로서 아세틸-CoA의 관련을 제시했음에도 불구하고 (문헌 [Wendisch et al, 1997]), 전자 조절 메카니즘은 거의 알려지지 않고 있다. 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)에서, IclR 리프레서는 aceBAK 오페론의 조절에서 기능을 하는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Chung et al, 1988]; [Sunnarborg et al, 1990]). IclR의 발현은 지방산 대사에 관련된 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지된 FadR에 의해 조절된다. 씨. 글루타미쿰에서의 aceA 및 aceB 유전자의 구조적 구성은 이. 콜라이의 그것과 상이하지만, 이용가능한 탄소 공급원에 의한 유전자 발현은 공통된 특징을 갖는 것으로 보인다.

발명의 개요

본 발명은 적어도 코리네박테리움 글루타미쿰의 aceB 유전자의 유전자 발현을 억제하는 능력을 갖는 신규한 폴리펩티드 분자를 제공한다. 상기 분자는 glxR 분자 (글리옥실레이트 바이패스 조절자)로 지칭된다.

본 발명의 또다른 측면은 상기 glxR 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 측면은 코리네박테리아와 같은 숙주에서 아미노산의 합성에 영향을 미치기 위한 glxR 분자의 용도에 관한 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Use of the repressor glxR for the synthesis of lysine in Corynebacterium glutamicum <130> OZ 0050/53548 <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 228 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Val Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly 1 5 10 15 Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val 20 25 30 Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp 35 40 45 Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala 50 55 60 Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met 65 70 75 80 Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala 85 90 95 Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu 100 105 110 Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg 115 120 125 Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu 130 135 140 Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu 145 150 155 160 Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His 165 170 175 Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu 180 185 190 Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg 195 200 205 Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg 210 215 220 Arg Ala Arg Val 225

Claims (8)

1. cAMP에 결합하고 코리네박테리움 글루타미쿰의 aceB 유전자의 발현을 억제하는 능력을 가지며, 20％ 이하의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 서열 1로부터 수득될 수 있는, 서열 1의 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드 서열 또는 그의 뮤테인.
2. 제1항에 있어서, cAMP 결합 도메인 및 헬릭스-턴-헬릭스 (helix-turn-helix) DNA 결합 모티프를 갖는 단리된 폴리펩티드 서열.
3. 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩티드 서열을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열.
4. 적어도 코리네박테리움의 aceB의 발현을 조절하기 위한 제3항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열의 용도.
5. 제4항에 있어서, 아미노산의 생합성에 영향을 미치기 위한 용도.
6. 제5항에 있어서, 아미노산의 생합성을 증가시키기 위한 용도.
7. 제6항에 있어서, 아미노산이 리신인 용도.
8. 코리네박테리움의 자연 발생 게놈 구성과 상이한 방식으로 코리네박테리움 속의 숙주에서 제3항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시켜 적어도 aceB의 유전자 발현에 영향을 미침으로써 상기 숙주에서 리신을 생성하는 방법.