KR101947959B1 - 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법 - Google Patents

변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법 {A modified homoserine dehydrogenase and a method for producing homoserine or L- amino acid derived from homoserine using the same}
본 출원은 변이형 호모세린 디하이드로게나제에 관한 것으로, 구체적으로 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 갖는 변이형 호모세린 디하이드로게나제로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환된 것, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 것 또는 이들의 조합을 포함하는 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용하여 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-아미노산 중 L-쓰레오닌, L-이소류신 및 L-메티오닌은 아스파테이트-세미알데하이드(aspartate-semialdehyde, 이하 ASA)에서 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase, 이하 Hom, EC:1.1.1.3)에 의해 생성된 호모세린을 공통적으로 이용한다. 따라서 상기 아미노산들을 발효법으로 생산하기 위해서는 생합성 경로에서 이용되는 효소들의 활성을 일정 수준 이상으로 유지하는 것이 필수적이며, 이에 대한 집중적인 연구가 이루어져 왔다.
특히, L-라이신과 L-쓰레오닌 생합성 경로의 분지점에서 작용하는 호모세린 디하이드로게나제는 L-쓰레오닌 및 L-이소류신에 의해 활성이 조절되는 것으로 알려져 있다. L-쓰레오닌에 의한 피드백 억제에 탈감작화된 Hom 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 생산방법에 관해서는 종래에 몇몇 보고가 있어 왔다. 1991년 독일의 Eikmann 등은 Hom의 378번째 아미노산 잔기인 글라이신이 글루타메이트로 전환되어 탈감작화된 Hom를 보고하였으며(Eikmanns BJ et al., Appl. Microbial Biotechnol. 34: 617-622, 1991), 1991년 미국의 Archer 등은 프레임쉬프트 돌연변이로 인해 Hom의 C-말단이 손상될 경우, 탈감작화 특성을 나타낸다는 것을 보고하였다(Archer JA et al., Gene 107: 53-59, 1991).
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 쓰레오닌에 의한 피드백 저해 탈감작화 연구를 수행하던 중 변이형 Hom을 코딩하는 신규 유전자를 분리하고, 상기 신규 유전자가 형질도입된 미생물에서 L-아미노산생산능이 향상됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은, 호모세린 디히드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 호모세린 디하이드로게나제로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산 또는 398번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된 것을 포함하는, 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 변이형 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 호모세린 디하이드로게나제로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산 또는 398번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된 것을 포함하는, 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 제공한다.
구체적으로는 호모세린 디히드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 호모세린 디하이드로게나제로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된 것을 포함하는, 호모세린 디히드로게나제 변이체를 제공한다. 보다 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 제공한다.
본 출원에서 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase, EC:1.1.1.3)는 식물, 미생물에 있어 메티오닌, 쓰레오닌, 이소류신 생합성의 공통 중간물질인 호모세린의 합성을 촉매하는 효소를 의미하며, 호모세린 탈수소효소로도 불린다. 본 출원에서 호모세린 디하이드로게나제는 상기 전환 활성을 가지는 단백질이라면 유래에 상관없이 포함될 수 있으며, 임의의 유기체(식물 및 미생물 등)로부터 유래하는 효소를 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 호모세린 디하이드로게나제는 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있고, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 (corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에 있어서, 호모세린 디하이드로게나제를 확보하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용 가능하다. 그 방법의 예로는 단백질 발현에 통상적으로 널리 이용되는 코리네박테리움 속 미생물에서 단백질을 고효율로 확보할 수 있도록 코돈 최적화가 포함된 유전자 합성 기술 그리고 미생물의 대량 유전체 정보를 기반으로 생물정보학적 방법에 의해 유용 효소자원의 스크리닝 방법을 통해 확보할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서의 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질은 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열, 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본원의 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질에 해당된다. 구체적인 예를 들어, 본원의 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다.
또한, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 예를 들어, 본 출원에서의 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질은 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum) 유래의 호모세린 디하이드로게나제일 수 있다. 보다 구체적으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 호모세린 디하이드로게나제의 아미노산 서열(서열번호 1), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 유래의 호모세린 디하이드로게나제의 아미노산 서열(서열번호 49), 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 호모세린 디하이드로게나제의 아미노산 서열(서열번호 50)일 수 있다. 상기 서열을 갖는 호모세린 디하이드로게나제는 서로 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 보이며, 호모세린 디하이드로게나제로서 상응하는 효능을 나타내므로 본 출원의 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질에 포함됨은 자명하다.
상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원에서 용어 "변이", "변이형" 또는 "변이체"는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻한다. 구체적으로는 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질에 상응하는 아미노산 서열상에서 하나 이상의 아미노산이 변이되어 그 활성이 야생형, 천연형 또는 비변이형과 비교하여 효율적으로 증가되거나, 이소류신, 쓰레오닌, 이들의 유사체 또는 유도체에 대한 피드백 저해가 해제되거나 활성 증가와 피드백 저해 해제가 모두 이루어진 변이체를 의미할 수 있다.
본 출원에서 변이형 호모세린 디하이드로게나제는, "변이된 호모세린 디하이드로게나제", 또는 " 호모세린 디하이드로게나제 변이체"로 혼용될 수 있다. 한편, 이러한 변이체는 비자연적인 (non-naturally occurring) 것일 수 있다.
본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 구체적으로, 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 단백질로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환된 것, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 것 또는 이들의 조합을 포함하는 변이형 호모세린 디하이드로게나제일 수 있다. 상기 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열은 앞서 설명한 바와 같고, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다. 또한 상기 285번째 아미노산은 쓰레오닌이 이소류신으로 치환된 것일 수 있으며, 상기 398번째 아미노산은 아르기닌이 글루타민으로 치환된 것일 수 있다.
또한 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 단백질로서, 상기 아미노산 치환은 378번째 아미노산이 트립토판으로 치환된 것을 포함하는 변이형 호모세린 디하이드로게나제일 수 있다. 또한, 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 단백질로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된 변이형 호모세린 디하이드로게나제에, 378번째 아미노산이 트립토판으로 추가적으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 378번째 아미노산은 글리신이 트립토판으로 치환된 것일 수 있다.
보다 더욱 구체적으로, 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 갖는 변이형 단백질로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환된 것, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 것 또는 이들의 조합을 포함하는, 변이형 호모세린 디하이드로게나제일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 서열번호 10, 11, 12 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 또한 상기 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질에 해당된다. 구체적인 예를 들어, 본원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 서열번호 10, 11, 12 또는 13의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다
또한 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 호모세린 디하이드로게나제 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 갖는 변이형 호모세린 디하이드로게나제로서, 285번째 아미노산 또는 398번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이를 포함하고, 호모세린 디하이드로게나제로서 상응하는 효능을 나타내는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다
또한, 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 야생형 또는 천연형 단백질, 또는 비변형 단백질과 달리, 최종 산물인 이소류신, 쓰레오닌, 메티오닌, 호모세린 또는 이들의 유도체 또는 유사체에 의한 피드백 저해가 해제되거나 탈감작된 특징을 가지는 것일 수 있다. 본 출원에서 용어, "피드백 저해 (feedback inhibition)"는 대사의 최종산물이 그보다 전단계 있는 반응을 저해하는 것을 말한다. 따라서, 호모세린 디하이드로게나제의 피드백 저해를 해제하거나 탈감작하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 미생물의 호모세린 및 호모세린 유래 L-아미노산의 생산성을 높일 수 있다.
상기 호모세린 유래 L-아미노산은 L-호모세린을 전구체로하여 생합성할 수 있는 L-아미노산을 의미하며, L-호모세린으로부터 생합성 될 수 있는 물질이라면 제한되지 않는다. 상기 호모세린 유래 L-아미노산은 호모세린 유래 L-아미노산뿐만 아니라 이의 유도체도 포함할 수 있다. 예를 들어 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린, O-석시닐-L-호모세린, O-포스포-L-호모세린, L-메티오닌 및/또는 L-글리신일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린, O-석시닐-L-호모세린 및/또는 L-메티오닌 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 호모세린 디하이드로게나제, 변이형에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 변이형 상기 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다. 본 출원의 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 호모세린 디하이드로게나제 활성을 갖는 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원에서 호모세린 디하이드로게나제 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있으며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로는, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 실질적으로 상기 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리뉴클레오티드 서열도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 본 출원의 호모세린 디하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 48의 폴리뉴클레오티드 서열 일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 또한 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 10, 11, 12 또는 13을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 6, 7, 8, 9의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1xSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1xSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1xSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드의 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물을 제공한다. 구체적으로는 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속(the genus of Corynebacterium) 미생물을 제공하는 것이다. 또한 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는, L-알라닌을 생산하는 코리네박테리움 속(the genus of Corynebacterium) 미생물을 제공하는 것이다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
상기 호모세린 디하이드로게나제, 변이체에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
구체적으로 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은 자연적으로 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산능이 없는 모균주에 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 발현하는 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 미생물은, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 상기 숙주세포 또는 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하여 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은 야생형 또는 비변형 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질을 포함하는 미생물에 비하여 호모세린, 호모세린 유래 L-아미노산 또는 L-알라닌의 생산능이 향상되므로, 이들 미생물로부터 호모세린, 호모세린 유래 L-아미노산 또는 L-알라닌을 고수율로 수득할 수 있다.
본 출원에서 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물일 수 있다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로는, 본 출원에서 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.
한편, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은 호모세린 디하이드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 도입은 형질전환에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (Ca(H2PO4)2, CaHPO4, 또는 Ca3(PO4)2) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은, 코리네박테리움 속 미생물에 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하도록 형질전환된 것일 수 있다. 상기 코리네박테리움속 미생물은 예시적으로 2-amino-3-hydroxy-valerate(AHV)에 내성을 갖는 균주; 쓰레오닌 생합성 경로에서 첫번째 중요한 효소로 작용하는 aspartate kinase(lysC)의 피드백 저해(feedback inhibition) 해소를 위해 lysC의 377번 아미노산인 루신(Leucine)을 라이신(Lysine)으로 치환하여, L-쓰레오닌을 생산하는 균주; 상기 L-쓰레오닌을 생산하는 균주에서 L-쓰레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase, isoleucine 생합성 경로의 첫 번째 효소)를 코딩하는 유전자 ilvA의 323번째 아미노산을 알라닌으로 치환하여 L-이소류신을 생산하는 균주 (Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p.4345-4351); O-아세틸-호모세린 분해경로의 O-아세틸-호모세린 티올 리아제(O-acetylhomoserine (thiol)-lyase) 및, 시스타치오닌 감마 신타제(cystathionine gamma-synthase) 단백질이 불활성화되어 O-아세틸 호모세린을 생산하는 균주; 또는 메티오닌 시스테인 전사 조절인자 단백질이 불활성화되어 메티오닌을 생산하는 균주가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 기술된 미생물을 배지에서 배양하는 단계 및 상기 배양된 미생물 또는 배양된 배지로부터 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 의 생산 방법을 제공한다.
상기 미생물은 상기 설명한 바와 같이 본 출원의 호모세린 디하이드로게나제 변이체를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있으며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 또한, 상기 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 글루타미쿰은 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산하는 미생물일 수 있다. 상기 호모세린 유래 L-아미노산은 호모세린 유래 L-아미노산뿐만 아니라 이의 유도체도 포함할 수 있다. 예를 들어 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린, O-석시닐-L-호모세린, O-포스포-L-호모세린, L-메티오닌 및/또는 L-글리신일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린, O-석시닐-L-호모세린 및/또는 L-메티오닌 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-알라닌을 생산하는 미생물일 수 있다.
상기 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산은, 본 출원의 기술된 미생물이 생산한 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 배양액이거나, 정제된 형태일 수 있다. 또한 그 자체 형태뿐 아니라, 이의 염 형태도 모두 포함함은 당업자에게 자명하다.
상기 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건 및 효소 활성 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다
상기 방법에 있어서 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 쓰레오닌, 이소류신, 또는 아세틸호모세린은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 산물을 수득할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적 물질인 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 회수 할 수 있다. 또한, 상기 회수 단계는 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 천연형 또는 야생형에 비하여 최종 산물에 의한 피드백 억제가 탈감작화되어 보다 효율적인 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 대량 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인공변이법을 통한 AHV 내성 미생물 스크리닝
본 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881(대한민국 등록특허 제0159812호)을 모균주로 하여 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase, 이하, Hom, EC:1.1.1.3)의 L-쓰레오닌에 의한 피드백 억제를 해제하기 위하여 L-쓰레오닌 유사체인 2-amino-3-hydroxy-valerate(이하, AHV)에 대한 내성을 부여하는 실험을 실시하였다.
N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: 이하, NTG)을 사용한 인공변이법으로 변이를 유도하였다. 종배지에서 18시간 동안 배양한 KFCC10881 균주를 종배지 4 ml에 접종한 후, OD660이 약 1.0이 될 때까지 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 후, 50 mM Tris-malate 완충용액(pH6.5)으로 2회 세척하여 최종 4 ml의 동일한 완충용액으로 현탁하였다. 균체 현탁액에 최종농도 150 mg/l이 되도록 NTG 용액 (2 mg/ml in 0.05M Tris-malate 완충용액(pH6.5))을 첨가하여 실온에서 20분 간 정치한 후, 원심분리를 통해 균체를 수거하였으며, NTG 제거를 위하여 동일한 완충용액으로 2회 세척하였다. 최종적으로 세척한 균체를 20% 글리세롤 용액 4 ml에 현탁 한 후, 사용 전까지 -70℃에 보관하였다. NTG 처리 균주를 3g/l의 AHV를 포함하는 최소배지에 도말하였으며, 상기 과정을 통하여 155주의 AHV 내성 KFCC10881 균주를 획득하였다.
종배지 (pH 7.0)
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
최소배지 (pH 7.2)
포도당 5 g, KH2PO4 1 g, (NH4)2SO4 5 g, MgSO4 7H2O 0.4 g, NaCl 0.5 g 바이오틴 200 ㎍, 티아민 HCl 100 ㎍, 칼슘-판토텐산 100 ㎍, 니코틴아마이드 0.03 g, 요소 2 g, Na2B4O710H2O 0.09 mg, (NH4)6Mo7O274H2O 0.04 mg, ZnSO47H2O 0.01 mg, CuSO45H2O, MnCl24H2O 0.01 mg, FeCl36H2O 1 mg, CaCl2 0.01 mg (증류수 1 리터 기준)
실시예 2: AHV 내성 KFCC10881 균주에 대한 L-쓰레오닌 생산 테스트
실시예 1에서 획득한 155주의 AHV 내성 균주에 대하여 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였다. 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 실시예 1에서 획득한 155주의 균주를 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
L-쓰레오닌 생산배지 (pH 7.2)
포도당 30g, KH2PO4 2g, Urea 3g, (NH4)2SO4 40g, Peptone 2.5g, CSL(Sigma) 5g(10 ml), MgSO4.7H2O 0.5g, Leucine 400mg, CaCO3 20g(증류수 1 리터 기준)
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 여러 아미노산의 생산량을 측정하였다. 실험한 155주의 균주 중 L-쓰레오닌 생산능이 우수한 것으로 나타난 상위 22주에 대한 아미노산의 배양액 내 농도를 표 1에 나타내었다. 상기 과정을 통하여 확인된 22주의 후보를 각각 KFCC10881-1 내지 KFCC10881-22로 명명하였다.
우수 AHV 내성 균주 L-쓰레오닌 생산 실험
OD Thr Hse Gly Ala Ile Lys Thr+Hse +Gly+Ile
KFCC10881 58.5 0.0 0.1 0.3 0.1 0.0 13.3 0.4
KFCC10881-1 60.1 2.0 1.5 2.8 1.6 2.7 5.7 7.7
KFCC10881-2 57.1 3.0 2.2 0.8 3.1 1.3 12.5 7.3
KFCC10881-3 47.3 2.8 2.3 0.8 3.4 1.4 10.5 7.3
KFCC10881-4 51.7 3.2 2.1 0.8 3.2 1.3 13.4 7.4
KFCC10881-5 58.4 3.1 2.2 0.8 3.3 1.3 12.4 7.4
KFCC10881-6 52.6 3.4 2.5 0.7 3.4 1.0 12.8 7.6
KFCC10881-7 14.2 0.4 0.2 0.3 0.2 0.6 11.1 1.5
KFCC10881-8 55.8 3.0 2.0 0.8 3.3 1.3 13.0 7.1
KFCC10881-9 44.3 3.2 2.8 0.6 3.1 0.9 12.6 7.5
KFCC10881-10 47.5 3.7 3.0 0.7 3.4 0.8 12.6 8.2
KFCC10881-11 57.0 2.7 1.8 0.7 3.4 1.2 11.6 6.4
KFCC10881-12 51.8 3.3 3.5 0.6 3.2 0.9 12.4 8.3
KFCC10881-13 49.8 3.0 2.3 0.7 3.4 1.3 12.8 7.3
KFCC10881-14 62.7 2.4 2.1 2.5 3.2 3.0 3.3 10.0
KFCC10881-15 62.4 2.9 2.7 0.7 3.2 1.1 12.3 7.4
KFCC10881-16 59.6 2.8 2.5 0.8 3.3 1.3 11.4 7.4
KFCC10881-17 24.1 0.1 0.2 0.2 1.6 0.2 10.4 0.7
KFCC10881-18 60.5 2.6 2.5 0.7 3.2 1.0 12.3 6.8
KFCC10881-19 60.0 3.0 1.9 2.8 2.7 3.0 5.4 9.3
KFCC10881-20 65.8 2.7 2.0 0.8 3.4 1.4 13.0 6.9
KFCC10881-21 17.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.6 11.1 1.5
KFCC10881-22 60.1 3.5 1.9 2.0 2.5 2.8 2.7 10.2
표 1의 결과와 같이, AHV 내성을 갖는 22종의 균주가 생산하는 L-쓰레오닌, L-호모세린, L-글리신, L-알라닌, L-이소류신은 대조군 대비 증가한 반면, L-라이신은 감소하는 결과를 보였다.
L-쓰레오닌과 L-라이신의 생합성 경로는 아스파르테이트 세미알데히드(aspartate-semialdehyde, 이하, ASA)를 기점으로 갈라지게 된다. 즉, L-쓰레오닌의 생산량이 늘어날수록 L-라이신의 생산량은 감소하게 된다. 이에 따라 L-쓰레오닌 생산량이 증가할수록 L-쓰레오닌 생합성 경로상 부산물이 될 수 있는 호모세린(Hse), L-글라이신(Gly), L-이소류신(Ile)도 늘어날 수 있으므로, 이들의 생산량의 총합(Thr + Hse + Gly + Ile)도 확인하였다.
따라서, 상기 AHV 내성 균주들 중 L-라이신의 생산량이 감소하고, L-쓰레오닌 생산량이 높고, Thr + Hse + Gly + Ile 전체 생산량이 높은 4종 균주들 (KFCC10881-1, KFCC10881-14, KFCC10881-19, 및 KFCC10881-22)을 가장 우수한 AHV 내성 균주로 선별하였다.
실시예 3: KFCC10881 유래 쓰레오닌 생산능이 우수한 균주들의 염기서열 분석
상기 실시예 1에서 선별한 균주들의 L-쓰레오닌 생합성 효소들의 염기서열을 분석하기 위하여 다음과 같이 진행하였다. KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에서 제공하는 유전자 정보에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하고 있는 hom의 염기서열(서열번호 1, NCgl1136), 호모세린키나제를 코딩하고 있는 thrB의 염기서열(서열번호 2, 유전자 번호 NCgl1137)을 각각 확보하였다. hom와 thrB는 오페론 구조를 이루고 있는 것으로 알려져 있다 (Peoples et al., Mol. Biol. 2(1):63-72, 1988).
선별된 균주들의 hom-thrB 오페론을 포함한 DNA 단편을 확보하기 위하여 균주들의 균체를 주형으로 사용하여, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 조합으로 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 52℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 3분을 30회 반복하였다. 그 결과, 서열번호 1의 개시코돈 상단으로 프로모터 부위를 포함한 300bp의 염기서열을 포함하여 서열번호 2의 종결코돈 하단 200 bp를 포함한 2778bp의 유전자 단편을 증폭할 수 있었다(서열번호 5).
상기 제작된 프라이머를 이용하여 ABI PRISM 3730XL Analyzer(96 capillary type, Applied Biosystems)로 염기서열을 결정하였다. KFCC10881-1 내의 hom-thrB 오페론 중 hom에 해당하는 염기서열은 서열번호 1의 854번째 염기 시토신이 티아민으로 변이되어 쓰레오닌 잔기를 코딩하는 ACT 유전자 코돈이 이소류신 잔기를 코딩하는 ATT 유전자 코돈으로 변이되었음을 알 수 있었다 (이하 T285I변이; 서열번호 6). 또한, KFCC10881-14 내의 hom-thrB 오페론에 해당하는 염기서열은 서열번호 1의 1193번째 염기 구아닌이 아데닌으로 변이되어 알지닌 잔기를 코딩하는 CGA 유전자 코돈이 글루타민 잔기를 코딩하는 CAA 유전자 코돈으로 변이되었음을 알 수 있었다(이하 R398Q 변이; 서열번호 7). 또한, KFCC10881-19 내의 hom-thrB 오페론에 해당하는 염기서열은 서열번호 1의 1132번째 염기인 구아닌이 시토신으로 변이되어 글리신 잔기를 코딩하는 GGG 유전자 코돈이 트립토판 잔기를 코딩하는 TGG 유전자 코돈으로 변이되었음을 알 수 있었다(이하 G378W변이; 서열번호 8). 또한, KFCC10881-22 내의 hom-thrB 오페론에 해당하는 염기서열은 서열번호 1의 1132번째 염기 구아닌이 아데닌으로, 1134번째 염기 구아닌이 시토신으로 변이되어 글리신 잔기를 코딩하는 GGG 유전자 코돈이 세린 잔기를 코딩하는 AGC 유전자 코돈으로 변이되었음을 알 수 있었다(이하 G378S변이; 서열번호 9). 한편 서열번호 2에 해당하는 thrB에서는 변이가 발견되지 않았다.
상기 염기서열 분석 결과를 종합해 볼 때, 결과적으로 KFCC10881-1내에서 발현되는 Hom(서열번호 10)은 285번째 아미노산 잔기인 쓰레오닌이 이소류신(이하 T285I 변이), KFCC10881-14내에 발현되는 Hom(서열번호 11)은 398번째 아미노산 잔기인 아르기닌이 글루타민(이하 R398Q 변이), KFCC10881-19내에 발현되는 Hom(서열번호 12)은 378번째 아미노산 잔기인 글리신이 트립토판(이하 G378W 변이), KFCC10881-22내에 발현되는 Hom(서열번호 13)은 378번째 아미노산 잔기인 글리신이 세린(이하 G378S 변이)으로 변이됨으로써 L-쓰레오닌에 의한 피드백 억제에 탈감작화 되었음을 알 수 있었다.
실시예 4: 신규 호모세린 디하이드로게나제 도입 균주 제작
상기 실시예 2에서 확인한 변이체들(T285I, R398Q, G378W, G378S)이 야생형 균주 유래로 도입된 균주를 제작하기 위하여 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 제작하였다.
T285I, R398Q, G378W, G378S hom변이가 각각 도입된 균주들을 제작하기 위해 KFCC10811-1, KFCC10811-14, KFCC10811-19, KFCC10811-22 균주로부터 각각 추출한 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 사용하여 각각 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복하였다. 그 결과, 1338bp의 hom 유전자의 약 300bp 프로모터 부위를 포함한 1668bp의 유전자 단편을 각각 수득하였다. 증폭산물을 QUIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 T285I, R398Q, G378W, G378S 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-T285I, pDZ-R398Q, pDZ-G378W, pDZ-G378S를 제작하였다.
각각 제작된 벡터를 전기천공법에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 각각 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었다. 적절한 치환 여부는 아래에 열거된 프라이머 조합을 사용하여 MASA(Mutant Allele Specific Amplification) PCR 기법(Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993))을 사용하여 각 변이형 서열에 부합하는 프라이머 조합(CTR-T285I : 서열번호 16 및 서열번호 17, CTR-R398Q : 서열번호 16 및 서열번호 18, CTR- G378W : 서열번호 16 및 서열번호 19, CTR-G378S : 서열번호 16 및 서열번호 20)에서는 증폭되는 균주를 선별함으로써 1차 결정하였으며, 선별된 균주의 hom 서열분석은 서열번호 16 및 서열번호 21을 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 변이형 서열 분석함으로써 2차 확인하였다. 각각의 변이형 염기로 치환된 균주는 CTR-T285I, CTR-R398Q, CTR-G378W, CTR-G378S로 명명하였다.
실시예 5: 호모세린 디하이드로게나제 효소활성의 측정
상기 제작한 균주들를 대상으로 Hom 효소활성을 측정하였다. 실시예 4에서 제작된 CTR-T285I, CTR-R398Q, CTR-G378W, CTR-G378S 및 대조군으로 야생형 균주(ATCC13032)를 하기 종배지 25 ml에 접종한 후, 대수기 후반부까지 배양하였다. 원심분리를 통하여 균체를 회수하여, 0.1 M potassium phosphatepH7.6) 완충용액으로 2회 세척한 후, 30%의 농도로 글리세롤을 함유하고 있는 동일 완충용액 2 ml로 최종 현탁하였다. 균체 현탁액을 일반적인 글래스비드 볼텍싱법으로 10분간 물리적으로 파쇄한 후, 2회의 원심분리(13,000 rpm, 4℃, 30분)를 통하여 상층액을 회수, Hom 효소활성 측정을 위한 조효소액(crude extract)으로 사용하였다. Hom 효소활성 측정을 위하여 효소 활성 측정용 반응액 (potassium phosphate (pH7.0) 완충용액, 25 mM NADPH, 5 mM aspartate semi-aldehyde) 0.9 ml에 0.1 ml 조효소액을 첨가한 후, 30℃에서 반응하였다. Hom 효소활성 U는 L-쓰레오닌 유무(0mM, 10mM)에 따라 분당 소모한 NADPH umol 수로 정의하였으며, 효소 활성 측정 결과는 하기 표 2와 같다.
Hom 효소활성(U) 및 L-쓰레오닌에 의한 탈감작화 측정
균주 L-쓰레오닌 첨가량 (mM)에 따른 효소활성(U)
0 mM 10 mM
ATCC13032 0.92 0.02
CTR-T285I 1.11 0.82
CTR-R398Q 1.31 1.12
CTR-G378W 1.39 1.21
CTR-G378S 1.38 1.22
실험 결과, T285I, R398Q, G378W, G378S 변이를 각각 포함하고 있는 Hom의 경우, 10 mM L-쓰레오닌이 포함되어 있는 조건에서 야생형 Hom와 달리 활성억제 정도가 감소하여, L-쓰레오닌에 대해 탈감작화 되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 6: L-쓰레오닌 생산능을 가진 코리네박테리움 속 미생물 균주 제작 및 평가
야생종 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 로부터 L-쓰레오닌 생산 균주를 개발하였다. 구체적으로, 쓰레오닌 생합성 경로에서 첫번째 중요한 효소로 작용하는 aspartate kinase(lysC)의 피드백 저해(feedback inhibition) 해소를 위해 lysC의 377번 아미노산인 루신(Leucine)을 라이신(Lysine)으로 치환하였다 (서열번호 22).
더 구체적으로, lysC(L377K) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 23 및 서열번호 24 혹은 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 515 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 538bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 23 및 서열번호 26의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 루신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 코딩하는 lysC 유전자의 변이를 포함하는 1023bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭산물을 QUIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 L377K 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-L377K를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 ATCC13032에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 각 염기변이가 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 CJP1로 명명하였다.
상기 균주의 L-쓰레오닌 생산 변화를 명확히 확인하기 위하여, 호모세린 디하이드로게나제(homoserin dehydrogenase)를 코딩하는 유전자에 상기 실시예 4에서 확인한 변이들을 각각 도입하였다. 구체적으로, T285I, R398Q, G378W, G378S 변이를 CTR-L377K 균주에 각각 도입하기 위해서 실시예 4에서 제작된 pDZ-T285I, pDZ-R398Q, pDZ-G378W pDZ-G378S 벡터를 전기천공법으로 CJP1에 형질전환하고, 실시예 4와 동일한 방법으로 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 각 염기변이가 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었다. 각각의 변이형 염기로 치환된 균주는 CJP1-T285I, CJP1-R398Q, CJP1-G378W, CJP1-G378S로 명명하였다.
상기 균주 CJP1-T285I, CJP1-R398Q는 2017년 9월 26일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 각각 KCCM12119P, KCCM12120P로 기탁번호를 부여받았다.
제작 균주 4종의 L-쓰레오닌 생산능 확인
균주 Amino acid (g/l)
Thr Lys
CJP1 0.40 3.60
CJP1-T285I 1.10 3.00
CJP1-R398Q 1.21 2.75
CJP1-G378W 1.30 2.68
CJP1-G378S 1.25 2.78
그 결과, 각각의 변이를 도입한 균주들은 대조군인 CJP1 균주 대비 L-라이신의 생산량이 감소하고 L-쓰레오닌 생산량이 0.7 ~ 0.9g/L씩 증가하였다.
한편, T285I, R398Q 변이를 동시에 포함하는 균주를 얻기 위해 pDZ-R398Q 벡터를 CJP1-T285I 균주에 형질전환하고, 상기와 동일한 방법으로 균주를 수득하였다(CJP1-T285I,R398Q). 또한, G378W, R398Q 변이를 동시에 포함하는 균주를 얻기 위해 pDZ-R398Q 벡터를 CJP1-G378W에 형질전환하고, 상기와 동일한 방법으로 균주를 수득하였다(CJP1-G378W,R398Q). 또한, T285I, G378W 변이를 동시에 포함하는 균주를 얻기 위해 pDZ-G378W 벡터를 CJP1-T285I에 형질전환하고, 상기와 동일한 방법으로 균주를 수득하였다(CJP1-T285I,G378W). 실시예 2의 방법으로 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였으며 하기 표 4에 나타내었다.
제작 균주 3종의 L-쓰레오닌 생산능 확인
균주 Amino acid (g/l)
Thr Lys
CJP1 0.41 3.55
CJP1-G378W 1.30 2.68
CJP1-T285I,R398Q 1.41 2.65
CJP1-G378W,R398Q 2.12 1.92
CJP1-T285I,G378W 1.92 2.15
그 결과, 앞의 실시예에서 가장 높은 Thr 생산능을 보이는 CJP1-G378W 대비 본 발명의 변이를 2 종 도입한 경우 보다 높은 Thr 생산능을 확인하였다. 두 변이를 도입한 균주들은 대조군인 CJP1 균주 대비 쓰레오닌 생산량이 1.1 ~ 1.7g/L씩 증가하였고, 따라서 Hom의 탈감작화 효과가 크게 향상된 것을 확인 할 수 있었다.
실시예 7: L-이소류신 생산능을 가진 코리네박테리움 속 미생물 균주 제작 및 평가
이소류신 생산 균주를 제작하기 위해, 실시예 6에서 제작된 균주들에서 기 공지된 L-쓰레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase, isoleucine 생합성 경로의 첫 번째 효소)를 코딩하는 변이 유전자 ilvA(V323A) (Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p.4345-4351)의 발현을 강화하기 위한 벡터를 제작하였다.
구체적으로, ilvA 유전자를 대상으로 변이 도입 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 27 및 28)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 29 및 30)을 고안하였다. 서열번호 27 및 30의 프라이머는 각 말단에 BamHⅠ 제한 효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 서열번호 28 및 29의 프라이머는 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다.
서열번호 염기서열
27 ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG
28 ACACCACGgCAGAACCAGGTGCAAAGGACA
29 CTGGTTCTGcCGTGGTGTGCATCATCTCTG
30 ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC
야생형의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 27 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 627 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 608 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 27 및 서열번호 30의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 323번째 발린이 알라닌으로 치환된 IlvA 변이체를 코딩하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1217 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 1011 bp의 DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117-ilvA(V323A)라 명명하였다.
pECCG117-ilvA(V323A)벡터를 실시예 6에서 제작된 CJP1-T285I,R398Q, CJP1-G378W,R398Q, CJP1-T285I,G378W 균주들에 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 형질전환주를 획득하였다. 실시예 2에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-이소류신 농도를 분석하여 표 6에 나타내었다.
제작된 균주 평가
균주 L-이소류신(g/L)
CJP1/pECCG117-ilvA(V323A) 0.7
CJP1-G378W/pECCG117-ilvA(V323A) 0.9
CJP1-T285I,R398Q/pECCG117-ilvA(V323A) 1.1
CJP1-G378W,R398Q/pECCG117-ilvA(V323A) 1.2
CJP1-T285I,G378W/pECCG117-ilvA(V323A) 1.0
그 결과, hom(G378W)변이를 포함하는 균주에서 대조군 균주 대비 L-이소류신 생산능이 0.2g/L 향상되었음을 확인할 후 있었다. 또한, 두 변이가 동시에 도입된 hom 변이를 포함하는 균주는 대조군 균주 대비 L-이소류신 생산능이 0.3~0.5g/L 로 더욱 향상되었고, 그 중 T285I, R398Q 두 변이를 모두 포함하는 CJP1-T285I, R398Q/pECCG117-ilvA(V323A) 균주에서 1.1g/l L-이소류신이 생산되었다.
실시예 8: 변이형 Hom으로 치환된 O-아세틸-호모세린(OAH) 생산 균주 제작 및 평가
8-1. 변이형 Hom으로 치환된 ATCC13032 균주 제작
상기 실시예 7과 동일한 방법으로, ATCC13032 균주에 T285I 및 R398Q의 2종의 변이를 도입하였고, 이 균주를 ATCC13032::HomFBR 이라 명명하였다.
8-2. metB 유전자의 결손
본 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, O-아세틸-호모세린 분해경로의 시스타치오닌 감마 신타제(cystathionine gamma-synthase)를 코딩하는 metB 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)을 근거로 하여 metB 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 Ncgl2360, 서열번호 31)를 확보하고, 이에 근거하여 metB 유전자의 N-terminal 부분과 linker sequence를 함유하는 프라이머(서열번호 32, 33), C-terminal 부분과 linker부분을 함유하는 프라이머(서열번호 34, 35) 를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 32과 33 및 34과 35의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하였다. 그 결과, metB 유전자의 N-terminal 부분과 linker를 함유한 500bp의 증폭된 유전자와 metB 유전자의 C-terminal 부분과 linker를 함유한 500bp 증폭된 유전자를 획득하였다.
상기에 획득한 증폭된 두 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 60초; 어닐링 50℃, 60초; 및 중합반응 72℃, 1분을 10회 반복 후 서열번호 32 및 35를 첨가 후 20회 반복하였다. 그 결과 metB 유전자의 N-terminal-linker-C-terminal을 함유한 metB 불활성화 카세트인 1000bps의 증폭된 Δ metB 유전자를 획득하였다. 상기 PCR을 통하여 획득한 metB 유전자에 말단에 포함된 제한효소 XbaI, SalI을 처리하고, 제한효소 XbaI, SalI가 처리된 pDZ(KR 0924065) 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하였고 최종적으로 metB 불활성화 카세트가 클로닝된 pDZ-ΔmetB 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDZ-ΔmetB 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, ATCC13032::HomFBR 에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 metB 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔmetB, ATCC13032::HomFBR ΔmetB 을 얻었다. 불활성화된 metB 유전자는 서열번호 32 과 35의 프라이머를 이용한 PCR을 후 metB 유전자가 불활성화 되지 않은 ATCC13032와 비교를 통하여 최종 확인하였다.
8-3. metY 유전자의 결손
본 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, O-아세틸-호모세린 분해경로의 O-아세틸-호모세린 티올 리아제(O-acetylhomoserine (thiol)-lyase)를 코딩하는 metY 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)을 근거로 하여 metY 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 Ncgl0625, 서열번호 36)를 확보하고, 이에 근거하여 metY 유전자의 N-terminal 부분과 linker sequence를 함유하는 프라이머(서열번호 37, 38), C-terminal 부분과 linker부분을 함유하는 프라이머(서열번호 39, 40)를 합성하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 37과 38 및 서열번호 39과 40의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하였다. 그 결과, metY 유전자의 N-terminal 부분과 linker를 함유한 500bp의 증폭된 유전자와 metY 유전자의 C-terminal 부분과 linker를 함유한 500bp 증폭된 유전자를 획득하였다. 상기에 획득한 증폭된 두 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 60초; 어닐링 50℃, 60초; 및 중합반응 72℃, 1분을 10회 반복 후 서열번호 37 및 40를 첨가 후 20회 반복하였다. 그 결과 metY 유전자의 N-terminal-linker-C-terminal을 함유한 metB 불활성화 카세트인 1000bps의 증폭된 Δ metY 유전자를 획득하였다.
상기 PCR을 통하여 획득한 metY 유전자에 말단에 포함된 제한효소 XbaI, SalI을 처리하고, 제한효소 XbaI, SalI가 처리된 pDZ(KR2008-0025355) 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하였고 최종적으로 met Y 불활성화 카세트가 클로닝된 pDZ-ΔmetY 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDZ-ΔmetY 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, ATCC13032::HomFBR, ATCC13032 ΔmetB, ATCC13032::HomFBR ΔmetB 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 metY 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔmetY, ATCC13032::HomFBR ΔmetY, ATCC13032 ΔmetB ΔmetY, ATCC13032::HomFBR ΔmetB ΔmetY 을 얻었다. 불활성화된 metY 유전자는 서열번호 37 과 40의 프라이머를 이용한 PCR을 후 metY유전자가 불활성화 되지 않은 ATCC13032와 비교를 통하여 최종 확인하였다.
8-4. O-아세틸-호모세린 생산 균주 제작 및 평가
실시예 8-1 내지 8-3에서 제작된, metB, metY, metBY 유전자가 결손되고 변이형 hom 유전자로 치환된 ATCC13032, ATCC13032ΔmetB, ATCC13032 ΔmetY, ATCC13032 Δ metB Δ metY, ATCC13032::HomFBR, ATCC13032::HomFBR Δ metB, ATCC13032::HomFBR Δ metY, ATCC13032::HomFBR Δ metB Δ metY 균주의 O-아세틸-호모세린 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 32℃의 배양기에서 LB 고체배지에서 밤새 배양한 단일 콜로니를 25 ml의 O-아세틸-호모세린 역가 배지에 1 백금이씩 접종하여 32℃에서 250 rpm으로 42-64시간 동안 배양하였다. 배양물로부터 O-아세틸-호모세린을 HPLC에 의하여 분석하였다. 분석 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
L-O-아세틸호모세린 생산배지 (pH 7.2)
포도당 30 g, KH2PO4 2 g, Urea 3 g, (NH4)2SO4 40 g, Peptone 2.5 g, CSL(Sigma) 5 g(10 ml), MgSO4.7H2O 0.5 g, Methionine 400 mg, Leucine 400 mg, CaCO3 20 g (증류수 1 리터 기준)
O-아세틸-호모세린 생산 평가
Strains O-AH production(g/L)
ATCC13032 - 0.0
metB 0.3
metY 0.3
metBY 0.5
ATCC13032::HomFBR
(T285I + R398Q)		 - 0.0
metB 1.2
metY 1.4
metBY 3.5
그 결과, 상기 표 7과 같이 대조군 균주인 Corynebacteria glutamicum ATCC13032를 배양시 O-아세틸-L-호모세린이 축적되지 않는 반면, metB, metY, metBY가 불활성화된 ATCC13032 Δ metB, ATCC13032 Δ metY, ATCC13032 Δ metB Δ metY 균주에서는 각각 0.3, 0.3, 0.5 g/L의 O-아세틸-L-호모세린이 축적되었음을 확인하였다.
또한, hom 유전자를 mutant 형태로 치환한 ATCC13032::HomFBR 균주, 상기 균주에서 metB, metY, metBY가 각각 불활성화된 ATCC13032::HomFBR Δ metB, ATCC13032::HomFBR Δ metY, ATCC13032::HomFBR Δ metB Δ metY 균주의 경우 각각 1.2, 1.4, 3.5g/L의 O-아세틸-L-호모세린이 축적된 것을 확인 할 수 있었다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 변이형 hom을 사용하여 호모세린을 전구체로 사용하는 목적 아미노산의 생산량을 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 9: 메티오닌(Met) 생산 균주 제작 및 평가
실시예 9-1: mcbR 유전자 결손을 위한 재조합 벡터 제작
본 실시예에서는 메티오닌 생산 균주를 제작하기 위해, 실시예 6에서 제작된 균주들에서 기 공지된 메티오닌 시스테인 전사 조절인자 단백질를 코딩하는 mcbR (J. Biotechnol. 103:51-65, 2003) 의 불활성화를 위해 벡터를 제작하였다.
구체적으로, mcbR 유전자를 코리네박테리움 ATCC13032 염색체 상에서 결손시키기 위하여 하기의 방법으로 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다. 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 mcbR 유전자 및 주변서열(서열번호 41)을 확보하였다.
결손된 mcbR 유전자를 획득하기 위한 목적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 42 및 서열번호 43, 서열번호 44 및 서열번호 45의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 700bp DNA 단편들을 수득하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)와 상기 증폭한 mcbR 유전자 단편들을 염색체 도입용 제한효소 smaI 으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자들의 결손된 단편이 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 pDZ-△mcbR 이라 명명하였다.
실시예 9-2: L-메티오닌 생산능을 가진 코리네박테리움 속 미생물 균주 제작 및 평가
상기 실시예 9에서 제작된 pDZ-△mcbR 벡터를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 실시예 6에서 제작된 CJP1-G378W, CJP1-T285I,R398Q, CJP1-G378W,R398Q, CJP1-T285I,G378W와 CJP1 균주들에 전기천공법으로 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 그 후, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 프라이머 46와 프라이머 47을 이용하여 PCR법을 통하여 mcbR 유전자가 결손된 균주를 확인하였다. 본 재조합 균주들은 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 CJP1-G378W/ΔmcbR, CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR, CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR, CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR, CJP1/ΔmcbR 이라 명명하였다.
상기 제작된 CJP1-G378W/ΔmcbR, CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR, CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR, CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR 균주의 L-메티오닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJP1/ΔmcbR 균주와 함께 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 CJP1/ΔmcbR 과 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJP1-G378W/ΔmcbR, CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR, CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR, CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR 를 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
상기 배양 방법으로 배양하여 배양액의 중의 L-메티오닌 농도를 분석하여 표 3에 나타내었다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 8.0)>
포도당 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, Yeast extract 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1.2 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
상기 배양 방법으로 배양하여 배양액의 중의 L-메티오닌 농도를 분석하여 표 8에 나타내었다.
제작된 균주 평가
균주 L-메티오닌(g/L)
CJP1/ΔmcbR 0.01
CJP1-G378W/ΔmcbR 0.13
CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR 0.18
CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR 0.20
CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR 0.17
그 결과, G378W hom변이를 포함하는 균주에서 대조군 균주 대비 L-메티오닌 생산능이 0.12g/L 향상되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 두 변이가 동시에 도입된 hom 변이를 포함하는 균주들은 대조균 균주 대비 L-메티오닌 생산능이 0.16 ~ 0.19 g/l 향상되었음을 확인 할 수 있었다.
상기 결과로부터 본 발명의 변이형 hom을 사용하여 L-메티오닌의 생산량을 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다
한국미생물보존센터(국외) KCCM12119P 20170926 한국미생물보존센터(국외) KCCM12120P 20170926
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A modified homoserine dehydrogenase and a method for producing homoserine or L- amino acid derived from homoserine using the same <130> KPA170974-KR <160> 50 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> homoserine dehydrogenase <400> 1 Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu 20 25 30 Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile 35 40 45 Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala 65 70 75 80 Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly 85 90 95 Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys 100 105 110 Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu 115 120 125 Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala 130 135 140 Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160 Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr 165 170 175 Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp 180 185 190 Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr 195 200 205 Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240 Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala 245 250 255 Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys 260 265 270 Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro 275 280 285 Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe 290 295 300 Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320 Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala 325 330 335 Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr 340 345 350 Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365 Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu 385 390 395 400 Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu 405 410 415 Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val 420 425 430 Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp 435 440 445 <210> 2 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> thrB gene <400> 2 atggcaattg aactgaacgt cggtcgtaag gttaccgtca cggtacctgg atcttctgca 60 aacctcggac ctggctttga cactttaggt ttggcactgt cggtatacga cactgtcgaa 120 gtggaaatta ttccatctgg cttggaagtg gaagtttttg gcgaaggcca aggcgaagtc 180 cctcttgatg gctcccacct ggtggttaaa gctattcgtg ctggcctgaa ggcagctgac 240 gctgaagttc ctggattgcg agtggtgtgc cacaacaaca ttccgcagtc tcgtggtctt 300 ggctcctctg ctgcagcggc ggttgctggt gttgctgcag ctaatggttt ggcggatttc 360 ccgctgactc aagagcagat tgttcagttg tcctctgcct ttgaaggcca 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Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile 35 40 45 Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala 65 70 75 80 Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly 85 90 95 Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys 100 105 110 Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu 115 120 125 Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala 130 135 140 Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160 Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr 165 170 175 Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp 180 185 190 Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr 195 200 205 Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240 Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala 245 250 255 Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys 260 265 270 Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro 275 280 285 Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe 290 295 300 Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320 Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala 325 330 335 Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr 340 345 350 Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365 Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu 385 390 395 400 Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu 405 410 415 Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val 420 425 430 Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp 435 440 445 <210> 50 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ATCC13869 hom <400> 50 Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu 20 25 30 Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile 35 40 45 Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala 65 70 75 80 Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly 85 90 95 Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys 100 105 110 Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu 115 120 125 Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala 130 135 140 Ala Val Ala Ala Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160 Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr 165 170 175 Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp 180 185 190 Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr 195 200 205 Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240 Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala 245 250 255 Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys 260 265 270 Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro 275 280 285 Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe 290 295 300 Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320 Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala 325 330 335 Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr 340 345 350 Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365 Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu 385 390 395 400 Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu 405 410 415 Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val 420 425 430 Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp 435 440 445

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제.
  2. 제1항에 있어서, 추가로 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 378번째 아미노산이 트립토판으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제.
  3. 제1항 내지 제2항에서 선택되는 어느 한 항의 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제2항에서 선택되는 어느 한 항의 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는, 코리네박테리움속 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움속 미생물
  6. 제5항에 있어서, 상기 호모세린 유래 L-아미노산은 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸호모세린 및 L-메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 코리네박테리움속 미생물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 L-알라닌을 생산하는 코리네박테리움속 미생물
  8. 제4항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 미생물.
  9. 제4항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 상기 배양된 미생물 또는 배양된 배지로부터 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 호모세린 유래 L-아미노산은 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린 및 L-메티오닌 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법.
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