TWI740150B

TWI740150B - 經修飾的高絲胺酸脫氫酶及使用該脫氫酶製造高絲胺酸及衍生自高絲胺酸之ｌ－胺基酸的方法

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Publication number: TWI740150B
Application number: TW108118247A
Authority: TW
Inventors: 金孝珍; 許蘭; 林相曹; 金賢雅; 金亨俊; 徐昌一; 李承彬; 李知宣
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2021-09-21
Also published as: BR112019020697A2; US11555213B2; HUE062601T2; ES2944588T3; AU2019279282A1; PH12020551031A1; CN110945121A; SG11202006718YA; BR112019020697B1; AR115415A1; CA3091741A1; AU2019279282B2; CN110945121B; RU2733426C1; US20210002682A1; CA3091741C; CN112143719B; EP3597738B1; WO2019231159A1; US11236374B2

Abstract

本揭示內容有關經修飾的高絲胺酸脫氫酶及使用該脫氫酶製造高絲胺酸及衍生自高絲胺酸之L-胺基酸的方法。

Description

經修飾的高絲胺酸脫氫酶及使用該脫氫酶製造高絲胺酸及衍生自高絲胺酸之L-胺基酸的方法

本揭示內容涉及經修飾的高絲胺酸脫氫酶。具體地，本揭示內容涉及具有多肽的經修飾的高絲胺酸脫氫酶，該多肽包括在具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代，其中進行胺基酸取代是用異白胺酸取代第285位的胺基酸；用麩醯胺酸取代第398位的胺基酸；或分別用異白胺酸及麩醯胺酸取代兩個位置的胺基酸。此外，本揭示內容涉及使用經修飾的高絲胺酸脫氫酶製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的方法、用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的組成物、增加製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸之能力的方法或經修飾的高絲胺酸脫氫酶的用途。

在L-胺基酸中，L-蘇胺酸、L-異白胺酸及L-甲硫胺酸通常是使用藉由高絲胺酸脫氫酶(以下簡稱為"Hom"；EC：1.1.1.3)從天冬胺酸鹽-半醛(以下簡稱為"ASA")製造的高絲胺酸。因此，為了經由醱酵法製造胺基酸，必須將生合成途徑中所用酶的活性維持在一定水準或更高水準，並對此進行深入的研究。

特別是，已知在L-離胺酸及L-蘇胺酸的生合成途徑的分支點作用的高絲胺酸脫氫酶的活性係由L-蘇胺酸及L-異白胺酸調節。近來，已經有幾個關於藉L-蘇胺酸的回饋抑制減敏之Hom及使用該方法製造L-蘇胺酸之方法的報告。1991年，德國Eikmann等人報告藉由以麩胺酸取代甘胺酸而減敏的Hom，該甘胺酸是Hom第378位的胺基酸殘基(Eikmanns BJ et al.,Appl.Microbial Biotechnol.34：617-622,1991)；並且在1991年，Archer等人報告，當Hom的C-端由於移碼突變而損壞時，發生減敏(Archer JA et al.,Gene 107：53-59,1991)。

本發明者等人針對藉由蘇胺酸回饋抑制的減敏作用而進行研究，結果發現單離出編碼經修飾的Hom的新穎基因，而其中該新穎基因經傳導的微生物生產L-胺基酸的能力經改良，從而完成本揭示內容。

本揭示內容的目的是提供具有多肽的經修飾的高絲胺酸脫氫酶，該多肽包括在具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代，其中進行胺基酸取代是用另一個胺基酸取代第 285位的胺基酸；用另一個胺基酸取代第398位的胺基酸；或者用其他胺基酸取代這兩個位置上的胺基酸。

本揭示內容的另一個目的是提供編碼經修飾的脫氫酶的多肽。

本揭示內容的又另一個目的是提供棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物，該微生物包括經修飾的高絲胺酸脫氫酶。

本揭示內容的又另一個目的是提供製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的方法，包括：在培養基中培養微生物；及從微生物或培養基中回收高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。

本揭示內容的又另一個目的是提供製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的組成物，其包括經修飾的高絲胺酸脫氫酶或包括本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶的微生物。

本揭示內容的又另一個目的是提供增加製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸之能力的方法，其包括在棒狀桿菌屬微生物中表現本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶。

本揭示內容的又另一個目的是提供經修飾的高絲胺酸脫氫酶的用途，其係用於製造本揭示內容的高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。

本揭示內容的又另一個目的是提供多肽的用途，其係用於製造本揭示內容的高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。

本揭示內容的又另一個目的是提供棒狀桿菌屬微生物的用途，其係用於生產本揭示內容的高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。

本揭示內容的又另一個目的是提供組成物的用途，其係用於製造本揭示內容的高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。

本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶可廣泛用於大量生產有效的高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸，因為相較於天然或野生型，最終產物的回饋抑制是減敏的。

以下將詳細說明本揭示內容。同時，本文揭露的各個解釋及示例性具體例都可以應用於其他解釋及示例性具體例。亦即，本文揭露的各種因素的所有組合都屬於本揭示內容的範疇。再者，本揭示內容的範圍不應受到以下所提供之特定揭露的限制。

為達到上述目的，本揭示內容的一態樣提供具有多肽的經修飾的高絲胺酸脫氫酶，該多肽包括在具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代，其中，是用另一個胺基酸取代第285位的胺基酸或第398位的胺基酸，或經由其組合而進行胺基酸取代。

具體地，本揭示內容提供具有多肽的高絲胺酸脫氫酶變異體，該多肽包括在具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代，其中進行胺基酸取代是用異白胺酸取代第285位的胺基酸；用麩醯胺酸取代第398位的胺基酸；或分別用異白胺酸及麩醯胺酸取代兩個位置的胺基酸。更具體地，本揭示內容提供經修飾的高絲胺酸脫氫酶，其中在SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第285位的胺基酸經異白胺酸取代；第398位的胺基酸經麩醯胺酸取代；或在這兩個位置的胺基酸分別經異白胺酸及麩醯胺酸取代。

在本揭示內容中，高絲胺酸脫氫酶(EC：1.1.1.3)是指催化高絲胺酸合成的酶，高絲胺酸是植物及微生物中合成甲硫胺酸、蘇胺酸及異白胺酸的常用中間體。在本揭示內容中，不論其來源為何只要具有上述轉化活性，都可以列入為高絲胺酸脫氫酶，可使用從任何有機體(植物、微生物等)衍生出的酶作高絲胺酸脫氫酶。具體地，高絲胺酸脫氫酶可衍生自棒狀桿菌屬微生物，更具體地，可衍生自麩胺酸棒狀桿菌。例如，高絲胺酸脫氫酶可以是包含SEQ ID NO：1胺基酸序列的蛋白質。含有SEQ ID NO：1胺基酸序列的蛋白質可與術語"具有SEQ ID NO：1胺基酸序列的蛋白質"或"由SEQ ID NO：1的胺基酸序列所組成的蛋白質"互換使用。

本揭示內容中，可使用發明所屬技術領域眾所周知的各種方法作為得到高絲胺酸脫氫酶的方法。這種方法的實例包含基因合成技術，該技術包含密碼子最佳化，以便在通常使用於蛋白質表現的棒狀桿菌屬微生物高效地獲得蛋白質，以及使用基於微生物環境基因體的生物資訊學而篩選有用酶資源的方法，但方法並不限於此。

在本揭示內容中，具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質不排除由於具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的胺基酸序列上游或下游的無意義的序列加成而可能發生的突變，如SEQ ID NO：1的胺基酸序列，或其中天然發生的突變，或靜默突變。此外，具有與包含SEQ ID NO：1 的胺基酸序列的蛋白質相同或相應活性的蛋白質對應於具有本揭示內容之高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質。作為具體的實施例，具有本揭示內容高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質可以是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列或是與其同源性至少為80%、90%、95%或97%的胺基酸序列所組成的蛋白質。

此外，雖然在本揭示內容中說明為"包含特定SEQ ID NO的胺基酸序列之蛋白質或多肽"，但明顯地，具有在部分序列中有刪除、修飾、取代或添加的胺基酸序列的任何蛋白質，只要該蛋白質具有與上述任何一個同源性的胺基酸序列，並且展現出與上述蛋白質相應的效果，也可以屬於本揭示內容的範疇。例如，在本揭示內容中，具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質可以是衍生自麩胺酸棒狀桿菌的高絲胺酸脫氫酶。更具體地，具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質可以是衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的高絲胺酸脫氫酶的胺基酸序列(SEQ ID NO：1)、衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC14067的高絲胺酸脫氫酶的胺基酸序列(SEQ ID NO：49)或衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869的高絲胺酸脫氫酶的胺基酸序列(SEQ ID NO：50)。因為具有上述序列的高絲胺酸脫氫酶彼此間顯示80%、90%、95%或97%或更高的同源性，而且由於該高絲胺酸脫氫酶展現與高絲胺酸脫氫酶相應的作用，所以明顯地它們包含在具有本揭示內容之高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質中。

如本文所使用，術語"同源性"是指兩個多核苷酸或多肽部分之間的同一性百分比。同源性是指與指定的胺基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，可以用百分比表示。在本揭示內容中，將具有與指定的胺基酸序列或核苷酸序列相同或相似的活性之同源序列表示為"%同源性"。可經由發明所屬技術領域已知的技術來確定從一個部分到另一個部分的序列間同源性。例如，可使用標準軟體，即，BLAST 2.0，來確認同源性，以計算參數諸如分數、同一性及相似性，或通過南方雜交實驗來比較序列，並可經由發明所屬技術領域熟練技術人員已知的方法確定擬界定的適當雜交條件(如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York)。

如本文所使用，術語"修飾(modification)"、"經修飾的(modified)"或"變異體"是指在穩定的表現型中顯現出可遺傳或不可遺傳交替的菌種或個體。具體地，術語"變異體"可意指其活性有效提高的變異體，而該活性的提高是因為相較於野生型、天然或非修飾型，與具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質相應的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸是經修飾的，或是其中經由異白胺酸、蘇胺酸或其衍生物的回饋抑制是經釋放的變異體，或是其中活性的提高及回饋抑制均經釋放的變異體。

在本揭示內容中，術語"經修飾的高絲胺酸脫氫酶"可與"高絲胺酸脫氫酶變異體"互換使用。另一方面，這種變異體可以是非天然發生的。

具體地，本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶可以是具有多肽的蛋白質，而該多肽包括在具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代，其中進行胺基酸取代的是用異白胺酸取代第285位的胺基酸、用麩醯胺酸取代第398位的胺基酸，或其組合。具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的胺基酸序列如以上所述，且可以是，例如，SEQ ID NO：1的胺基酸序列。此外，第285位的胺基酸可以是其中蘇胺酸是經異白胺酸取代的胺基酸，及第398位的胺基酸可以是其中精胺酸是經麩醯胺酸取代的胺基酸。

此外，本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶可以是具有多肽的經修飾蛋白質，該多肽包括在具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代，其中是用色胺酸取代第378位的胺基酸來進行胺基酸取代。此外，本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶可以是具有多肽的經修飾的蛋白質，該多肽包括在具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代，其中進行胺基酸取代是用異白胺酸取代第285位的胺基酸、用麩醯胺酸取代第398位的胺基酸，或其組合；在此經修飾的高絲胺酸脫氫酶中，第378位的胺基酸可進一步經色胺酸取代。更具體地，第378位的胺基酸可以是其中甘胺酸經色胺酸取代的胺基酸。

甚至更具體地，本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶是具有多肽的經修飾蛋白質，該多肽包括在SEQ ID NO：1的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代，其中進行胺基酸取代是用異白胺酸取代第285位的胺基酸、用麩醯胺酸取代第398位的胺基酸，或其組合。例如，本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶可以是包含SEQ ID NO：10、11、12或13胺基酸序列的蛋白質。此外，不排除其中由於胺基酸序列上游或下游無意義的序列加成而發生的突變、天然發生的突變或靜默突變。此外，具有與經修飾的高絲胺酸脫氫酶相同或相應活性的蛋白質相應於具有本揭示內容之高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質。作為具體實施例，本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶可以是由SEQ ID NO：10、11、12或13的胺基酸序列所組成的蛋白質，或是具有與上述胺基酸序列至少80%、90%、95%或97%同源性的蛋白質。此外，雖然在本揭示內容中說明為"具有特定SEQ ID NO的胺基酸序列之蛋白質或多肽"，但明顯地，具有在部分序列中有刪除、修飾、取代或添加的胺基酸序列的任何蛋白質，只要該蛋白質具有與上述任何一個同源性的胺基酸序列，並且展現出與上述蛋白質相應的效果，也可以屬於本揭示內容的範圍。

此外，本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶是具有多肽的經修飾的高絲胺酸脫氫酶，該多肽包括在具有高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代。明顯地，任何蛋白質，包含其中在第285或第398位的胺基酸經其他胺基酸取代的修飾，並且展現出與高絲胺酸脫氫酶相應的效果，該蛋白質屬於本揭示內容的範疇。

此外，與野生型或天然蛋白質或具有高絲胺酸脫氫酶活性的非經修飾蛋白不同，本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶可以是一種其中藉由最終產物，即，異白胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸或高絲胺酸或其衍生物或類似物的回饋抑制經釋放或減敏的蛋白質。如本文所使用，"回饋抑制"意指代謝的最終產物阻止較早階段的反應。因此，當高絲胺酸脫氫酶的回饋抑制經釋放或減敏時，高絲胺酸生產力及高絲胺酸衍生的L-胺基酸的生產力比回饋抑制不釋放或不減敏可為經改良。

高絲胺酸衍生的L-胺基酸是指可以L-高絲胺酸為前體而生合成的L-胺基酸，只要是可從L-高絲胺酸生合成的物質，就不受限制。高絲胺酸衍生的L-胺基酸不僅可包含高絲胺酸衍生的L-胺基酸，還可包含其衍生物。例如，高絲胺酸衍生的L-胺基酸可以是L-蘇胺酸、L-異白胺酸、O-乙醯基高絲胺酸、O-琥珀醯基-L-高絲胺酸、O-磷醯基-L-高絲胺酸、L-甲硫胺酸及/或L-甘胺酸，但不限於此。更具體地，高絲胺酸衍生的L-胺基酸可以是L-蘇胺酸、L-異白胺酸、O-乙醯基高絲胺酸、O-琥珀醯基-L-高絲胺酸及/或L-甲硫胺酸，但不限於此。

本揭示內容的另一態樣提供編碼經修飾的高絲胺酸脫氫酶的多肽。

高絲胺酸脫氫酶及變異體如以上所述。

如本文所使用，術語"多核苷酸"是由在鏈中共價結合的核苷酸單體所組成的核苷酸聚合物，其實例是具有預定或較長長度的DNA或RNA股，及更具體地，是指編碼經修飾的高絲胺酸脫氫酶的多核苷酸片段。編碼本揭示內容經修飾蛋白質的多核苷酸可以不受限制地包含在內，只要它具有編碼具有本揭示內容高絲胺酸脫氫酶活性的經修飾蛋白質的多核苷酸序列。

在本揭示內容中，編碼高絲胺酸脫氫酶變異體的胺基酸序列的多核苷酸具體地可以是從棒狀桿菌屬微生物中衍生出的，及更具體地是從麩胺酸棒狀桿菌中衍生出的，但並不限於此。

此外，在編碼蛋白質的多核苷酸中，由於密碼子簡併性或考慮到在要表現該蛋白質的有機體中較佳的密碼子，可在編碼區進行各種修飾而不改變蛋白質的胺基酸序列。具體地，多核苷酸可以是包含編碼蛋白質的多核苷酸序列，或是具有與上述多核苷酸序列至少80%、90%、95%或97%同源性的多核苷酸序列的多核苷酸。此外，明顯地，在部分序列中有刪除、修飾、取代或添加的多核苷酸序列，只要它是編碼具有上述同源性並且展現出基本上與上述蛋白質相同或相應效果的多核苷酸序列，也可以屬於本揭示內容的範圍。編碼具有本揭示內容高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的多核苷酸序列可具有編碼SEQ ID NO：1胺基酸序列的多核苷酸序列。例如，該多核苷酸可具有SEQ ID NO：48的多核苷酸序列，但不限於此。此外，編碼本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶的多核苷酸序列可具有編碼多肽的多核苷酸序列，而該多核苷酸序列包括在SEQ ID NO：1的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代，並且具體地可具有編碼SEQ ID NO：10、11、12或13的多核苷酸序列。例如，該多核苷酸可具有SEQ ID NO：6、7、8或9的多核苷酸序列，但不限於此。

此外，還可以不受限制地包含從已知基因序列製備的探針，該已知基因序列為，例如，在嚴格條件下與多核苷酸序列的全部或部分互補的序列雜交而編碼具有本揭示內容高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的任何序列。"嚴格條件"意指允許多核苷酸之間進行特定雜交的條件。這些條件在文獻中有具體說明(如，J.Sambrook et al.，下文)。嚴格的條件可包含，例如，在此條件下，基因具有高同源性，80%或更高的同源性，具體地90%或更高的同源性，更具體地95%或更高的同源性，再更具體地97%或更高的同源性，又再更具體地99%或更高的同源性是相互雜交的，而同源性低於上述同源性的基因不是相互雜交的，或者是南方雜交的一般洗滌條件，即，在鹽濃度及溫度相應於60℃、1×SSC、0.1%SDS的條件下，洗滌1次，具體地，洗滌2次或3次，具體地，60℃、0.1×SSC、0.1%SDS，及更具體地68℃、0.1×SSC、0.1%SDS。雜交要求兩個多核苷酸含有互補序列，但取決於雜交的嚴格性，鹼基之間的失配是可能的。術語"互補"是用來說明相互雜交的核苷酸鹼基之間的關係。例如，就DNA而言，腺苷與胸嘧啶互補，而胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本揭示內容還可以包含與整個序列以及與其基本上相似的核苷酸序列互補的經單離核苷酸片段。具體地，在上述條件下，可以使用包含Tm值55℃的雜交步驟在內的雜交條件來檢測具有同源性的多核苷酸。再者，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限於此，並可取決於其目的而由發明所屬技術領域熟練的技術人員適當地調控。雜交多核苷酸的適當嚴格程度取決於多核苷酸的長度及互補程度，而這些變數在發明所屬技術領域中是眾所周知的(見Sambrook et al.,同上,9.50-9.51,11.7-11.8)。

本揭示內容的又另一個態樣提供包括修飾的高絲胺酸脫氫酶的微生物。具體地，本揭示內容提供生產高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸、包括經修飾的高絲胺酸脫氫酶的棒狀桿菌屬微生物。此外，本揭示內容提供生產L-丙胺酸、包括經修飾的高絲胺酸脫氫酶的棒狀桿菌屬微生物。然而，本揭示內容並不限於此。

高絲胺酸脫氫酶及變異體如以上所述。

具體地，包括本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶的微生物是指天生具有生產高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸之能力的微生物，或是其缺乏生產高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸之能力的親代菌株經賦予生產高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸之能力的微生物。具體地，包括高絲胺酸脫氫酶的微生物可以是表現經修飾的高絲胺酸脫氫酶的微生物，其中在SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第285位的胺基酸經異白胺酸取代；第398位的胺基酸經麩醯胺酸取代；或在兩個位置的胺基酸分別經異白胺酸及麩醯胺酸取代，但該微生物並不限於此。該微生物可以是包含編碼經修飾的高絲胺酸脫氫酶的多核苷酸的細胞或微生物，或者藉由轉形入包含編碼經修飾的高絲胺酸脫氫酶的多核苷酸的載體而能夠表現經修飾的多肽的細胞或微生物。對於本揭示內容的目的，宿主細胞或微生物可以是包含經修飾的多肽而能夠生產高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的任何微生物。

相較於野生型微生物或包含具有經修飾的高絲胺酸脫氫酶活性的蛋白質的微生物，包括本揭示內容經修飾的高絲胺酸脫氫酶的微生物具有改良的高絲胺酸、高絲胺酸衍生的L-胺基酸或L-丙胺酸的生產能力。因此，可從該微生物以高產量地獲得高絲胺酸、高絲胺酸衍生的L-胺基酸或L-丙胺酸。

在本揭示內容中，包含經修飾的高絲胺酸脫氫酶的微生物類型並沒有特別限制，但可以是腸內桿菌屬(Enterobacter sp.)、大腸桿菌屬(Escherichia sp.)、伊文氏桿菌屬(Erwinia sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、普羅威登斯菌屬(Provindencia sp.)、棒狀桿菌屬或短桿菌屬(Brevibacterium sp.)。更具體地，該微生物可以是棒狀桿菌屬微生物。

在本揭示內容中，"棒狀桿菌屬微生物"可具體地是麩胺酸棒狀桿菌、產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳醱酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、熱產氨棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒狀桿菌(Corynebacterium efficiens)等，但並不限於此。更具體地，在本揭示內容中，棒狀桿菌屬微生物可以是麩胺酸棒狀桿菌。

同時，包括經修飾的高絲胺酸脫氫酶的微生物可以是其中經引入包含編碼高絲胺酸脫氫酶變異體的多核苷酸的載體的微生物，但不限於此。

如本文所使用，術語"載體"是指包含編碼目標蛋白質的多核苷酸的核苷酸序列的DNA建構體，其中該目標蛋白質可操作地連接到適當的調控序列，以便能夠在適當的宿主中表現。該調控序列包含能夠啟動轉錄的啟動子、用於調控轉錄的任何操縱子序列、編碼適當的mRNA核糖體結合域的序列及調控轉錄及轉譯終止的序列。載體與合適的宿主細胞轉形後，可不管宿主基因組，而被複製或發揮作用，或可以整合到宿主基因組本身中。

在本揭示內容中使用的載體並沒有特別限制，只要能夠在宿主細胞中複製，可以使用發明所屬技術領域中已知的任何載體。常用載體的實例可包含天然或重組質體、黏接質體、病毒及噬菌體。例如，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及Charon21A作為噬菌體載體或黏接質體載體；及可使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pPCL型及pET型作為質體載體。具體地，可使用pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118及pCC1BAC載體，但載體不限於此。

本揭示內容中可用的載體並沒有特別限制，可以使用任何已知的表現載體。此外，可經由用於染色體插入的載體而於染色體中插入編碼目標蛋白質的多核苷酸。可經由發明所屬技術領域已知的任何方法(如，同源重組)而將多核苷酸插入到染色體中，但方法並不限於此。可另外包含選擇標記以確認成功地將基因插入到染色體中。選擇標記係用於篩選經以載體轉形的細胞，換言之，用於確定目標多核苷酸分子是否插入。可使用提供可選擇表現型的標記諸如耐藥性、營養缺陷性、對細胞毒性藥物的抗藥性或表面蛋白質的表現。在選擇劑處理的環境中，只有表現選擇標記的細胞才能存活，或者細胞表現出不同的表現型，從而可經由該方法選擇成功轉形的細胞。

如本文所使用，術語"轉形"是指將包含編碼目標蛋白質的多核苷酸的載體引入到宿主細胞中，以便使多核苷酸編碼的蛋白質在宿主細胞中表現。只要轉形後的多核苷酸能在宿主細胞中表現，它就可以整合到宿主細胞的染色體中或置於宿主細胞的染色體中，或可以存在於染色體外。再者，多核苷酸包含編碼目標蛋白質的DNA及RNA。只要能將多核苷酸引入到宿主細胞並在宿主細胞中表現，就可以任何形式引入多核苷酸。例如，多核苷酸可以表現盒的形式引入到宿主細胞中，表現盒是一種基因建構，包含其自主表現所需的所有元素。該表現盒可包含可操作地連接到多核苷酸的啟動子、轉錄終止子、核糖體結合位點或轉譯終止子。表現盒可以是可自我複製的表現載體形式。此外，多核苷酸可以原樣引入到宿主細胞中，並可操作地連接到在宿主細胞中表現所需的序列，但不限於此。該轉形方法包含將多核苷酸引入到細胞的任何方法，並且可取決於宿主細胞而選擇發明所屬技術領域已知的合適標準技術來進行。該方法的實例包含電穿孔、磷酸鈣(Ca(H₂PO₄)₂、CaHPO₄或Ca₃(PO₄)₂)沉澱、氯化鈣(CaCl₂)沉澱、顯微注射、聚乙二醇(PEG)技術、DEAE-聚葡糖技術、陽離子脂質體技術、乙酸鋰-DMSO技術等，但不限於此。

此外，術語"可操作地連接"意指多核苷酸序列在功能性地連接到啟動子序列，啟動子序列啟動並介導編碼本揭示內容目標蛋白質的多核苷酸的轉錄。可以使用發明所屬技術領域已知的基因重組技術來製備該可操作的連接，並且可用已知的解離酶及連接酶來製備位點特異性的DNA裂解及連接，但這些並不限於此。

包括經修飾的高絲胺酸脫氫酶的微生物可以是已轉形成在棒狀桿菌屬微生物中包含經修飾的高絲胺酸脫氫酶的微生物。例如，棒狀桿菌屬微生物可包含對2-胺基-3-羥基-戊酸鹽(AHV)具有抗性的菌株；用離胺酸取代白胺酸而生產L-蘇胺酸的菌株，白胺酸為天冬胺酸激酶(LysC)第377位的胺基酸，以解決作用於蘇胺酸生合成途徑中的第一個重要酶LysC的回饋抑制；用丙胺酸取代ilvA基因第323位的胺基酸而生產L-異白胺酸的菌株(Appl.Enviro.Microbiol.,Dec.1996,p.4345-4351)，該ilvA基因編碼在生產L-蘇胺酸的菌株中的L-蘇胺酸脫氫酶(第一個作用於異白胺酸生合成途徑的酶)；藉由失活O-乙醯基高絲胺酸(硫醇)解離酶及胱硫醚γ-合成酶而生產O-乙醯基高絲胺酸的菌株，O-乙醯基高絲胺酸(硫醇)解離酶涉及O-乙醯基高絲胺酸的降解途徑；或藉由失活甲硫胺酸及半胱胺酸轉錄調節因子而生產甲硫胺酸的菌株，但不限於此。

本揭示內容的又另一個態樣提供製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的方法，包括：在培養基中培養微生物；從微生物或培養基中回收高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。

如以上所述，微生物可以是包括本揭示內容高絲胺酸脫氫酶變異體的棒狀桿菌屬微生物，更具體地，可以是麩胺酸棒狀桿菌。此外，棒狀桿菌屬或麩胺酸棒狀桿菌微生物可以是生產高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的微生物。高絲胺酸衍生的L-胺基酸不僅可包含高絲胺酸衍生的L-胺基酸，還可包含其衍生物。例如，高絲胺酸衍生的L-胺基酸可以是L-蘇胺酸、L-異白胺酸、O-乙醯基高絲胺酸、O-琥珀醯基-L-高絲胺酸、O-磷醯基-L-高絲胺酸、L-甲硫胺酸及/或L-甘胺酸，但不限於此。更具體地，高絲胺酸衍生的L-胺基酸可以是L-蘇胺酸、L-異白胺酸、O-乙醯基高絲胺酸、O-琥珀醯基-L-高絲胺酸及/或L-甲硫胺酸，但不限於此。此外，棒狀桿菌屬或麩胺酸棒狀桿菌微生物可以是生產L-丙胺酸的微生物。

高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸可以是由本揭示內容中說明的微生物所生產的高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的培養基、培養上清液、經處理產物或其純化形式。對發明所屬技術領域熟練的技術人員來說，明顯地，高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸不僅包含其中性形式，而且還包含其鹽。

發明所屬技術領域熟練的技術人員很容易地可在發明所屬技術領域已知的最佳化培養條件及酶活性條件下決定製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的方法。

在上述方法中，可以發明所屬技術領域已知的批次製程、連續製程、饋料批次製程等來進行微生物的培養，但培養製程並不特別限制於此。特別是，就培養條件而言，可將培養物的pH調至適當的pH值(如，pH 5至pH 9，具體地是pH 6至pH 8，最具體地是利用適當的鹼性化合物(如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水)或酸性化合物(如，磷酸或硫酸)，可將氧氣或含氧氣體混合物引入到培養物中來維持培養的有氧狀態。培養溫度一般為20℃至45℃，具體地是25℃至40℃，時間約為10至160小時，但培養條件不限於此。上述培養所產生的蘇胺酸、異白胺酸或乙醯高絲胺酸可以分泌到培養物中，或保留在細胞內。

此外，培養基中使用的碳源實例可包含糖類及碳水化合物(如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉及纖維素)；油類及脂肪類(如，大豆油、葵花籽油、花生油及椰子油)；脂肪酸類(如，棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸)；醇類(如，甘油及乙醇)；及有機酸類(如，乙酸)，但不限於此。這些碳源可單獨使用，也可組合使用，但不限於此。培養基中使用的氮源實例可包括含氮有機化合物(如，蛋白腖、酵母抽出物、肉汁、麥芽抽出物、玉米浸液、大豆粉及尿素)或無機化合物(如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨)等。這些氮源可單獨使用，也可組合使用，但不限於此。培養基中使用的磷源實例可包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、相應的含鈉鹽等，但不限於此。此外，培養基中可含有金屬鹽(如，硫酸鎂或硫酸鐵)、胺基酸、維生素等必需的生長促進物質。

在本揭示內容中，可使用發明所屬技術領域已知的合適方法，從培養液中收集目標產物而進行在培養步驟中生產的高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的回收方法。例如，可使用諸如離心、過濾、陰離子交換層析、結晶、HPLC等方法，而所需的物質，即高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸，可使用發明所屬技術領域已知的適當方法從培養物或培養的微生物中回收。再者，回收可包含額外的純化程序，並且可以使用發明所屬技術領域已知的適當方法來進行。可在培養步驟或回收步驟之前/之後插入額外的程序以增加目標產物的回收。

本揭示內容的又另一態樣提供用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的組成物，其包括本揭示內容之經修飾的高絲胺酸脫氫酶或包括經修飾的高絲胺酸脫氫酶的微生物。

用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的組成物是指能夠製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的組成物，其中該組成物包括經修飾的高絲胺酸脫氫酶，其中在SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第285位的胺基酸經異白胺酸取代，第398位的胺基酸經麩醯胺酸取代，或在這兩個位置的胺基酸分別經異白胺酸及麩醯胺酸取代；編碼經修飾的高絲胺酸脫氫酶的多核苷酸；或包括該多核苷酸的微生物。例如，該多核苷酸可包含能夠不受限制地操作所述多核苷酸的附加建構。例如，該多核苷酸可以是包含在載體中的形式，以便可操作地連接的基因可在經引入的宿主細胞中表現。

此外，組成物可進一步包含用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的組成物中一般所使用的任何合適賦形劑。賦形劑，例如，可為防腐劑、保濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、安定劑、等張劑等，但不限於此。

本揭示內容的又另一個態樣提供提高微生物中生產高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸之能力的方法，包括在具有高絲胺酸脫氫酶活性的SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，用異白胺酸取代第285位的胺基酸；用麩醯胺酸取代第398位的胺基酸；或分別用異白胺酸及麩醯胺酸取代兩個位置的胺基酸。

術語"高絲胺酸脫氫酶"及"高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸"如以上所述。

本揭示內容的又另一個態樣提供經修飾的高絲胺酸脫氫酶的用途，用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。

本揭示內容的又另一個態樣提供編碼經修飾的高絲胺酸脫氫酶的多核苷酸之用途，用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。

本揭示內容的又另一個態樣提供棒狀桿菌屬微生物的用途，該微生物包括經修飾的高絲胺酸脫氫酶，用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。

本揭示內容的又另一個態樣提供用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的組成物的用途，用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。

[實施例]

以下，將以附加的示例具體例詳細地說明本揭示內容。然而，本文所揭露的示例具體例僅用於說明之目的而不應解釋為限制本揭示內容的範疇。

實施例1：經由人工修飾篩選AHV-抗性微生物

在這實施例中，使用麩胺酸棒狀桿菌KFCC10881(Korean Patent No.0159812)作為親代菌株，進行給予對L-蘇胺酸類似物的2-胺基-3-羥基-戊酸鹽(下文稱為"AHV")產生抗性的實驗，以釋放高絲胺酸脫氫酶(下文稱為"Hom"，EC：1.1.1.3)的L-蘇胺酸回饋抑制。

藉由人工修飾方法使用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(下文稱為"NTG")引入修飾。將在種子培養基中培養18小時的KFCC10881菌株接種入4mL種子培養基中，培養至OD₆₆₀達到約1.0。將培養基離心而回收細胞，然後用50mM Tris-蘋果酸鹽緩衝液(pH 6.5)將細胞洗滌2次並懸浮在最終4mL的相同緩衝液中。將NTG溶液(2mg/mL的0.05M Tris-蘋果酸鹽緩衝液(pH 6.5)溶液)添加到細胞懸浮液中使具有150mg/L的最終濃度，然後於室溫靜置20分鐘。之後，離心而回收細胞，並用相同的緩衝液洗滌2次以去除NTG。將最後洗滌好的細胞懸浮在4mL的20%甘油溶液中，在使用前貯存於-70℃。將經NTG處理的菌株平板培養在含有3g/L之AHV的基本培養基，然後經由上述程序而得到155株抗AHV的KFCC10881菌株。

種子培養基(pH 7.0)

葡萄糖20g、蛋白腖10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH₂PO₄ 4g、K₂HPO₄ 8g、MgSO₄．7H₂O 0.5g、生物素100μg、鹽酸硫胺素1,000μg、泛酸鈣2,000μg、菸鹼醯胺2,000μg(基於1L蒸餾水)

基本培養基(pH 7.2)

葡萄糖5g、KH₂PO₄ 1g、(NH₄)₂SO₄ 5g、MgSO₄．7H₂O 0.4g、NaCl 0.5g、生物素200μg、鹽酸硫胺素100μg、泛酸鈣100μg、菸鹼醯胺0.03g、尿素2g、Na₂B₄O₇．10H₂O 0.09mg、(NH₄)₆Mo₇O₂₇．4H₂O 0.04mg、ZnSO₄．7H₂O 0.01mg、CuSO₄．5H₂O、MnCl₂．4H₂O 0.01mg、FeCl₃．6H₂O 1mg、CaCl₂ 0.01mg(基於1L蒸餾水)

實施例2：抗AHV的KFCC10881菌株的L-蘇胺酸生產試驗

對實施例1中得到的155株抗AHV菌株進行L-蘇胺酸生產能力試驗。將實施例1中得到的155菌株接種到含有種子培養基(25mL)的有角擋板的燒瓶(250mL)中，然後於30℃在200rpm振盪培養20小時。將種子培養基(1mL)接種到含有下列L-蘇胺酸生產培養基(24mL)的有角擋板的燒瓶(250mL)中，然後於30℃在200rpm振盪培養48小時。

L-蘇胺酸生產培養基(pH 7.2)

葡萄糖30g、KH₂PO₄ 2g、尿素3g、(NH₄)₂SO₄ 40g、蛋白腖2.5g、CSL(Sigma)5g(10mL)、MgSO₄．7H₂O 0.5g、白胺酸400mg、CaCO₃ 20g(基於1L蒸餾水)

培養完成後，用HPLC測量各種胺基酸的生產量。表1顯示22菌株在培養基中的胺基酸濃度，該22菌株在經試驗的155菌株中顯現優異的L-蘇胺酸生產力。將經由上述程序而確認的候選22菌株命名為KFCC10881-1至KFCC10881-22。

如表1所示，具有AHV抗性的22類型菌株所生產的L-蘇胺酸、L-高絲胺酸、L-甘胺酸、L-丙胺酸及L-異白胺酸的量，比對照組增加，然而L-離胺酸的量是降低的。

L-蘇胺酸及L-離胺酸的生合成途徑以天冬胺酸鹽-半醛(以下稱為"ASA")作為起始點而分開。即，隨著L-蘇胺酸產量的增加，L-離胺酸的產量會減少。據此，可以是L-蘇胺酸生合成途徑中副產物的高絲胺酸(Hse)、L-甘胺酸(Gly)及L-異白胺酸(Ile)量，可隨著L-蘇胺酸產量的提高而增加，如此也確認其生產總量(Thr+Hse+Gly+Ile)。

因此，在上述抗AHV菌株中，4類型的菌株(KFCC10881-1、KFCC10881-14、KFCC10881-19及KFCC10881-22)，具有降低的L-離胺酸產量、增加的L-蘇胺酸產量及增加的Thr+Hse+Gly+Ile生產總量，被選擇為最優異的抗AHV菌株。

實施例3：衍生自KFCC10881且具有優異蘇胺酸生產能力之菌株的核苷酸序列分析

進行下列的實驗以分析上述實施例1中選出的菌株之L-蘇胺酸生合成酶的核苷酸序列。根據京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)所提供的基因資訊，而得到各個編碼麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的高絲胺酸脫氫酶的hom(SEQ ID NO：1，NCgl1136)的核苷酸序列，及編碼高絲胺酸激酶的thrB(SEQ ID NO：2，基因編號NCg11137)的核苷酸序列。已知hom及thrB由操縱子結構所組成(Peoples et al.,Mol.Biol.2(1)：63-72,1988)。

為了得到含有所選出菌株的hom-thrB操縱子的DNA片段，使用該等菌株基因組DNA作為模板及SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4的引子組合而進行PCR。使用PfuUltra ^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作為PCR反應用聚合酶。PCR條件如下：於96℃變性30秒；於52℃黏合30秒；及於72℃聚合3分鐘，共重複30個循環。結果，可以擴增基因片段(2778bp；SEQ ID NO：5)，其包含含有SEQ ID NO：1的起始密碼子上游的啟動子位點的核苷酸序列(300bp)以包含SEQ ID NO：2的終止密碼子下游200bp。

使用上述製備的引子，經由ABI PRISM 3730XL分析儀(96毛細管型；Applied Biosystems)來測定核苷酸序列。在KFCC10881-1中對應於hom-thrB操縱子中hom的核苷酸序列中，SEQ ID NO：1第854位核苷酸的胞嘧啶經突變為硫胺素，而因此編碼蘇胺酸殘基的ACT 密碼子經突變為編碼異白胺酸殘基的ATT密碼子(下文稱為"T285I修飾"；SEQ ID NO：6)。此外，在KFCC10881-14中對應於hom-thrB操縱子的核苷酸序列中，SEQ ID NO：1第1193位核苷酸的鳥嘌呤經突變為腺嘌呤，而因此編碼精胺酸殘基的CGA密碼子經突變為編碼麩醯胺酸殘基的CAA密碼子(下文稱為"R398Q修飾"；SEQ ID NO：7)。此外，在KFCC10881-19中對應於hom-thrB操縱子的核苷酸序列中，SEQ ID NO：1第1132位核苷酸的鳥嘌呤經突變為胞嘧啶，因此編碼甘胺酸殘基的GGG密碼子經突變為編碼色胺酸殘基的TGG密碼子(下文稱為"G378W修飾"；SEQ ID NO：8)。此外，在KFCC10881-22中對應於hom-thrB操縱子的核苷酸序列中，SEQ ID NO：1第1132位核苷酸的鳥嘌呤經突變為腺嘌呤，及第1134位核苷酸的鳥嘌呤經突變為胞嘧啶，因此編碼甘胺酸殘基的GGG密碼子經突變為編碼絲胺酸殘基的AGC密碼子(下文稱為"G378S修飾"；SEQ ID NO：9)。同時，在thrB中未發現修飾，對應於SEQ ID NO：2。

鑑於上述核苷酸序列分析，有可能因此確認L-蘇胺酸的回饋抑制的減敏是因為在KFCC10881-1中表現的Hom(SEQ ID NO：10)中，第285位胺基酸殘基的蘇胺酸經突變為異白胺酸(T285I修飾)；在KFCC10881-14中表現的Hom(SEQ ID NO：11)中，第398位胺基酸殘基的精胺酸經突變為麩醯胺酸(R398Q修飾)；在KFCC10881-19中表現的Hom(SEQ ID NO：12)中，第378位胺基酸殘基的甘胺酸經突變為色胺酸(G378W修飾)；及在KFCC10881-22中表現的Hom(SEQ ID NO：13)中，第378位胺基酸殘基的甘胺酸經突變為絲胺酸(G378S修飾)。

實施例4：製備於其中引入高絲胺酸脫氫酶的新穎菌株

製備SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15引子以製備其中將實施例2中鑑定的變異體(T285I、R398Q、G378W及G378S)引入到野生型菌株中的菌株。

為了製備引入各個T285I、R398Q、G378W及G378S hom修飾的菌株，使用提取自KFCC10811-1、KFCC10811-14、KFCC10811-19及KFCC10811-22各菌株的基因組DNA作為模板及使用SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15的引子而進行PCR。使用PfuUltra ^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作為PCR反應用聚合酶。PCR條件如下：於95℃變性30秒；於55℃黏合30秒；及於72℃聚合2分鐘，共重複28個循環。結果，得到包含hom基因(1338bp)之啟動子位點(約300bp)的基因片段(1668bp)。使用PCR純化試劑盒(QUIAGEN)純化經擴增的產物，然後使用作為製備載體用的插入DNA片段。同時，在用限制酶smaI處理後，將在65℃熱處理20分鐘的pDZ載體與經由上述PCR擴增的插入DNA片段的莫耳濃度(M)比設定為1：2，然後使用Infusion Cloning試劑盒(TaKaRa)並根據其手冊而進行選殖。據此，而製備用於在染色體引入T285I、R398Q、G378W及G378S修飾的載體，即，pDZ-T285I、pDZ-R398Q、pDZ-G378W及pDZ-G378S。

經由電穿孔用各個製備的載體轉形麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032。在二次互換之後，得到在染色體上用各個修飾的核苷酸取代的菌株。經由使用以下所列引子及使用MASA(突變體等位基因特異性擴增)PCR技術的組合(Takeda et al.,Hum.Mutation,2,112-117(1993))，主要經由在對應於各個經修飾序列的引子組合中(CTR-T285I：SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17；CTR-R398Q：SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：18；CTR-G378W：SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：19；及CTR-G378S：SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：20)選擇擴增的菌株而確定取代的適當性。此外，經由使用SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：21並且以與實施例2中相同的方式分析經修飾的序列，而進行所選菌株的hom序列的分析以再次確認取代的適當性。用各個經修飾的核苷酸取代的菌株分別命名為CTR-T285I、CTR-R398Q、CTR-G378W及CTR-G378S。

實施例5：測量高絲胺酸脫氫酶的活性

測量所製備菌株中酶Hom的活性。將對照組中的野生型菌株ATCC13032及實施例4中製備的CTR-T285I、CTR-R398Q、CTR-G378W及CTR-G378S接種到25mL種子培養基中，然後培養直至達到對數生長後期。經由離心而回收細胞，用0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 7.6)洗滌兩次，最後懸浮於2mL含有30%濃度甘油的相同緩衝液中。經由常規玻璃珠渦旋方法將細胞懸浮液物理性地破碎10分鐘，然後通過兩次離心(13,000rpm，4℃，30分鐘)而回收上清液並用作為測量Hom酶活性的粗萃取物。於測量Hom的活性，將輔酶溶液(0.1mL)添加到測量酶活性用的反應溶液中(磷酸鉀(pH 7.0)緩衝液，25mM NADPH，5mM天冬胺酸鹽-半醛)，然後在30℃反應。Hom活性U定義為根據L-蘇胺酸(0mM、10mM)的存在，每分鐘消耗的NADPHμmol數量，下列表2中顯示酶活性的結果。

實驗結果，確認在含有各T285I、R398Q、G378W及G378S修飾的Hom中，在含有10mM L-蘇胺酸的條件下，活性的抑制降低，而與野生型Hom不同，因此發生對L-蘇胺酸的減敏。

實施例6：製備並評估具有L-蘇胺酸生產力的棒狀桿菌屬微生物菌株

生產L-蘇胺酸的菌株是從野生型麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032開發的。具體地，為了解決天冬胺酸激酶(LysC)的回饋抑制，LysC是蘇胺酸生合成途徑中首先作用的重要酶，而用離胺酸(SEQ ID NO：22)取代LysC第377位胺基酸的白胺酸。

更具體地，為了製備於其中引入LysC(L377K)修飾的菌株，使用ATCC13032的染色體作為模板並使用SEQ ID NO：23及24或SEQ ID NO：25及26的引子進行PCR。使用PfuUltra ^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作為PCR反應用聚合酶。PCR條件如下：於95℃變性30秒；於55℃黏合30秒；及於72℃聚合1分鐘，共重複28個循環。結果，以lysC基因的修飾位點為中心，分別得到5'上游區的DNA片段(515bp)及3'下游區的DNA片段(538bp)。使用SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：26的引子，用兩個擴增的DNA片段作為模板進行PCR。於95℃變性5分鐘後，在下列條件下進行PCR共28個循環：於95℃變性30秒；於55℃黏合30秒；及於72℃聚合2分鐘。之後，於72℃進行5分鐘聚合反應。結果，擴增了包含lysC基因修飾的DNA片段(1023bp)，該lysC基因編碼其中第377位的白胺酸經離胺酸取代的天冬胺酸激酶變異體。使用PCR純化試劑盒(QUIAGEN)純化經擴增的產物，並使用作為製備載體用的插入DNA片段。同時，在用限制酶smaI處理後，將在65℃熱處理20分鐘的pDZ載體與經由上述PCR擴增的插入DNA片段的莫耳濃度(M)比設定為1：2，然後使用Infusion Cloning試劑盒(TaKaRa)並根據其手冊而進行選殖。據此，製備用於在染色體上引入L377K修飾的pDZ-L377K載體。

經由電穿孔用所製備的載體轉形ATCC13032。在二次互換之後，得到其中各個核苷酸修飾被經修飾的核苷酸取代的菌株，並將該菌株命名為CJP1。

為了明確地確認菌株的L-蘇胺酸生產變化，將實施例4中鑑定的各個修飾引入到編碼高絲胺酸脫氫酶的基因中。具體地，為了將各T285I、R398Q、G378W及G378S修飾引入到CTR-L377K菌株中，經由電穿孔用實施例4製備的pDZ-T285I、pDZ-R398Q、pDZ-G378W及pDZ-G378S載體各自轉形CJP1，然後經由二次互換以與實施例4中相同的方式得到其中各個核苷酸修飾被染色體上經修飾的核苷酸取代的菌株。將用各個經修飾的核苷酸所取代的菌株命名為CJP1-T285I、CJP1-R398Q、CJP1-G378W及CJP1-G378S。

CJP1-T285I及CJP1-R398Q菌株於2017年9月26日寄存於韓國微生物菌種中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)，該中心是根據布達佩斯條約的國際寄存機構，登錄號分別為KCCM12119P及KCCM12120P。

結果，在引入各修飾的菌株中，相較於CJP1菌株，L-離胺酸的產量減少，而L-蘇胺酸的產量增加0.7g/L至0.9g/L。

在此期間，為了得到同時包含T285I及R398Q修飾的菌株，而用pDZ-R398Q載體轉形CJP1-T285I菌株，然後經由如上述的相同方法得到菌株(CJP1-T285I，R398Q)。此外，為了得到同時包含G378W及R398Q修飾的菌株，用pDZ-R398Q載體轉形CJP1-G378W菌株，然後經由如上述的相同方法得到菌株(CJP1-G378W，R398Q)。此外，為了得到同時包含T285I及G378W修飾的菌株，用pDZ-G378W載體轉形CJP1-T285I菌株，然後經由如上述的相同方法得到菌株(CJP1-T285I，G378W)。經由實施例2中說明的方法進行L-蘇胺酸生產能力的試驗，以下表4顯示其結果。

結果，相較於實施例中顯示出最高蘇胺酸生產能力的CJP1-G378W菌株，引入本揭示內容兩種類型的修飾時，確認蘇胺酸生產能力更高。在引入兩種修飾的菌株中，相較於作為對照組的CJP1菌株，蘇胺酸的產量增加1.1g/L至1.7g/L，因此，確認Hom的減敏效果大大提高。

實施例7：製備並評估生產L-異白胺酸的棒狀桿菌屬微生物菌株

為了製造生產異白胺酸的菌株，製備載體以加強經修飾的ilvA(V323A)基因的表現(Appl.Enviro.Microbiol，Dec.1996，p.4345-4351)，該基因編碼在實施例6中製備的菌株中的已知L-蘇胺酸脫水酶(異白胺酸生合成途徑中的第一個酶)。

具體地，為了製備用於引入靶向ilvA基因的修飾之載體，以修飾位點為中心而作出用於擴增5'上游區的一對引子(SEQ ID NO：27及28)及用於擴增3'下游區的一對引子(SEQ ID NO：29及30)。將BamHI限制酶位點(下劃線)插到SEQ ID NO：27及30引子的各末端，並設計SEQ ID NO：28及29引子，使得核苷酸取代的修飾(下底線)位於要引發交叉的區域。

用野生型的染色體作為模板並使用SEQ ID NO：27、28、29及30的引子進行PCR。於95℃變性5分鐘後，在下列條件下進行PCR共30個循環：於95℃變性30秒；於55℃黏合30秒；及於72℃聚合30秒。之後，於72℃進行7分鐘聚合反應。結果，以ilvA基因的修飾位點為中心，得到5'上游區的DNA片段(627bp)及3'下游區的DNA片段(608bp)。

用兩個擴增的DNA片段作為模板並使用SEQ ID NO：27及30的引子而進行PCR。於95℃變性5分鐘後，在下列條件下進行 PCR共30個循環：於95℃變性30秒；於55℃黏合30秒；及於72℃聚合60秒。之後，於72℃進行7分鐘聚合反應。結果，擴增了DNA片段(1217bp)，包含編碼IlvA變異體的ilvA基因的修飾，其中第323位的纈胺酸經丙胺酸取代。用限制酶BamHI處理pECCG117載體(Korean Patent No.10-0057684)及DNA片段(1011bp)，使用DNA連接酶連接，然後選殖而得到質體。將所得到的質體命名為pECCG117-ilvA(V323A)。

經由電穿孔而將pECCG117-ilvA(V323A)載體引入到實施例6中製備的各CJP1-T285I,R398Q、CJP1-G378W,R398Q及CJP1-T285I,G378W菌株中，並塗抹在含有卡那黴素(kanamycin)(25mg/L)的選擇性培養基以得到轉形菌株。經由與實施例2相同的搖瓶培養方法培養所得到的轉形菌株，並分析培養基中的L-異白胺酸濃度。表6顯示其結果。

結果確認，相較於對照組，包含hom(G378W)修飾的菌株之L-異白胺酸濃度提高0.2g/L。此外，相較於對照菌株，含有其中經同時引入兩種修飾的hom修飾的菌株，其L-異白胺酸生產能力則進一步提高0.3g/L至0.5g/L。再者，在所製備的菌株中，包含T285I及R398Q兩種修飾的CJP1-T285I,R398Q/pECCG117-ilvA(V323A)菌株生產1.1g/L的L-異白胺酸。

實施例8：製備及評估用經修飾的Hom取代的O-乙醯基-高絲胺酸(OAH)生產菌株

8-1.製備用經修飾的Hom取代的ATCC13032菌株

以如實施例7的相同方式將兩種類型的修飾(T285I及R398Q)引入到ATCC13032菌株中，並將所製備的菌株命名為ATCC13032：：Hom^FBR。

8-2.metB基因的刪除

在這實施例中，使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體DNA作為模板，經由PCR而得到編碼O-乙醯基-高絲胺酸降解途徑中的胱硫醚γ-合成酶的metB基因。基於美國國家衛生研究院的GenBank(NIH GenBank)，得到metB的核苷酸序列資訊(NCBI登記號Ncgl2360；SEQ ID NO：31)。此外，基於此而合成含有metB基因的N-端及連接子序列的引子(SEQ ID NO：32及33)及含有metB基因的C-端及連接子序列的引子(SEQ ID NO：34及35)。使用SEQ ID NO：32及33以及 SEQ ID NO：34及35的核苷酸序列的寡核苷酸作為引子，以麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體DNA作為模板而進行PCR。使用PfuUltra ^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作為聚合酶。PCR條件如下：於96℃變性30秒；於53℃黏合30秒；及於72℃聚合1分鐘，共重複30個循環。結果，得到含有metB基因的N-端及連接子的擴增基因(500bp)及含有metB基因的C-端及連接子的擴增基因(500bp)。

使用如此得到的兩個擴增基因作為模板，在下列條件下進行PCR共10個循環：於96℃變性60秒；於50℃黏合60秒；及於72℃聚合1分鐘。之後，於此添加SEQ ID NO：32及35的核苷酸序列，然後重複共20個循環。結果，得到擴增的ΔmetB基因(1000bp)，其為含有metB基因之N-端-連接子-C-端的metB失活盒(inactivation cassette)。用包含在末端的限制酶XbaI及SalI處理通過PCR而得到的metB基因，然後經由連接而選殖到經限制酶XbaI及SalI處理的pDZ(KR 0924065)載體中。之後，製備最終選殖metB失活盒的重組pDZ-ΔmetB載體。

用所製備的pDZ-ΔmetB載體轉形麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032及ATCC13032：：Hom^FBR。在二次互換後，得到其中metB基因在染色體上失活的麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032ΔmetB及ATCC13032：：Hom^FBR ΔmetB。最後經由使用SEQ ID NO：32及25的引子進行PCR而確認失活的metB基因，然後與其中metB基因未失活的ATCC13032進行比較。

8-3.metY基因的刪除

在這實施例中，使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體DNA作為模板，經由PCR而得到編碼O-乙醯基-高絲胺酸降解途徑中的O-乙醯基高絲胺酸(硫醇)解離酶的metY基因。基於美國國家衛生研究院的GenBank(NIH GenBank)，得到metY的核苷酸序列資訊(NCBI登記號Ncgl0625；SEQ ID NO：36)。此外，基於此而合成含有metY基因的N-端及連接子序列的引子(SEQ ID NO：37及38)及含有metY基因的C-端及連接子序列的引子(SEQ ID NO：39及40)。

使用SEQ ID NO：39及40的核苷酸序列的寡核苷酸作為引子，以麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體DNA作為模板進行PCR。使用PfuUltra ^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作為聚合酶。PCR條件如下：於96℃變性30秒；於53℃黏合30秒；及於72℃聚合1分鐘，共重複30個循環。結果，得到含有metY基因的N-端及連接子的擴增基因(500bp)及含有metY基因的C-端及連接子的擴增基因(500bp)。使用如此得到的兩個擴增基因作為模板，在下列條件下進行PCR共10個循環：於96℃變性60秒；於50℃黏合60秒；及於72℃聚合1分鐘。之後，於此添加SEQ ID NO：37及40的核苷酸序列，然後重複共20個循環。結果，得到擴增的ΔmetY基因(1000bp)，其為含有metY基因之N-端-連接子-C-端的metY失活盒。

用包含在末端的限制酶XbaI及SalI處理經由PCR而得到的metY基因，然後經由連接而選殖到經限制酶XbaI及SalI處理的pDZ(KR2008-0025355)載體中。之後，製備最終選殖metY失活盒的重組pDZ-ΔmetY載體。

用所製備的pDZ-ΔmetY載體轉形麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032、ATCC13032：：Hom^FBR、ATCC13032 ΔmetB及ATCC13032：：Hom^FBR ΔmetB菌株。在二次互換後，得到其中metY基因在染色體失活的麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032ΔmetY、ATCC13032：：Hom^FBR ΔmetY、ATCC13032 ΔmetB ΔmetY及ATCC13032：：Hom^FBR ΔmetB ΔmetY。最後經由使用SEQ ID NO：37及40的引子進行PCR而確認失活的metY基因，然後與其中metY基因未失活的ATCC13032進行比較。

8-4.製備及評估O-乙醯基-高絲胺酸的生產菌株

進行實施例8-1至8-3中製備的其中metB、metY、metBY基因被刪除及經修飾的hom基因被取代的ATCC13032、ATCC13032 ΔmetB、ATCC13032 ΔmetY、ATCC13032 ΔmetB ΔmetY、ATCC13032：：Hom^FBR、ATCC13032：：Hom^FBR ΔmetB、ATCC13032：：Hom^FBR ΔmetY及ATCC13032：：Hom^FBR ΔmetB ΔmetY菌株間O-乙醯基-高絲胺酸生產能力的比較。

具體地，將單一菌落在LB固體培養基中於32℃培養箱中培養過夜，並將1接種環量的各單一菌落接種在O-乙醯基-高絲胺酸效價培養基(25mL)中，然後在32℃、250rpm下培養42至64小時。經由HPLC分析來自各個培養產物的O-乙醯基-高絲胺酸，以下表7顯示其結果。

L-O-乙醯基高絲胺酸生產培養基(pH 7.2)

葡萄糖30g、KH₂PO₄ 2g、尿素3g、(NH₄)₂SO₄ 40g、蛋白腖2.5g、CSL(Sigma)5g(10mL)、MgSO₄．7H₂O 0.5g、甲硫胺酸400mg、白胺酸400mg、CaCO₃ 20g(基於1L蒸餾水)

結果，如以上表7所示，培養對照組菌株麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032時，O-乙醯基-高絲胺酸未累積；然而在其中metB、metY、metBY基因失活的ATCC13032 ΔmetB、ATCC13032 ΔmetY及ATCC13032 ΔmetB ΔmetY菌株中，則分別累積0.3g/L、0.3g/L及0.5g/L的O-乙醯基-高絲胺酸。

此外，對於其中以突變體形式取代hom基因的ATCC13032：：Hom^FBR菌株，及其中metB、metY及metBY基因分別經失活的ATCC13032：：Hom^FBR ΔmetB、ATCC13032：：Hom^FBR ΔmetY及ATCC13032：：Hom^FBR ΔmetBΔmetY菌株的情況，確認這些菌株的O-乙醯基-高絲胺酸累積量各自為1.2g/L、1.4g/L及3.5g/L。

因此，從上述結果可以確認，經由使用本揭示內容的經修飾hom可以大大提高利用高絲胺酸作為前體的目標胺基酸產量。

實施例9：製備及評估甲硫胺酸(Met)的生產菌株

實施例9-1：製備用於刪除mcbR基因的重組載體

在這實施例中，為了製備生產甲硫胺酸的菌株，而製備用於失活mcbR基因的載體(J.Biotechnol.103：51-65,2003)，該mcbR基因編碼實施例6中製備的菌株中已知的甲硫胺酸及半胱胺酸轉錄調節蛋白。

具體地，使用以下方法製備重組質體載體，以剔除棒狀桿菌ATCC13032染色體的mcbR基因。基於美國國家衛生研究院的Genbank(NIH GenBank)中報導的核苷酸序列，而得到麩胺酸棒狀桿菌的mcbR基因及其周圍序列(SEQ ID NO：41)。

為了得到mcbR-刪除基因的目的，用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體DNA作為模板並使用SEQ ID NO：42及43及SEQ ID NO：44及45的引子進行PCR。於95℃變性5分鐘後，在下列條件下進行PCR共30個循環：於95℃變性30秒；於53℃黏合30秒；及於72℃聚合30秒。結果，得到DNA片段(700bp)。

將不能在麩胺酸棒狀桿菌中選殖的pDZ載體(韓國專利No.10-0924065)，以及擴增的mcbR基因片段用限制酶smaI處理而用於染色體引入。之後，用DNA連接酶連接，然後用大腸桿菌DH5α轉形，隨後塗抹在含有卡那黴素(25mg/L)的LB固體培養基。選出用載體轉形的菌落，其中經由PCR而插入刪除的目標基因片段，並使用質體提取方法而得到質體。將所得到的質體命名為pDZ-ΔmcbR。

實施例9-2：製備及評估生產L-甲硫胺酸的棒狀桿菌屬微生物菌株

將實施例6中經由染色體的同源重組而製備的各CJP1-G378W、CJP1-T285I,R398Q、CJP1-G378W,R398Q、CJP1-T285I,G378W及CJP1菌株，使用電穿孔用實施例9中製備的pDZ-ΔmcbR載體轉形(van der Rest et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.52：541-545,1999)。之後，在含有X-gal的固體培養基進行二次重組。使用SEQ ID NO：46及47的引子，用其中已完成二次重組的經轉形麩胺酸棒狀桿菌菌株，經由PCR方法來確認其中mcbR基因經刪除的菌株。將這些重組菌株分別命名為麩胺酸棒狀桿菌CJP1-G378W/ΔmcbR、CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR、CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR、CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR及CJP1/ΔmcbR。

為了分析所製備的CJP1-G378W/ΔmcbR、CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR、CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR及CJP1- T285I,G378W/ΔmcbR菌株的L-甲硫胺酸的生產能力，將該等菌株與其親代菌株麩胺酸棒狀桿菌CJP1/ΔmcbR一起以下列方式培養。

將麩胺酸棒狀桿菌CJP1/ΔmcbR及本發明的菌株(麩胺酸棒狀桿菌CJP1-G378W/ΔmcbR、CJP1-T285I，R398Q/ΔmcbR、CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR及CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR)接種到含有下述種子培養基(25mL)的有角擋板的燒瓶(250mL)中，然後在30℃，200rpm振盪培養20小時。之後，將種子培養基(1mL)接種到含有下述生產培養基(24mL)的有角擋板的燒瓶(250mL)中，然後在30℃，200rpm振盪培養48小時。種子培養基及生產培養基的組成如下。

<種子培養基(pH 7.0)>

<生產培養基(pH 8.0)>

葡萄糖50g、(NH₄)₂S₂O₃ 12g、酵母抽出物5g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄．7H₂O 1.2g、生物素100μg、鹽酸硫胺素1,000μg、泛酸鈣2,000μg、菸鹼醯胺3000μg、CaCO₃ 30g(基於1L蒸餾水)

使用上述的培養方法進行培養後，分析各培養基中L-甲硫胺酸的濃度，表8顯示其結果。

結果證實，在包含G378W hom修飾的菌株中，相較於對照菌株，L-甲硫胺酸的生產能力提高0.12g/L。此外，證實在包含其中同時引入兩種修飾的hom修飾的菌株中，相較於對照菌株，L-甲硫胺酸的生產能力提高0.16g/L至0.19g/L。

基於以上結果，確認L-甲硫胺酸產量可經由使用本揭示內容之經修飾的hom而大大地提高。

雖然已經參考特定的說明性具體例而說明本揭示內容，但是本揭示內容發明所屬技術領域熟練的技術人員將理解，本揭示內容可以以其他特定形式體現而不脫離本發明的技術精神或主要特徵。因此，上述具體例在所有態樣都被認為是說明性的而非限制性的。再者，本揭示內容的範圍由所附申請專利範圍而不是詳細說明所定義，並且應當理解，從本揭示內容的含義及範圍及其等同物所衍生出的所有修改或變化都包含在所附申請專利範圍的範圍內。

【生物材料寄存】

寄存機構：韓國微生物保存中心(國際寄存機構)

寄存編號：KCCM12119P

寄存日期：2017年9月26日

寄存機構：韓國微生物保存中心(國際寄存機構)

寄存編號：KCCM12120P

寄存日期：2017年9月26日

<110> CJ第一製糖股份有限公司

<120> 經修飾的高絲胺酸脫氫酶及使用該脫氫酶製造高絲胺酸及衍生自高絲胺酸之L-胺基酸的方法

<130> OPA18570

<150> KR 10-2018-0060445

<151> 2018-05-28

<160> 50

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 高絲胺酸脫氫酶

<400> 1

<210> 2

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> thrB基因

<400> 2

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

<210> 5

<211> 2778

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因片段

<400> 5

<210> 6

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T285I

<400> 6

<210> 7

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R398Q

<400> 7

<210> 8

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G378W

<400> 8

<210> 9

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G378S

<400> 9

<210> 10

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hom(KFCC10881-1)

<400> 10

<210> 11

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hom(KFCC10881-14)

<400> 11

<210> 12

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hom(KFCC10881-19)

<400> 12

<210> 13

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hom(KFCC10881-22)

<400> 13

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 14

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 15

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 16

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 17

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 20

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 21

<210> 22

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> lysC(L377K)

<400> 22

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 23

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 24

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 25

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 26

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 27

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 28

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 29

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 30

<210> 31

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> metB基因

<400> 31

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 32

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 33

<210> 34

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 34

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 35

<210> 36

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> metY基因

<400> 36

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 37

<210> 38

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 38

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 39

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 40

<210> 41

<211> 2213

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mcbR基因

<400> 41

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 42

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 43

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 44

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 45

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 46

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 47

<210> 48

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 野生型hom基因

<400> 48

<210> 49

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ATCC14067 hom(NCgl1136)

<400> 49

<210> 50

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ATCC13869 hom

<400> 50

Claims

一種經修飾的高絲胺酸脫氫酶，其中在SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第285位的胺基酸經異白胺酸取代；第398位的胺基酸經麩醯胺酸取代；或在這兩個位置的胺基酸分別經異白胺酸及麩醯胺酸取代。
如申請專利範圍第1項所述之經修飾的高絲胺酸脫氫酶，其中在該SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第378位的胺基酸進一步經色胺酸取代。
一種多核苷酸，編碼選自如申請專利範圍第1及2項中任一項所述之經修飾的高絲胺酸脫氫酶。
一種棒狀桿菌屬微生物，包括選自如申請專利範圍第1和2項所述之經修飾的高絲胺酸脫氫酶。
如申請專利範圍第4項所述之微生物，其中該棒狀桿菌屬微生物是生產高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的棒狀桿菌屬微生物。
如申請專利範圍第5項所述之微生物，其中該高絲胺酸衍生的L-胺基酸為選自由L-蘇胺酸、L-異白胺酸、O-乙醯基高絲胺酸及L-甲硫胺酸所組成之群組中的至少一種。
如申請專利範圍第4項所述之微生物，其中該棒狀桿菌屬微生物生產L-丙胺酸。
如申請專利範圍第4項所述之微生物，其中該棒狀桿菌屬微生物是麩胺酸棒狀桿菌。
一種製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生之L-胺基酸的方法，包括：在培養基中培養包括經修飾的高絲胺酸脫氫酶的棒狀桿菌屬微生物，其中在SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第285位的胺基酸經異白胺酸取代；第398位的胺基酸經麩醯胺酸取代；或在這兩個位置的胺基酸分別經異白胺酸及麩醯胺酸取代；並從該棒狀桿菌屬微生物或該培養基中回收高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸。
如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該高絲胺酸衍生的L-胺基酸為選自由L-蘇胺酸、L-異白胺酸、O-乙醯基高絲胺酸及L-甲硫胺酸所組成之群組中的至少一種。
一種用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸之組成物，該組成物包括如申請專利範圍第1項所述之經修飾的高絲胺酸脫氫酶或如申請專利範圍第4項所述之微生物。
如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該高絲胺酸衍生的L-胺基酸為選自由L-蘇胺酸、L-異白胺酸、O-乙醯基-L-高絲胺酸及L-甲硫胺酸所組成之群組中的至少一種。
一種提高棒狀桿菌屬微生物生產高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸的能力之方法，包括在具有高絲胺酸脫氫酶活性的SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，用異白胺酸取代第285位的胺基酸；用麩醯胺酸取代第398位的胺基酸；或分別用異白胺酸及麩醯胺酸取代這兩個位置的胺基酸。
如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該高絲胺酸衍生的L-胺基酸為選自由L-蘇胺酸、L-異白胺酸、O-乙醯基-L-高絲胺酸及L-甲硫胺酸所組成之群組中的至少一種。
一種將申請專利範圍第1項所述之經修飾的高絲胺酸脫氫酶用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸之用途。
一種將如申請專利範圍第3項所述之多核苷酸用於製造高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸之用途。
一種將如申請專利範圍第4項所述之棒狀桿菌屬微生物用於生產高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸之用途。